嘧菌酯與甲基硫菌靈在荔枝采后貯藏保鮮中的應用及膳食暴露評估

肖 璐，李曉琴，唐雪妹，朱富偉，王 剛，劉 帥，江薰垣，鄧義才，萬 凱,*

（1.廣東省農業科學院農業質量標準與監測技術研究所，廣東廣州 510640；2.廣東省農產品質量安全風險評估重點實驗室，廣東廣州 510640；3.華中農業大學資源與環境學院，湖北武漢 430070）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是我國嶺南地區的特產水果，素有“嶺南佳果”的美譽，因其具有較高的營養價值和保健功效，深受廣大消費者的喜愛[1]。荔枝成熟于高溫高濕季節，極易發生病蟲害，采后呼吸代謝旺盛，極易發生褐變腐爛，極大地影響了荔枝的食用品質和商業價值[2-4]。荔枝在常溫無包裝下貯藏期僅為1～2 d，短暫的貯藏期和貨架期成為荔枝遠銷和出口的瓶頸。我國荔枝年產量占世界總產量的70%，但每年因荔枝的褐變腐爛問題所造成的損失達年產量的20%以上，極大地影響我國荔枝產業可持續健康發展[5-7]。

化學藥劑處理是一種重要的荔枝采后保鮮方法，可以起很好的殺菌、防腐等作用。而殺菌劑作為化學藥劑的一種，在農藥中使用較為頻繁，具有針對性強、使用簡單方便等優點，不僅可用于預防果實采收前的真菌感染，還能有效預防果實采后處理、貯運以及銷售期間的病菌感染，有效地延長了貯藏期以及貨架期。前期對荔枝生產過程中農藥的使用情況進行調研，發現部分收購商更傾向于收購采前打過藥的荔枝，原因是這種荔枝更利于保存。其中，嘧菌酯和甲基硫菌靈是在農殘監測中發現使用較多的兩種殺菌劑。已有研究報道，常溫下分別使用25%嘧菌酯1500 倍稀釋液與70%甲基硫菌靈600 倍稀釋液浸泡砂糖桔，可以使果實腐爛率降至7%左右，貯藏45 d 后殘留量低于國家標準[8]。段志坤等[9]發現，將1%的甲基硫菌靈與50 mg/L 的防落素進行復配后處理柑橘果實，其保鮮效果明顯提升。嘧菌酯和甲基硫菌靈在獼猴桃采后保鮮中也發揮較好的防腐效果，與其它殺菌劑和保鮮劑相比，采用70%甲基硫菌靈600 倍稀釋液處理獼猴桃的保鮮效果最好，貯藏31 d 后的腐爛率最低[10]。劉清化等[11]發現，采用低濃度的甲基硫菌靈（0.1%）處理檸檬時，可以通過降低果實的失重率從而提高檸檬的保鮮效果，而采用較高濃度的甲基硫菌靈（0.5%）處理檸檬時，果實的失重率和壞果率則顯著增加，保鮮效果較差。章豪等[12]發現在冷藏條件下用甲基硫菌靈處理桃果實可以有效抑制桃表面霉菌的繁殖，且較好地保持了可溶性固形物含量，維持果實的貯藏品質。

