植物組織培養褐化現象的發生及防治措施

接收日期：2023-03-12

基金項目：無

*通訊作者：尤小婷（1992—），女，學士，農藝師，主要從事種苗繁育、作物栽培和推廣研究，E-mail：867333795@qq.com.

摘" 要：

褐化是影響植物組織培養最突出的問題，其嚴重影響培養物的生長和分化，甚至造成植物死亡。國內外褐化研究結果顯示，褐化發生機制主要是酚類物質積累和氧化引起的氧化褐化，影響因素主要有植物品種和基因型、外植體的生理條件、培養環境、消毒方法及其他組培操作手段等，基于發生機制和影響因素提出的防治措施是選擇不易發生褐化的外植體材料、優化培養基成分和培養條件、添加添加劑抑制或減輕褐化程度等。目前關于褐化發生機制的研究尚不能完全解釋氧化褐化，褐化防治措施可以一定程度上控制褐化現象，但可能會對組培其他指標存在不利影響，實踐中應根據實際情況篩選控制褐化的方法。

關鍵詞：

組培；褐化；發生機制；影響因素；防治措施

中圖分類號：Q943.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）02－0034－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.02.005

植物組織培養在保存種質資源、克服雜交不親和、單倍體育種、基因工程及快速繁殖等方面具有重要意義，被廣泛用于農業育種及生產過程中［1］。褐化是植物組織培養中的三大不利問題之一，且發生機制和影響條件復雜，最常見，但最難解決，主要發生在外植體的初代培養時期，其他時期也常發生，容易導致自身長勢不佳甚至死亡。多項研究顯示，褐化會導致植物組織細胞形態結構發生變化，如失綠變色、淀粉粒增多、細胞壁增厚、纖維質結構增加、愈傷組織細胞排列混亂、細胞膜通透性增加、葉片維管束被堵塞等，嚴重影響組織培養［2-5］。掌握褐化現象的發生機制和影響因素，對解決褐化現象具有重要指導意義。實踐中褐化現象防治備受關注，本文綜述了褐化現象發生的機制、影響因素和防治措施，為解決褐化現象提供參考途徑。

1" 植物組織培養褐化現象發生的機制

一般認為植物組織培養褐化主要是氧化褐化（Oxidative Browning），由酚類物質積累和氧化引起，其中損傷和脅迫是主要的影響因素［6］。參與氧化褐化主要的酶有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）。酚類化合物屬于植物次生代謝物，根據結構分為酚酸類、黃酮類、1，2-二苯乙烯和木酚素類，其合成途徑有苯丙氨酸合成途徑和莽草酸合成途徑，其中苯丙氨酸合成途徑是高等植物中酚類物質合成最主要的途徑，苯丙氨酸解氨酶（PAL）是該途徑中最為重要的限速酶。脅迫主要由于細胞受培養環境或其他不利因素（例如干旱、水分、輻射和受害表面的病原體感染等）影響植物中酚類的濃度，進而影響褐化［7-8］。目前關于機械損傷和切傷脅迫研究認為，損傷能增加細胞膜的通透性，產生脅迫反應并誘導細胞產生防御保護，或者切傷信號能轉導到未切傷組織，誘導酚類物質合成，促進褐化［9-11］。

2" 影響褐化的因素

影響植物組培褐化的因素主要有植物品種和基因型、外植體的生理條件、培養基成分及濃度、培養環境條件等。除此之外，外植體消毒方法、材料大小、切面及與組織塊的比例、增殖繼代年齡等均是影響褐化的因素。主要分成外植體內在因素和培養條件等外在因素。總的來說，影響褐化的根本原因是酚類化合物在組織和培養基中的積累和隨后的氧化［6］。

