杜仲EuNPC1-Like基因的分子特征分析

接收日期：2023-10-26

基金項目：

貴州省科技計劃項目（黔科合服企2018-4001-06；黔科合基礎ZK-2023-119）；貴州省研究生科研基金項目（黔教合 2020-079）

*通訊作者：

宋莉（1971—），女，博士，教授，主要從事植物生物技術研究，E-mail：lpsssl@126.com.

摘" 要：

甾醇轉運蛋白在促進植物生長發育、提高逆境脅迫耐受性、降低血漿低密度脂蛋白以及膽固醇等作用中發揮重要作用。杜仲（Eucommia ulmoides）是一種甾醇含量豐富且具有調節血壓等多種功用的名貴中藥材，目前對杜仲甾醇轉運蛋白NPC1及其編碼基因的分子信息還不清楚。本研究根據人類NPC1基因信息進行杜仲EuNPC1-Like基因的發掘和分析鑒定。從杜仲基因組中獲得的EuNPC1-Like基因全長3876 bp，編碼蛋白屬于不穩定疏水性脂溶蛋白；分別含有20個糖基化位點和136個磷酸化位點，是由13個α螺旋組成的跨膜蛋白，主要分布于溶酶體/液泡和細胞膜，具有NPC1_N膽固醇轉運保守結構域，其蛋白三維結構與人類和擬南芥的NPC1相似，含有光、赤霉素、低溫、干旱、厭氧、茉莉酸甲酯響應等順式作用元件，與向日葵、油橄欖、咖啡和樟子松等油脂含量高的植物NPC1蛋白親緣關系較近。網絡藥理學分析表明，NPC1蛋白參與植物甾醇代謝調控，杜仲β-谷甾醇靶向人體脂肪與固醇代謝，與動植物中的甾醇代謝相似。本研究結果為揭示EuNPC1-Like基因功能提供了依據。

關鍵詞：

杜仲；植物甾醇轉運蛋白；EuNPC1基因；生物信息學

中圖分類號：

Q811.4

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）02－0017－10

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.02.003

植物甾醇（phytosterols）又稱植物固醇，是一種天然存在于植物細胞中的三萜類化合物，其種類繁多、功能多樣，以甾醇酯、甾醇糖苷、游離甾醇、酰化甾醇糖苷等形式存在于植物細胞中，是多種甾族化合物、激素及維生素D等生物合成的前體，也是植物細胞膜重要結構物質，在植物生長發育和逆境響應中起著重要的作用［1］。研究表明，菜油甾醇衍生物——油菜素內酯作為一種植物激素，調節細胞伸長和細胞分裂等過程［2］；甾醇激素合成受阻引起植株矮化，葉片顏色深綠，葉柄縮短，花期延遲和頂端優勢減弱等表型［3-4］；固醇合成障礙也會引起花粉敗育、胚致死或缺陷以及幼苗致死的表型［1］；擬南芥突變株中超量表達甾醇合成酶基因SlPSAT1可逆轉早期衰老表型［5］，甾醇合成酶基因 SMT 突變導致擬南芥根的伸長受到抑制［6］；伴隨著植株菜油甾醇和其下游的油菜素內酯的含量下降，擬南芥植株出現短小、葉色改變和繁殖能力下降等一系列表型［7］，而過表達類固醇羥化酶基因 DWF4可使擬南芥植株生長得到促進［8］。大量的研究也表明植物甾醇與植物的應激反應相關，參與植物非生物和生物脅迫反應［2］。植物甾醇可能通過誘導ABA積累［9］、泛素化信號途徑［10］、細胞壁成分合成［11］以及限制遷移［12］等途徑參與植物抗冷、抗鹽、重金屬耐受等逆境響應調控。研究發現，冷脅迫和干旱脅迫處理會引起擬南芥中甾醇糖苷和酰基甾醇糖苷的含量增加［13］；在干旱脅迫條件下，水稻中的磷脂甾醇酰基轉移酶基因 OsPSAT 出現表達上調［14］。甾醇合成酶基因 SMT 突變的擬南芥植株，其晚期防御反應受到抑制［6］。