荔枝在生產過程中極易發生微生物滋生而引發腐爛，采前和采后進行病菌抑制是提高保鮮效果的重要方式。當前，荔枝采后常用的殺菌劑有麥角甾醇生物合成抑制劑、苯并咪唑、噻菌靈和甲氧基丙烯酸酯等，通過透過果皮的角質層，撲滅初期侵染的酸腐病菌[13-15]，有效延長了荔枝采后貨架期。廣東荔枝主要存在霜疫霉病和炭疽病兩種病害，而殺菌劑嘧菌酯和甲基硫菌靈對這兩種病害均有一定的防治作用，其主要的原理是殺菌劑通過作用于病原菌菌絲的細胞壁來有效殺死病原菌[16-18]。目前關于嘧菌酯和甲基硫菌靈的相關研究主要集中在采前病害的預防與控制[19-23]，在果蔬采后保鮮中的應用相對較少（柑橘、檸檬、桃等），并且在荔枝采后貯藏保鮮中的應用目前尚未有相關報道。本研究探究了常溫條件下不同濃度的嘧菌酯和甲基硫菌靈對荔枝的保鮮效果，并針對貯藏期間荔枝果實中殺菌劑的殘留量進行監測和膳食暴露評估，最終篩選并優化出兼顧保鮮效果、食用安全性以及經濟成本為一體的保鮮劑配方，該研究為荔枝以及其他非呼吸躍變型水果保鮮技術的研發提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晚熟荔枝 品種為‘淮枝’，分別于2022 年7 月18 日、7 月28 日在廣州市從化豐和園果蔬專業合作社采摘，采摘后立即運回實驗室。挑選成熟度基本一致、無病蟲害、無腐爛、無機械損傷且果型大小基本一致的荔枝進行試驗；乙腈、甲醇 色譜純，德國Merck 公司；氯化鈉、無水硫酸鎂 分析純，廣州化學試劑廠；甲酸、甲酸銨 優級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二水合草酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉標準溶液 分析純，深圳市博林達科技有限公司；2,6-二氯靛酚、碳酸氫鈉 分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司；25%嘧菌酯（可濕性粉劑）龍發化工有限公司；70%甲基硫菌靈（懸浮劑）先正達南通作物保護有限公司；PSA 吸附劑（40～60 μm）天津博納艾杰爾科技有限公司。

LCMS-8060 液相色譜質譜聯用儀 日本島津公司；SiO-6512 本立QuEChERs 自動樣品處理系統北京英貝迪科技有限公司；Milli-Q 超純水儀Merk Millipore 公司；FA11002C 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-250DE 數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RX-5000i 數顯臺式折光儀 廣州市愛拓科學儀器有限公司；3051H 果蔬呼吸測定儀 杭州綠博儀器有限公司；DDS-307A 電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；JXFSTPRP-24 全自動樣品快速研磨儀 上海凈信有限公司；5804R 冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；UV-2600 紫外分光光度計 Techcomp 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及處理條件 保鮮劑濃度及配方組合：對照組（去離子水）、25%嘧菌酯1200 倍稀釋液、25%嘧菌酯1600 倍稀釋液、70%甲基硫菌靈500倍稀釋液、70%甲基硫菌靈700 倍稀釋液、25%嘧菌酯1200 倍稀釋液+70%甲基硫菌靈500 倍稀釋液、25%嘧菌酯1200 倍稀釋液+70%甲基硫菌靈700 倍稀釋液、25%嘧菌酯1600 倍稀釋液+70%甲基硫菌靈500 倍稀釋液、25%嘧菌酯1600 倍稀釋液+70%甲基硫菌靈700 倍稀釋液。

采用上述殺菌劑配方將荔枝分別浸泡3 min（參照常用殺菌劑的浸泡時間），以清水浸泡作為對照，瀝干后用PE 保鮮袋挽口包裝（袋內RH80%～90%），于常溫（25 ℃）貯藏，每袋裝65 個果，每組三個重復，在貯藏第0、2、4、6、8 d 的固定時間點對荔枝感官品質和腐爛情況進行評價，篩選出較好的保鮮劑配方，并對保鮮效果進行再次驗證。

1.2.2 腐爛率的測定 腐爛率的測定參照林河通等[24]的方法，略有改動。以果皮表面出現真菌生長、發生腐爛或者褐變面積超過整個果實的1/4 為爛果標準計算腐爛率。

1.2.3 呼吸強度的測定 呼吸強度的測定參考王秋芳等[25]的方法進行測定。將30 個荔枝果實稱重后放于體積為2.5 L 帶有通氣導管的密閉塑料盒中，然后將通氣口與呼吸儀接口連接，打開通氣管，記錄5 min 內每隔1 min 的呼吸強度值，取5 次呼吸強度值的平均值作為呼吸強度。