2.1" 外植體內在因素

2.1.1" 植物的品種和基因型

不同品種的植物，褐化發生的頻率和程度存在差異，因為不同的基因指導植物體內物質的合成和表達等存在差異，這在油松（Pinus tabuliformis Carrière）、大花蕙蘭（Cymbidium hybrid）和胡桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）等植物的褐化研究中均有顯示［12-14］。色素含量或單寧含量較高的植物更容易產生褐化，因為酚類的糖苷化合物的主要成分是木質素、色素和單寧的合成體［15］。一般木本植物、（亞）熱帶植物、藥用植物在組織培養過程中更容易發生褐化現象。

2.1.2" 外植體的生理條件

外植體的生理條件受外植體年齡、取材部位、取材時間、來源地（不同生長環境）等因素影響，主要是不同生理條件下外植體的發育程度、木質化程度與酚類物質的含量和活性存在差異，影響褐化率。大多數情況下，成齡材料比幼齡材料更容易褐化，因為隨著年齡的增加，組織內的酚類物質等含量越高，褐化率越高［16］。外植體不同生長環境和不同取材時間，植物體內的物質含量存在差異，且組織分生能力有差異，影響褐化程度。伊朗無核小擘當年生枝條比一、二年生枝條外植體培養褐化率低［17］。紅金銀花（Lonicera japonica Thunb.）外植體褐化率隨著年齡的增加而增加，褐變現象發生率以頂芽最低，接著分別是未木質化嫩莖、半木質化嫩莖，最后是木質化幼莖［18］。而十里香茶（Camellia sinensis cv. Kunming Shilixiang）離體培養中，輕微木質化葉芽外植體褐化率遠遠低于完全幼嫩腋芽外植體，因為完全幼嫩的腋芽在消毒階段被損傷導致褐變［19］。刺梨（Rosa roxburghii）葉片外植體誘導愈傷組織試驗顯示，春季取材褐化率顯著低于夏季、秋季和冬季，這可能與春季植物生長旺盛有關［20］。Pirttila［21］對分別來源于奧盧（南方）和索丹基拉（北方）的歐洲赤松（Pinus sylvestris L.）母株樹取下的外植體組培研究結果表明，來源于奧盧的外植體培養褐化率明顯很低，因為奧盧地理位置更靠南，外植體愈傷組織中葉綠素含量更高。

2.2" 培養條件等外在因素

2.2.1" 培養基成分及濃度

培養基成分中無機鹽、碳源、生長調節劑的種類和濃度等，均是影響褐化的因素。高濃度無機鹽會使酚類物質大量產生，加重褐化現象。內源性細胞分裂素過度生成會導致酚類化合物的過度積累、過氧化物酶活性增加和木質素含量中等偏高［22］。外源細胞分裂素6-芐基腺嘌呤（6-benzyl adenine，6-BA）和激動素（kinetin，KT）會促進酚類物質合成和PPO的活性，使褐化程度加劇；而植物生長素吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）和二氯苯氧乙酸（2，4-Dicholrophenoxyacetic acid，2，4-D）對酚類化合物的合成有一定抑制作用，可以減弱褐化程度［15］。高濃度蔗糖能刺激酶活性，加劇褐化，且不同的蔗糖濃度導致細胞處于不同的滲透壓環境中，滲透壓過高會使細胞處于高滲失水，細胞膜通透性增加，引起酚類化合物外泄，加劇褐化［23］。培養中添加葡萄糖和果糖能夠降低紅豆杉（TTaxus chinensis （Pilger） Rehd.）的愈傷褐化率，說明褐化率與培養基中糖的種類也有關［24］。