植物甾醇多存在于植物油、堅果、谷物中，其中，植物油是甾醇含量最高的食物，是人類植物甾醇獲得的最主要途徑之一［15］。甾醇含量與油脂含量成正相關，可占到總油的0.4%［16］。植物甾醇的結構和活性類似于人類和動物的膽固醇，具有降血脂、降膽固醇和治療心血管疾病等生理功效［1，17-21］。植物甾醇的藥理作用與其和膽固醇之間形成腸道競爭結合有關［22-24］。此外，植物甾醇也可通過與人體脂肪酸、葡萄糖、磷脂等底物反應產生與膽固醇衍生物類似的生物活性物質，進而降低膽固醇吸收和加強脂肪分解代謝，緩解疾病發展［16］。

轉運蛋白在植物體甾醇和人體膽固醇的利用中均起到十分重要的作用。植物中的研究表明，受體及其介導的內吞作用和液泡運輸參與甾醇對植物逆境脅迫響應的進程以及生長發育調控［25］。轉運蛋白是定位在細胞質膜和細胞器膜上的跨膜蛋白，是細胞內外物質轉運和信息交換的結構基礎。膽固醇（cholesterol）又稱膽甾醇，與細胞結構和功能穩定性以及疾病密切相關［26-30］。Niemann-Pick C1（NPC1）跨膜蛋白是膽固醇運輸的關鍵物質［31-32］，其編碼基因NPC1突變直接導致細胞溶酶體內游離膽固醇積聚［33］。NPC1是一種具有13個跨膜α螺旋（TM）和3個管腔結構域的跨膜蛋白［34］，參與低密度脂蛋白膽固醇酯到溶酶體、內質網或其他細胞器的運輸［35-37］和甾醇的代謝及吸收過程［38］。其它轉運蛋白如多種ABC轉運蛋白家族成員也參與了植物甾醇從腸上皮細胞到腸腔的轉運［39］。在植物中已經發現近 300 種植物甾醇的存在［40］，主要包括豆甾醇、菜籽甾醇、谷甾烷醇和相應的烷醇等［1，16］，在豬苓［41］、半夏［42］、香附［43］、山藥［44］、金線蓮［45］、銀柴胡［46］等中藥材中也檢測到不同含量的植物甾醇。目前對植物甾醇轉運蛋白的關注還較少，甾醇轉運蛋白的發掘是揭示其生物學功能的關鍵，這或許有助于回答中藥材降血脂和降膽固醇的機制［20］。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）是我國特有的單科單屬單種第三紀孑遺樹種和傳統中藥材之一，含有β-谷甾醇、胡蘿卜苷、foliasalacioside E2 等甾類化合物及其其它多種生物活性物質，其根系發達，抗逆性強，對環境條件要求低，適應性廣［47］，還具有調節血脂代謝、降血漿膽固醇、提高免疫力、清除自由基等多種功能［48-56］。韓軍花等［57］通過對50種常見食用植物藥材及中草藥植物的甾醇含量進行研究發現，杜仲與女貞子、火麻仁、沙苑子、骨碎補、紫蘇子、車前子等植物含有較高量的甾醇。杜仲高含量甾醇與其發育調節、抗逆調節及藥理活性之間的關系尚不明晰。論文利用生物信息學分析方法，對杜仲甾醇轉運蛋白EuNPC1-Like進行分析及功能預測，以為進一步揭示杜仲植物調控和降脂降膽固醇活性機制，以及EuNPC1-Like基因功能鑒定提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料來源