1.2.4 可滴定酸含量的測定 可滴定酸（TA）含量的測定參考GB 12456-2021[26]，稱取15～20 g 荔枝果肉勻漿至250 mL 燒杯中，加入沸水150 mL，水浴（100 ℃）30 min 后冷卻，定容至250 mL，過濾至錐形瓶。取50 mL 濾液，加入2～3 滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L 的NaOH 標準溶液滴定，出現微紅色且30 s 內不褪色，立即停止滴定并讀數。

式中：C 為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度（mol/L）；V1為滴定試液時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積（mL）；V2為空白試驗時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積（mL）；K 為酸的換算系數；F 為試液的稀釋倍數；m 為試樣的質量或體積（g 或mL）；1000 為換算系數。

1.2.5 可溶性固形物含量的測定 可溶性固形物的測定參照武惠桃[27]的方法。每袋隨機取10 個荔枝果實，取果肉榨汁后用4 層紗布過濾，用折光儀測定濾液可溶性固形物的含量，重復三次，用百分率表示。

1.2.6 VC含量的測定 VC含量的測定參照Zhang等[28]的方法，略有改動。稱取荔枝果肉樣品100 g加入2%草酸100 mL 進行研磨，稱取40 g 樣品加入2%的草酸溶液進行溶解，然后轉移至200 mL 容量瓶中進行定容，過濾備用。吸取濾液10 mL 于三角瓶中，用已標定過的2，6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定至桃紅色且15 s 不褪色為止，記下標準液用量。吸取2%草酸溶液10 mL，用染料作空白滴定記下用量。

式中：V 為滴定樣品所用的染料數（mL）；V1為空白滴定所用的染料（mL）；A 為1 mL 染料溶液相當于抗壞血酸的毫克數；B 為滴定時吸取樣品溶液的毫升數（mL）；b 為樣品液稀釋后的總毫升數（mL）；a 為樣品的重量（g）。

1.2.7 甲基硫菌靈和嘧菌酯殘留量的測定 甲基硫菌靈和嘧菌酯殘留量的測定參考唐雪妹等[29]和黃健祥等[30]的方法，略作修改。對于全果檢測，稱取10 g研磨后的荔枝果皮和果肉勻漿于50 mL 離心管中，加入5 顆陶瓷均質子，然后依次加入20 mL 乙腈、1 g 氯化鈉、4 g 無水硫酸鎂，搖勻，使用振蕩離心一體化裝置先在1000 r/min 下振蕩5 min，于常溫3800 r/min 離心5 min。吸取振蕩離心后的上清液8 mL 于15 mL 離心管中，加入1 g 凈化劑，在800 r/min下振蕩2 min 后在3800 r/min 下離心2 min。吸取1 mL 上清液過0.22 μm 尼龍濾膜。上機檢測殘留量，果肉檢測則單獨稱取果肉部分。

1.2.8 膳食暴露與風險評估 按以下兩公式進行農藥的慢性膳食攝入風險評估。

式中：C 為荔枝中該高風險因子的所有樣品平均檢出值（小于0.001 mg/kg 的忽略不計），F 為每日水果攝入量，評估所用的體重參數bw 采用成年人（Food and agriculture organization of the united nations 2009），ADI 值來源于中國政府發布的GB 2763-2021（MOA 2021）[31]。若RQ＞1，暴露人群有明顯的健康風險；RQ≤1，無顯著健康風險，RQ 越大表明相應的風險越大。

1.3 數據處理

使用SPSS 26.0 進行數據處理與分析，采用單因素分析法進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，采用SigmaPlot 10.0 對數據進行作圖，每個測試指標重復3 次，測定值以3 個重復實驗數據的平均值±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑保鮮效果分析與保鮮配方篩選

常溫貯藏過程中，對照組和殺菌劑處理組的荔枝果實表觀變化情況如圖1 所示。從圖中可以看出，對照組的荔枝果實從貯藏第2 d 開始出現褐變和霉變，而殺菌劑處理組大多在貯藏第6 d 開始出現褐變，在貯藏第8 d 發生霉變。且經對比后發現，M1600 處理組在貯藏第8 d 僅出現少量褐變而無霉變發生，M1600+J700 處理組在貯藏第8 d 少量出現霉變，其余處理組均出現較為嚴重的褐變和霉變。因此，M1600 處理組的保鮮效果好于M1600+J700 處理組，優于其它殺菌劑處理組，優于對照組。