2.2.2" 培養條件

培養條件受培養基狀態、pH值、培養光照和溫度等影響。培養基的狀態影響外植體溢出物的擴散速度，液體和半固體培養基中凝膠含量低，溢出物擴散快、濃度低，褐化率低；pH值對酚類物質和酶的結合產生影響，可在一定范圍內降低pH值從而降低褐化率［15］。光照影響酚類化合物的合成和氧化過程，有一部分酶系統活性是受光誘導的，降低光照強度可以達到降低外植體褐化程度的目的［25］。溫度會影響酶系統的活性，且在酶促反應中起催化作用。李樹麗［26］在中華紅葉楊（Populus ‘Zhonghua Hongye’）的研究中發現，瓊脂5.0～6.5 g/L時，濃度越高，培養基越硬，褐化率越低；pH 5.0～6.5時，pH值越低，褐化率越低。雷攀登等［27］在茶樹（C. sinensis）的褐化研究中表明培養溫度15 ℃時褐化率顯著高于10 ℃培養。另外，在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite Rchb. F.）的培養中，顯示隨著光照的加強褐化變重［28］。陳雪梅等［29］對落羽杉（Taxodium distichum （L.） Rich.）的防褐化研究結果顯示，黑暗培養能有效降低落羽杉組培褐化率。黑暗培養褐化率分別與PPO活性、總酚含量呈統計學意義上的正相關關系。

2.2.3" 消毒方法

消毒劑處理會讓外植體的正常細胞結構受到損害而引發褐化，且受傷害程度越大褐化程度越嚴重［30］。不同消毒劑種類、濃度和消毒時間均會影響外植體褐化，濃度越高、消毒時間越久，褐化程度越高。研究顯示，利用升汞對費約果（Feijoa sellowiana Berg.）外植體進行不同時間消毒處理，處理時間越長，褐化越嚴重[31]。利用乙醇、次氯酸鈉和升汞不同組合對川貝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）外植體進行不同時間的消毒處理，褐化率差異顯著，表現為所有消毒劑均能加重外植體褐化，且滅菌時間延長，褐化率和褐化程度明顯增強［32］。

2.3" 影響褐化的其他因素

切傷、材料大小、材料切面大小、增殖繼代年齡、接種密度、傳代培養周期、培養瓶內的氣體等也是影響褐化的因素。馮代弟［33］對寶蓮燈（Medinilla magnifica Lindl.）的切傷觀察結果表明，寶蓮燈葉片切傷后，葉片柵欄組織有大量鞣質積累，是導致褐化的主要原因。外植體的切口越大，酚類物質與氧氣接觸的表面積就越大，褐化率就越高。小的材料較大的材料褐化率高，切面大或與體積比例大的材料褐化更嚴重［34］。蝴蝶蘭（P. aphrodite）類原球莖團塊作為外植體材料，隨著團塊增大，褐化率降低［35］。油松（P.tabuliformis）愈傷組織褐化率隨瓶內接種塊數的上升而上升，愈傷越少褐化率越低，另外褐化率也隨著增殖繼代年齡的上升而上升［12］。傳代培養周期間隔過長容易使褐化物質積累，導致褐化加劇。此外，褐化情況也受培養瓶內氣體的影響，封閉環境內的乙烯和二氧化碳的積累容易加重褐化［34］。

3" 防止褐化的辦法

控制褐變的方法主要從控制酚類底物、酚氧化酶和氧氣等方面入手，途徑包括鈍化酚酶的活性、改變酚酶作用的條件和隔絕氧氣的接觸等。實踐中，一般通過選擇合適的外植體、培養基、培養條件，或者添加添加劑抑制或促進組織塊或培養基中多酚物質的氧化，影響組織褐變的程度。

3.1" 選擇合適的外植體

選擇不容易發生褐化的品種、長勢旺盛且無損傷的個體上分生能力強的組織作為外植體材料。切取外植體時應盡量減少切口面積并使切口平整。另外選擇合適大小的外植體也是減輕褐化現象的辦法。小規格材料更容易褐化，而過大規格浪費材料、增加成本。