杜仲EuNPC1-Like基因及蛋白質序列來源于國家基因組科學數據中心（http：//bigd.big.ac.cn/about）。

1.2" 方法

通過Expasy軟件對蛋白質的理化性質（https：//web.expasy.org/protparam/）及其親疏水性（https：//web.expasy.org/protscale/）進行預測；利用丹麥技術大學生物信息分析中心分別進行磷酸化（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、糖基化（http：//www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）、跨膜結構（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）信號肽結構（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、亞細胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預測；通過Pfam數據庫對EuNPC1-Like蛋白結構域進行分析；通過在線SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_mlrc.html）預測蛋白質二級結構；利用SWISS-MODE （https：// swissmodel.expasy.org/） 在線分析工具預測杜仲NPC1蛋白三級結構；通過PlantCARE在線網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測杜仲EuNPC1-Like基因上游2000 bp存在的順式作用元件，利用TBtools軟件進行可視化；利用Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對不同物種的NPC1蛋白序列結構，選取同源性較高的50條植物NPC1蛋白，通過MEGA11軟件構建系統進化樹，發育樹構建采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），Bootstrap值為1000；利用TCMSP數據庫（https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分析杜仲的活性成分，口服利用率大于等于30%，類藥性大于等于0.18；SwissTargetPrediction網站（http：//swisstargetprediction.ch/）預測可能存在的靶向基因，Probability大于0.1；STRING網站（https：//cn.string-db.org/）進行蛋白互作分析；運用Cytoscape作圖軟件進行可視化，進行網絡藥理學分析。

2" 結果與分析

2.1" 杜仲EuNPC1-Like理化特性

通過對杜仲EuNPC1-Like的理化性質分析發現，該基因全長3876 bp，編碼1291個氨基酸，各氨基酸占比不同（圖1-a），Leu占比最多為11.0%，Trp占比最少為0.8%。EuNPC1的相對分子質量為141.60 kDa，等電點為6.93，脂肪指數為96.49，親水性平均值為0.253，不穩定指數（II）為45.60，為不穩定脂溶蛋白。進一步對EuNPC1-Like蛋白質的親疏水性分析，在第578個氨基酸位置的時候擁有最小值-2.989，在1151個氨基酸位置時有最大值3.644，親水性平均值為0.253（圖1-b）。磷酸化位點預測顯示，EuNPC1蛋白磷酸化位點有136 個，其中Ser 92 個、Thr 30 個、Tyr 14 個（圖1-c）。O-β-葡萄糖基化位點預測表明，有20個O-β-葡萄糖基化位點，Ser 15 個，Thr 5 個（圖1-d）。

2.2" 杜仲EuNPC1-Like蛋白信號肽、跨膜結構、亞細胞定位

對杜仲EuNPC1-Like蛋白的mean S最大分值進行分析，其分值為0.600（圖1-e）。跨膜結構預測顯示EuNPC1蛋白質含有14個跨膜螺旋（圖1-f），且含有信號肽結構，第一個跨膜螺旋可能屬于信號肽，而該跨膜蛋白實際上由13個跨膜螺旋組成，與人類的NPC1蛋白一致。對EuNPC1-Like蛋白質亞細胞定位預測表明，其分布于溶酶體/液泡和細胞膜的可能性約占94.9%（圖1-g）。

2.3" 杜仲EuNPC1-Like蛋白保守基序

通過Pfam數據庫對EuNPC1-Like蛋白進行結構域分析顯示，EuNPC1-Like蛋白具有膽固醇轉運和跨膜信號傳遞的保守基序。EuNPC1-Like蛋白由1個明顯的NPC1_N保守結構域（Pfam登錄號：PF16，464）和2個Patched結合結構域（Pfam登錄號：PF2，460）組成（圖2-a）。

2.4" 杜仲EuNPC1-Like蛋白二、三級結構分析

利用SOPMA軟件和SWISS-MODE在線軟件預測EuNPC1-Like蛋白質二級結構和三級結構結果表明，該蛋白質含有α-螺旋（39.43%）、β-轉角（3.56%）、延伸鏈（16.73%）、無規卷曲結構（40.28%）（圖2-b），并且以無規卷曲及α-螺旋這兩種結構為主。并對比擬南芥的NPC1和人類NPC1蛋白結構表明，杜仲EuNPC1-Like蛋白與擬南芥的NPC1蛋白和人類NPC1蛋白結構相似，都以無規則卷曲和α-螺旋為主（圖2-c），因此該三維結構基本可視為生物NPC1蛋白的三維結構。