圖1 25 ℃下不同濃度殺菌劑對荔枝果實的保鮮效果Fig.1 Preservation effects of different concentrations of fungicides on litchi fruit at 25 ℃

2.2 優選配方殺菌劑對荔枝貯藏品質的影響

基于以上殺菌劑配方保鮮效果的分析，篩選出保鮮效果較好的M1600 以及M1600+J700 處理組進行實驗驗證。從圖2 可以看出，常溫貯藏第2 d，對照組荔枝果皮有輕微褐變發生，而貯藏至第4 d，荔枝果皮開始發生明顯的褐變和霉變，而兩處理組荔枝果皮僅出現少量褐斑。貯藏至第6 d，對照組腐爛嚴重，出現大量霉斑，M1600 處理組個別出現霉變，而M1600+J700 處理組尚未出現霉變，但褐變情況較單獨使用M1600 處理組褐變情況嚴重。貯藏第8 d，對照組基本全部褐變腐爛，復配殺菌劑處理組發生大面積褐變和部分霉變，但單獨使用M1600 處理組褐變情況明顯輕于復配殺菌劑組。由此可以看出，復配殺菌劑在殺菌效果上比較有優勢，但在抑制果皮褐變方面效果并不顯著。

圖2 25 ℃下兩組殺菌劑對荔枝的保鮮效果Fig.2 Preservation effects of two groups of fungicides on litchi at 25 ℃

2.3 優選配方殺菌劑對荔枝呼吸強度、腐爛率以及電導率的影響

常溫貯藏條件下，對照組、M1600 和M1600+J700 處理組的荔枝果實的呼吸強度、腐爛率以及電導率均隨著貯藏時間的延長而增加（圖3）。荔枝是非呼吸躍變型果實，采后呼吸代謝旺盛。從圖3A 中可以看出，對照組荔枝的呼吸強度隨貯藏時間的延長迅速升高，而兩處理組的荔枝果實呼吸強度自貯藏第2 d 起基本維持在80 mg/kg/h，呼吸強度遠低于對照組（130 mg/kg/h），表明該處理可顯著抑制果實的呼吸強度（P＜0.05），延緩果實采后的衰老劣變。從圖3B 中可以看出，從貯藏第2 d 開始，對照組的腐爛率均明顯高于兩處理組，貯藏第8 d，處理組的腐爛率比對照組降低了約50%。相對電導率，也被稱為膜透性，是衡量荔枝果皮細胞膜衰老程度的重要指標之一。從圖3C 中可以看出在整個貯藏過程中對照組荔枝果皮的相對電導率為直線上升的變化趨勢，而處理組從貯藏第2 d 到第4 d 基本保持相對穩定，從貯藏第6 d 起迅速升高，但整體低于對照組。綜上，在常溫貯藏條件下，殺菌劑處理在一定程度上抑制了荔枝果實的呼吸強度，降低了果實的腐爛率以及果皮相對電導率，保鮮效果明顯優于對照組，但貯藏期間兩處理組的保鮮效果差異并不顯著（P＞0.05）。

圖3 25℃下不同濃度殺菌劑對荔枝呼吸強度、腐爛率以及果皮相對電導率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of fungicides on the respiratory intensity,rotten rate,and relative conductivity of litchi peel at 25 ℃