3.2" 選擇合適的培養基

合適的培養基類型、低濃度的無機鹽、合適的生長調節劑種類和濃度、不同種類和低濃度碳源、一定范圍內提高植物凝膠濃度都是降低褐化的手段。培養基類型對褐化發生現象影響從輕到重的順序分別是：紙橋培養基、液體培養基、半固體培養基、固體培養基，紙橋培養基可以隔離部分引起褐化的物質［19］。固體培養基中，一定范圍內提高植物凝膠含量、提高培養基硬度可以降低褐化率。在組織培養過程中選擇大量減半的培養基，降低無機鹽濃度，可以在一定程度上減輕褐化現象，降低褐化率。培養基的成分影響褐化率，不同植物培養基MS、DKW和NRM顯著影響榛子愈傷組織褐化率［36］。掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu）外植體莖段培養，1/2 MS培養基和1/4 MS培養基培養褐化率遠遠低于MS培養基和WPM培養基［37］。培養基中添加NAA和ZT可以降低佛手（Citrus medica L. var.sarcodactylis Swingle）的組培褐化率［38］。糖濃度和種類對褐化率有影響，蔗糖濃度升高，褐化率隨之上升，葡萄糖和麥芽糖作為碳源褐化率顯著低于蔗糖，但會影響增值率［11-12，39］。因此根據不同植物選擇平衡好褐化率和其他組培指標才能達到效益最大化。

3.3" 優化培養條件

一般通過降低溫度、降低光強、調節pH值來適應外植體的培養，降低褐化率。光照和溫度會刺激酚類物質合成和氧化酶的活性加速褐化，降低光照和培養溫度能鈍化酶的活性進而降低外植體褐化。前人對掌葉覆盆子（R. chingii）和落羽杉（T. distichum）的組培褐化研究均顯示，一定時間的暗培養處理能降低褐化現象，且隨著暗培養時間延長，褐化率呈現先上升后下降的趨勢［29，36］。在蝴蝶蘭（P. aphrodite）組培研究中顯示，隨著溫度的升高，外植體的褐化率也隨之增高［40］。因此，合理的控制光照、溫度和處理時間能降低褐化現象。除此之外，調節pH值也是控制褐化的常見方法。多數酚酶的最適pH為6～7，pHlt;3.0 基本失活，合理范圍內降低pH值可以抑制褐變。

3.4" 預處理控制褐化

預處理包括流水沖洗、低溫處理、遮光處理等。將容易發生褐變的材料放在流水下沖洗，后放在低溫下處理一定的時間，再接種到培養基中，使酚類物質釋放在預處理培養基里再更換培養基，防止酚類物質積累過多，有效降低褐變。母株低溫處理可抑制酚類物質的合成，降低PPO活性，進而降低褐化程度［16］。在菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）、冬油菜（Brassica campestris L.）等研究中均有顯示母株低溫處理，褐化率比對照低［41-42］。另外，對母株先進行一段時間遮光處理再取材，可以有效控制褐變。何松林［43］對牡丹（P. suffruticosa）母株葉柄遮光處理30 d取材，結果顯示褐化程度顯著低于自然光照下的母株葉柄。

3.5" 合理的添加劑

合理選擇添加物的種類和濃度能降低褐化。常用的添加劑有抗氧化劑、吸附劑和螯合劑。抗氧化劑是影響酚類化合物的氧化反應，組培上常用的抗氧化劑有抗壞血酸（Vc）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、檸檬酸、半胱氨酸、植酸、蘋果酸等。吸附劑通過吸收培養基內的酚類物質等來降低參與褐化的物質濃度達到減輕褐化的目的，吸附劑有活性炭（AC）、聚丙乙烯吡咯烷酮（PVP）等。螯合劑與多酚氧化酶類物質進行鰲合，減少酚的氧化作用，目前用于褐變防治有乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）。但可能存在添加劑降低褐化率的同時卻抑制外植體生長等矛盾現象，例如豆科牧草和水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）的組培研究中顯示不同濃度或時間抗褐化劑處理外植加劇褐化但促進體胚發生率或者降低褐化率但體胚發生率降低的現象［44-45］。因此根據不同情況選擇合適種類和濃度的抗褐化劑處理才能達到效益最大化。