2.5" 杜仲EuNPC1基因順式作用元件

利用TBtools軟件從杜仲數據庫中提取杜仲EuNPC1-Like基因上游2000 bp序列，通過PlantCARE在線網站分析順式作用元件，TBtools進行可視化。結果顯示，杜仲EuNPC1-Like基因順式作用元件主要包括參與轉錄起始核心啟動子元件TATA-box，啟動子和增強子區的常見順式作用元件CAAT-box，發育相關光響應元件Box-4、I-box、GA-motif，赤霉素響應元件TATC-box，低溫響應元件LTR，干旱響應元件MBS，厭氧誘導所必需的順式調節元件ARE，茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）等（圖2-d）。

2.6" 杜仲EuNPC1蛋白系統發育樹

為了進一步探討杜仲EuNPC1-Like基因的信息和功能，我們將杜仲EuNPC1-Like蛋白的氨基酸序列與NCBI 數據庫中的植物同源序列進行比對，選取同源性較高的50條植物NPC1蛋白，利用MEGA11構建系統發育樹分析。結果表明，植物中廣泛存在杜仲EuNPC1-Like的同源蛋白，其與向日葵（KAJ781，641.1）、油橄欖（CAA3，010，182.1）、咖啡（XP_2，714，841）和樟子松（XP_22，850，654.1）等親緣關系最近（圖2-e）。

2.7" 杜仲β-谷甾醇與NPC1蛋白的關系

在TCMSP數據庫中根據口服吸收率和類藥性指標篩選出28種杜仲活性成分，以其中的β-谷甾醇為分析對象，進行網絡藥理學分析尋找其潛在靶向基因，分析發現轉運蛋白和代謝關鍵酶兩類基因組成了β-谷甾醇的調控網絡。靶基因中，有屬于NPC1家族成員的NPC1； 植物甾醇合成前期的法尼基焦磷酸的合成MVA途徑中的限速酶HMGCR基因；甾醇調節元件結合轉錄因子SREBF2基因；參與β-谷甾醇調控的細胞色素P450超家族CYP19A1、CYP17A1基因；膽固醇和植物甾醇合成關鍵酶角鯊烯環氧酶SQLE基因。

3" 討論與結論

甾醇是存在于植物中的膽固醇結構與功能類似物，杜仲是一種甾醇含量豐富的藥用植物，運用生物信息學分析技術對杜仲甾醇轉運蛋白EuNPC1-Like的基本特征分析發現，其編碼基因EuNPC1-Like的開放閱讀框全長3876 bp，編碼由1291個氨基酸組成的相對分子質量為141.60 kDa的蛋白，分子量略大于人類NPC1蛋白（含1278個氨基酸）。分析發現EuNPC1-Like蛋白等電點為6.93，脂肪指數為96.49，親水性平均值為0.253，不穩定指數（II）為45.60，這表明EuNPC1-Like蛋白為不穩定的疏水性脂溶蛋白，這與參與游離膽固醇轉運的人類及動物的NPC1親脂疏水性蛋白一致。