2.4 優選配方殺菌劑對荔枝果肉TSS、TA 以及VC 含量的影響

可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）是影響荔枝風味的重要因素[32]，而VC是衡量果實營養品質的重要指標。由圖4 可以看出，TSS 和VC含量在貯藏期間均呈逐漸下降的變化趨勢。自貯藏第6 d，對照組荔枝果肉中可溶性固形物含量和VC含量下降迅速，顯著低于兩個殺菌劑處理組（P＜0.05）（圖4A 和圖4C）。各組的荔枝果肉中可滴定酸含量呈先下降后上升的變化趨勢，且對照組的可滴定酸含量從貯藏第6 d 開始迅速升高，顯著高于處理組（P＜0.05）（圖4B），這可能與貯藏后期荔枝果實發生腐爛有關，腐爛的果實中存在大量的微生物，微生物滋生產生腐酸，從而導致對照組的荔枝果肉中可滴定酸含量在貯藏后期有所升高。綜上，殺菌劑處理在一定程度上維持了荔枝果肉可溶性固形物和VC含量，提高了荔枝果實的營養品質和食用價值。

圖4 25 ℃下不同濃度殺菌劑對荔枝果肉可溶性固形物（A）、可滴定酸（B）以及VC（C）含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of fungicides on TSS(A),TA (B) and VC (C) content of litchi pulp at 25 ℃

2.5 貯藏期間殺菌劑殘留量的變化及其膳食暴露評估

GB 2763-2021 中規定嘧菌酯在荔枝上的最大殘留量為0.5 mg/kg[31]，甲基硫菌靈的殘留量為甲基硫菌靈和多菌靈兩種物質，以多菌靈計，其在荔枝上的最大殘留量為0.5 mg/kg。從貯藏第2 d 對兩個殺菌劑處理組荔枝果實的全果和果肉中嘧菌酯和甲基硫菌靈的殘留量進行檢測，如表1 和表2 所示。從表中可以看出，兩個殺菌劑處理組的嘧菌酯和甲基硫菌靈在全果和果肉中的含量隨貯藏時間的延長逐漸降低。其中，單獨使用M1600 處理的荔枝果肉中嘧菌酯的殘留量在整個貯藏期間一直保持較低水平，貯藏第2 d 殘留量為0.069±0.004 mg/kg，M1600+J700處理組的荔枝果肉中嘧菌酯的殘留量為0.081±0.001 mg/kg，甲基硫菌靈在貯藏第2 d 的殘留量為0.295±0.002 mg/kg，均低于殘留量的限量值標準。

表1 M1600 處理組荔枝中嘧菌酯殘留量變化Table 1 Changes of residual amount of azoxystrobin in litchi after treatment with M1600

表2 M1600+J700 處理組荔枝中農藥殘留量變化Table 2 Changes of residual amount of pesticide residues in litchi after treatment with M1600+J700

表3 和表4 分別對兩個處理組的嘧菌酯和甲基硫菌靈在荔枝全果中的膳食暴露進行評估。結果發現，整個貯藏期間各殺菌劑對于普通人群的風險熵值分別為：M1600 處理組中嘧菌酯RQ 值在0.00173～0.00316，遠小于1，M1600+J700 處理組中嘧菌酯RQ 值 在0.00161～0.00253，甲基硫菌靈RQ 值在0.00599～0.01084，同樣均遠小于1，表明二者在荔枝中的殘留量膳食風險較低。加之本研究只取荔枝果肉部分食用，因此，按照推薦劑量食用上述保鮮后的荔枝對人體是安全的。綜合保鮮效果、降低經濟成本以及食用安全性而言，單獨使用M1600 處理荔枝果實可集保鮮品質提升、食用安全性以及降低經濟成本為最佳。

表3 M1600 處理組中嘧菌酯在荔枝全果中的膳食暴露評估Table 3 Dietary exposure assessment of azoxystrobin for litchi in the M1600 treatment group

表4 M1600+J700 處理組中嘧菌酯和甲基硫菌靈在荔枝全果中的膳食暴露評估Table 4 Dietary exposure assessment of azoxystrobin and thiophanate-methyl for litchi in the M1600+J700 treatment group

3 討論與結論

荔枝采后褐變及腐爛的原因除了果皮失水、酶促褐變以及自身呼吸代謝外，還有生長過程中所攜帶的病原菌侵染，而抑制病原菌的生長在很大程度上可延緩荔枝果實褐變和腐爛，從而延長貨架期。荔枝的主要病害包括霜疫霉病、炭疽病、白粉病和煤煙病等，其中，以霜疫霉病和炭疽病最為常見，也是造成荔枝損失最為重要的病害[33-34]。殺菌劑對荔枝病害可以有效地抑制，具有見效快和成本低等優點。