除此之外，國外還報道了通過添加苯丙氨酸解氨酶（PAL）競爭性抑制劑，抑制苯丙氨酸合成，降低酚類化合物的生物合成進而降低褐化率。報道的競爭抑制劑是ATP，這種方法在黃花蒿（Artemisia annua Linn.）、美國榆樹（Ulmus americana）和山茶（Camellia japonica L.）組培中均有研究，且均能有效降低褐化率［46-47］。

3.6" 其他防治褐化措施

選擇合適的消毒劑和消毒時間、加快傳代培養、降低接種密度等，都是降低褐化程度的辦法。消毒會對外植體造成傷害，且消毒時間越長褐化越嚴重，升汞相較于酒精對外植體的傷害比較輕，酒精消毒效果好，但容易對外植體產生傷害［48］。加速傳代培養，防止時間過長導致褐化物質積累進而加劇褐化，研究顯示椰棗（Phoenix dactylifera L.）每7天傳代培養較每20天傳代培養，褐化率、總酚水平、過氧化物酶活性明顯降低［49-50］。

4" 結語

目前為止，關于組培褐化的發生機制報道不在少數，大多與氧化有關。前人對寶蓮燈（M. magnifica）外植體切傷組培研究中發現切除寶蓮燈根部后不僅在傷口處發生褐化現象，葉片也出現切傷效應，表現為柵欄組織細胞質中鞣質大量積累，關于蝴蝶蘭（P. aphrodite）褐化研究中也出現同樣的問題，說明切傷會影響褐化的發生［28，33］。然而大多數研究者對氧化褐化的研究主要集中生理和生化指標上，切傷是植物組培的必要環節，關于切傷后培養物的細胞結構形態的動態變化、切傷信號的轉導和調控的研究較少，且從影響褐化物質有關基因的表達和遺傳水平上解釋影響褐化的報道也較少，尚不能全面的解釋影響氧化褐化現象的原因。

綜上，影響褐化的因素復雜多樣，防治褐變的辦法也多種多樣。包括篩選不同基因型的植物和控制褐化發生的條件等，但每種方法都有其優勢和局限性，例如降低接種密度和培養基凝膠的含量有利于降低褐化，但是接種密度太小會增加操作成本，過低的凝膠含量會降低外植體的增殖率［12］；幼齡材料體內酚類物質含量低，但幼齡材料過于幼嫩可能被消毒劑傷害導致褐化而不能生長［19］；降低無機鹽濃度可以降低褐化現象，但不同植物外植體誘導和生長發育所需的營養成分卻不一致，如低濃度無機鹽培養掌葉覆盆子褐化率下降且出芽率增加，但是長勢卻不如高濃度無機鹽培養［36］。所以，實踐中應該根據實際情況篩選適合的控制褐化的方法。

（責任編輯：嚴秀芳）

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Occurrence and Control Measures of Browning in Plant Tissue Culture

You Xiaoting1*，Jing Fulin1，Zhang Manqi1，Qin Jinzhuan2

（1.Science Institute of Zhanjiang State Farm，Zhanjiang 524086， Guangdong， China；2.Guangdong Agribusiness Tropical Agriculture Research Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 510506，Guangdong，China）

Abstract：

Browning is the most prominent problem affecting plant tissue culture， which seriously affects the growth and differentiation of culture， and even causes plant death. The research results at home and abroad showed that the mechanism of browning was mainly oxidative browning caused by phenols accumulation and oxidation， and the main influencing factors were plant varieties and genotypes， physiological conditions of explants， culture environment， disinfection methods and other tissue culture methods. The prevention and control measures based on the occurrence mechanism and influencing factors of browning were to select explant materials， which were not easy to browning， optimize the medium compositions and culture conditions， and add additives to inhibit browning. At present， the research on the mechanism of browning could not fully explain the oxidative browning， and the control measures may have adverse effects on other indexes of tissue culture.

Keywords：

tissue culture; browning; occurrence mechanism; influencing factors; control measures