質膜蛋白磷酸化是細胞信號轉導的關鍵［58］，植物甾醇通過信號途徑參與發育及逆境響應調控，人體中的NPC1蛋白主要位于晚期內體和溶酶體膜上，其較多的糖基化位點是為了保護自身免受內體和溶酶體中蛋白酶的降解作用［59］，我們的研究表明EuNPC1-Like蛋白含有136 個磷酸化位點和20個O-β-葡萄糖基化位點，含有信號肽，亞細胞定位預測主要分布于溶酶體/液泡和細胞膜。可見，磷酸化和糖基化修飾對EuNPC1-Like蛋白在細胞特定區域的物質轉運或信息傳遞生物學功能非常重要。杜仲EuNPC1-Like蛋白含有13個α跨膜螺旋，存在一個保守的五跨膜螺旋（TM）束，該結構屬于固醇傳感域（SSD）結構，與固醇的運輸、合成和信號轉導等有關［34］。α跨膜螺旋是跨膜蛋白的主要結構形式，人類NPC1轉運蛋白具有13個跨膜螺旋相一致，這表明杜仲EuNPC1-Like在植物細胞中可能與脂類等物質的跨膜轉運和合成代謝有關，且其跨膜方式和作用形式可能與NPC1蛋白一致。

通過 Pfam 數據庫對杜仲EuNPC1-Like蛋白進行搜索，發現其具有一個典型的NPC1_N保守功能域和2個Patched結構域，其中，NPC1_N結構是介導膽固醇轉運的基本基序［60-61］，Patched蛋白結合域能與其它蛋白質結合完成刺激信號傳遞［62］。推測EuNPC1-Like蛋白在植物中的功能除了參與脂類物質轉運外，還具有其它較為廣泛的生物學活性。杜仲EuNPC1-Like蛋白主要由無規卷曲及α-螺旋構成二級和三級結構，較多的α-螺旋結構可能與維持其13次跨膜結構有關，較多的無規卷曲則可能參與管腔結構形成。EuNPC1-Like蛋白與人類和擬南芥的NPC1蛋白三維結構相似，植物與人類的NPC1蛋白可能具有相似的生物學功能。

對杜仲EuNPC1-Like基因的順式作用元件分析表明，該基因除了具有轉錄起始核心啟動子元件外，還具有發育相關光響應元件Box-4、I-box、GA-motif以及赤霉素響應元件TATC-box，還含有低溫響應元件LTR，干旱響應元件MBS，厭氧調節元件ARE，茉莉酸甲酯響應元件TGACG-motif、CGTCA-motif等非生物及生物脅迫響應元件。植物甾醇及其衍生物參與調節細胞伸長、細胞分裂、繁殖能力、花期、頂端優勢、葉片顏色、細胞壁形成，以及葉柄、根系及胚胎等發育過程［1-7，11］，EuNPC1-Like基因存在的發育相關元件及激素響應元件表明，該基因可能廣泛參與了植物的各種生長和發育過程。杜仲是僅存于我國的第三紀孑遺植物，抗逆性極強，在杜仲中已經發現了冷應答基因EuABCF1、抗旱基因EuDREB2A、EuWRKY19、EuXET，以及生物脅迫響應基因EuAFP1.2等。王磊等［63］發現，在不同環境條件下調節膜脂組成是植物逆境適應的重要組成部分［64］，甾醇作為膜組成成分之一，在抗冷、抗鹽、重金屬耐受等逆境響應以及防御反應等調控中發揮著重要作用［6，9-12］。我們的分析發現，杜仲EuNPC1-Like基因的順式作用元件中含有低溫、干旱、厭氧以及茉莉酸甲酯等非生物及生物脅迫響應元件，可以推測，EuNPC1-Like蛋白在杜仲抗逆性調節中可能扮演了重要的角色。

對杜仲EuNPC1-Like蛋白及其同源蛋白序列構建系統發育樹，分析表明杜仲EuNPC1-Like蛋白與向日葵（KAJ781，641.1）、油橄欖（CAA3，010，182.1）、咖啡（XP_2，714，841）和樟子松（XP_22，850，654.1）等親緣關系最近。植物甾醇與植物油脂含量成正相關，可占到總油的0.4%［16］，向日葵、油橄欖、咖啡、樟子松的種子中含有大量油脂以及植物甾醇，因此，它們的NPC1和富含植物甾醇的杜仲EuNPC1-Like聚在一起，EuNPC1-Like蛋白與植物油脂的關系密切。