當前，果農所用到的殺菌劑主要有代森錳鋅、苯醚甲環唑、嘧菌酯、異菌脲以及甲基硫菌靈等。其中，嘧菌酯是專門抑制真菌線粒體呼吸的一種抑制劑，通過抑制病菌的呼吸來抑制病菌的侵染[17]。甲基硫菌靈對炭疽病有一定的防治作用，主要是作用于病原菌的菌絲，使細胞壁中毒，從而殺死病原菌[18]。有研究表明嘧菌酯和甲基硫菌靈在獼猴桃保鮮中可以減少果實腐爛，減弱呼吸強度，從而延長獼猴桃的貨架期[10]，且在沙糖桔和桃的貯藏中可減少可滴定酸、可溶性固形物和VC含量的下降[8,12]。在本研究中，常溫貯藏條件下，兩種殺菌劑不僅可以有效抑制荔枝果實的呼吸強度、腐爛率以及相對電導率的升高（P＜0.05），還能在一定程度上起到維持荔枝果肉中TSS 和Vc 等營養物質含量（P＜0.05）。在貯藏后期，與處理組相比，對照組荔枝果肉的可滴定酸含量明顯升高，這主要與對照組果實在貯藏后期出現大范圍腐爛有關，由于腐爛的果實中繁殖出大量的微生物滋生產生腐酸而導致果肉可滴定酸含量的升高[27]。可見，殺菌劑處理顯著提高了荔枝的貯藏品質和食用品質，這表明嘧菌酯和甲基硫菌靈在果實采后貯藏保鮮中可能具有一定的普適性。最后，進一步對兩個殺菌劑處理組的保鮮效果進行對比，發現兩個處理組對荔枝的保鮮效果差異性不明顯，復配殺菌劑在殺菌效果上比較有優勢，但在抑制果皮褐變方面效果并不突出。因此，推測嘧菌酯在荔枝保鮮中可能發揮了更為重要的作用。

殺菌劑用于果蔬采后保鮮效果雖然顯著，但其殘留量也與食用安全性息息相關。本研究對貯藏期間處理組荔枝全果和果肉中的殺菌劑的殘留量進行定時監測，并對荔枝全果進行膳食暴露評估，結果發現雖然兩種殺菌劑在荔枝中的膳食風險較低。全果檢測中，嘧菌酯在貯藏第6 d 降至殘留量標準，而甲基硫菌靈在貯藏第8 d 依舊高于限量值標準，但二者在果肉中的殘留量遠低于限量值標準，且考慮消費者僅食用荔枝的果肉部分，因此，均在安全范圍內。綜上，結合荔枝的貯藏品質、食用安全性以及經濟成本，采用25%嘧菌酯1600 倍稀釋液保鮮荔枝果實較優。

研究前期對荔枝生產過程中農藥的使用進行了大量的調研和篩查，本實驗在荔枝采摘末期進行，此時荔枝果實已經進入后熟階段，果實成熟與貯藏品質的保持息息相關，因此，推測在荔枝采摘成熟度合適（7～8 成）的情況下，其貯藏品質會有進一步提升。根據貯藏期間兩種殺菌劑的代謝規律可以發現，隨貯藏時間的延長，其殘留量也會進一步降低。當前，通過低溫貯藏延長荔枝采后貨架期的研究已經較為成熟，而常溫貯藏條件下提升荔枝的貯藏品質一直是生產上的難題。本研究發現，25%嘧菌酯的1600 倍稀釋液可以延長采后荔枝果實在常溫下貯藏的貨架期，提高了荔枝貯藏品質和食用價值，該研究可以為常溫下荔枝以及其它非呼吸躍變型果蔬采后貯藏品質提升提供一定的理論依據和技術支持，為其經濟價值的提升提供一定的幫助。

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