對杜仲活性成分β-谷甾醇進行網絡藥理學分析發現，β-谷甾醇的潛在靶向基因均與脂質轉運及代謝相關。靶基因既含有NPC1運輸蛋白家族成員NPC1L1基因，固醇調節元件結合轉錄因子SREBF2基因，又含有植物甾醇合成及調控相關的HMGCR、 CYP19A1、CYP17A1和SQLE。NPC1L1蛋白通過腸道膜囊泡內吞作用過程幫助膽固醇的吸收［65］；HMGCR基因廣泛存在于動物固醇和植物甾醇合成中，是植物甾醇合成前期MVA途徑中的關鍵限速酶基因［22，66］；SREBF2轉錄因子在人類肝臟脂肪與固醇代謝過程中發揮調控作用［67］；細胞色素P450家族成員CYP19A1、CYP17A1基因參與了β-谷甾醇的調控，催化類固醇和促進內源性性激素合成［68，69］，植物細胞中屬于細胞色素P450超家族的CYP酶在三萜皂苷等多樣化代謝中扮演著關鍵作用［70］；角鯊烯環氧酶SQLE基因是膽固醇合成中重要的基因，其影響甾醇調節元件結合蛋白 2/HMGCR/SQLE/羊毛甾醇合成酶途徑，進而擾亂膽固醇合成［71］，角鯊烯環氧酶SQE也同時存在于植物甾醇的合成過程中［22］。可見，NPC1運輸蛋白參與了植物β-谷甾醇的合成調控，杜仲β-谷甾醇靶向人體脂肪與固醇的代謝利用，在植物和人體或動物體內，甾醇存在相似的代謝途徑。我們的研究表明EuNPC1-Like蛋白可能是杜仲降血脂降膽固醇的藥理活性靶向之一。

（責任編輯：段麗麗）

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Analysis of Molecular Characterization of EuNPC1-Like Gene in Eucommia ulmoides

Li Minxue1，Wang Yifan2，Huang Youwen2，Song Li2*

（1.Agricultural and Rural Bureau，Shuicheng District，Liupanshui 553040，Guizhou，China;2.College of Life Sciences/Institute of Agricultural Bioengineering/Key Laboratory of Mountain Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation/Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory of AgroBioengineering，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Abstract：

Sterol transporters are known to have a significant impact on various aspects of plant physiology，including growth and development，stress tolerance，and the regulation of plasma low density lipoprotein and cholesterol levels in the human body.Eucommia ulmoides，a Chinese medicinal material renowned for its sterol content，has various health benefits such as regulating blood pressure.However，little is known about the molecular characteristics of the sterol transporter NPC1 and its corresponding gene in E.ulmoides. In this study，the EuNPC1-Like gene of Eucommia ulmoides was identified，analyzed，and characterized using knowledge from the human NPC1 gene.The results showed that the EuNPC1-Like protein had a total length of 3876 base pairs and was characterized as an unstable hydrophobic lipid soluble protein.This protein possessed 20 glycosylation sites and 136 phosphorylation sites.It was a transmembrane protein consisting of 13 α helices，primarily localized in lysosomes/vacuoles and cell membranes.Furthermore，it contained a conserved cholesterol transport domain known as NPC1_N，which exhibited a three-dimensional structure similar to that of NPC1 protein in humans and Arabidopsis.Additionally，the protein contains cis-acting elements that responded to various stimuli such as light，gibberellin，low temperature，drought，anaerobic conditions，and methyl jasmonate.The NPC1 protein was closely associated with high oil content plants such as sunflower，olive，coffee，and pinus camphoris.Network pharmacological analysis suggested that the NPC1 protein played a role in regulating phytosterol metabolism.Additionally，Eucommia β-sitosterol targeted human fat and sterol metabolism，which was similar to sterol metabolism in plants and animals.This study provides a basis for further understanding the function of the EuNPC1-Like gene.

Keywords：

Eucommia ulmoides; phytosterol transporter; EuNPC1 gene; bioinformatics