基于同等藥效下2 種不同基原鳳尾草的質量控制方法研究

★ 熊紫微 溫泉 吳佳輝 馮育林,2 楊世林,2 鐘國躍（.江西中醫藥大學 南昌 330004；2.創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室 南昌 330006）

鳳尾草為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬藥用植物［1］，在我國分布廣泛，主要集中在我國的西南地區［2］，又名 “大葉鳳尾蕨” “井邊草”［3］。苗醫用鳳尾草最早記載于《本草拾遺》古籍中，主要功效為清熱利濕、涼血止血、消腫解毒［4］，用于治療黃疸型肝炎［5-6］，已有中成藥或者方劑中使用鳳尾草治療該病。經品種整理發現，鳳尾草存在 “同物異名” “異名同物” 等問題［7］，較多地區以井欄邊草作為鳳尾草使用［6］。經查閱相關文獻，鳳尾草主要有鳳尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa、井欄邊草Pteris multifidaPoir.、劍葉鳳尾蕨Pteris ensiformisBurm、溪邊鳳尾蕨Pteris excelsaGaud.及蜈蚣草Pteris vittataL.等［8］。據相關標準記載，1977 年版《中國藥典》［9］、1992 年版《中華人民共和國衛生部藥品標準》［10］、第3 版《臺灣中藥典》［11］以井欄邊草為基原收入標準中，而2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》［8］以井欄邊草、鳳尾蕨、劍葉鳳尾蕨、溪邊鳳尾蕨、蜈蚣草為基原收入標準中，而目前為止2020 年版《中國藥典》并未將其收載。前面3 個標準基原收載單一，2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》對其基原進行了擴充，但是以上標準質量標準的完善還存明顯不足，性狀與鑒別描述較簡單，鑒別檢查項不完善，含量測定也未納入其中。

目前大多數對于井欄邊草或者其飲片的含量測定以木犀草素-7-O-葡萄糖苷為定量化合物［12］，而鳳尾蕨基原研究較少。經研究發現，鳳尾蕨與井欄邊草均含有木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷［13-14］，且前者具有抗關節炎與抗真菌作用［15-16］，后者具有消炎、預防心肌肥厚等功效［17-18］。所以通過描述鳳尾蕨與井欄邊草的植株形態與根莖葉及粉末的顯微鑒別［19］、蕨素C 的薄層色譜鑒別，鳳尾蕨藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分，醇溶性浸出物測定以及木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量測定，制定合理的限度，為鳳尾草質量控制提供合理的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；薄層色譜硅膠板（青島海洋化工廠）；METTLER AB104-N 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；石蠟包埋機（湖北亞光醫用電子技術有限公司）；組織石蠟切片機（德國萊卡公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇、乙酸、乙醇（國藥試劑有限公司）；甲酸（分析純，西亞試劑有限公司）；伊紅染色液（北京索萊寶生物技術有限公司）；氨基半乳糖（阿拉丁生物技術有限公司）；谷草轉氨酶（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶、丙二醛、腫瘤壞死因子-α（南京建成生物工程研究所）；地塞米松（麥克林生物公司）；組織固定液（大連美侖生物科技有限公司）；木犀草素-7-O-云香糖苷（本實驗室自制，經NMR 和MS 等波譜法鑒定結構，純度≥99.1%）；木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批號1111720-201609，純度≥94.9%，中國食品藥品檢定研究院）；蕨素C（批號CFN6802，Chem Faces 公司）。

2 方法與結果

2.1 鳳尾草浸膏的制備

將鳳尾蕨與井欄邊草干燥藥材分別加10 倍量70%的乙醇溶液回流提取30 min，過濾蒸干，得到浸膏。鳳尾蕨與井欄邊草的浸膏得率分別為6.3%和7.0%。

2.2 體外藥效實驗研究

測定2 種不同基原藥材粗提取物對RAW 264.7細胞的毒性。將細胞快速解凍，復蘇。用適合的培養基加到適合種板的狀態，接種于96 孔板中，用2 種浸膏稀釋至5、2.5、1.25、0.625、0.3 125 mg/mL，培養細胞24 h 后加入10%的CCK-8 溶液測定吸光度，計算細胞存活率。最后采用Griess 法測定NO。

2.3 體內藥效實驗研究

2.3.1 動物分組及給藥 將72 只ICR 小鼠在新環境中喂養1 周后，隨機分為9 組：空白對照組、模型組、陽性藥組、鳳尾蕨與井欄邊草總提物高劑量組（10 g/kg）、中劑量組（5 g/kg）、低劑量組（2.5 g/kg），每組8 只。采用灌胃方式給藥，空白對照組、模型組和陽性藥組則灌胃等體積的生理鹽水，給藥頻率為每天1 次，共7 d。陽性藥組腹腔注射地塞米松（6 mg/kg）。2 h 后，除對照組腹腔注射等體積的生理鹽水外，其余各組小鼠均采用腹腔注射LPS（50 μg/kg）和D-gal（400 mg/kg）誘導小鼠急性肝損傷。禁食不禁水6 h 后，收集血液和肝臟，一部分肝臟放入組織固定液中，其余肝臟置于低溫保存。

2.3.2 血清生化指標檢測 血液采集結束后，提取血清，用于檢測腎臟中重要酶指標ALT、AST，炎癥指標TNF-α、IL-6，氧化應激指標SOD 和MDA。

2.3.3 肝臟組織病理學檢測 取肝組織相同部位用組織固定液固定后進行修塊，流水沖洗24 h，用乙醇進行脫水30 min，二甲苯透明10 min，石蠟包埋后切片、烤片、脫蠟水化，經HE 染色后脫水透明，烘干后封片，最后觀察情況。

2.4 藥效實驗結果

2.4.1 不同基原鳳尾草粗提物對細胞存活率及LPS 誘導的RAW 264.7 細胞釋放NO 含量的影響 鳳尾蕨與井欄邊草在藥物濃度為0.625 mg/mL 時，既能夠保證細胞接近100%的存活率，又能夠顯著降低NO 的釋放，說明鳳尾蕨與井欄邊草均有抗炎的作用。見圖1。

圖1 2種基原藥材對細胞存活率及NO釋放量的影響

2.4.2 體內實驗炎癥氧化應激指標影響 通過檢測血清指標ALT、AST、IL-6、TNF-α，發現鳳尾蕨與井欄邊草10 g/kg 時，能夠顯著降低血清中ALT 與AST 的活力，顯著降低炎癥因子IL-6 和TNF-α的水平。檢測肝臟中氧化應激指標SOD 與MDA 時發現，均能顯著降低MDA的含量，提高SOD酶活性。見圖2。

圖2 2種基原藥材對生化指標的影響

2.4.3 不同給藥組別對肝組織病理學影響 通過觀察肝臟病理切片，正常組肝細胞胞漿完整，肝索清晰；模型組紋路不清晰，組織間隙充血，粘連，細胞浸潤比較嚴重。給予鳳尾蕨、井欄邊草和陽性藥地塞米松后，肝細胞壞死面積明顯減輕。見圖3。

圖3 肝組織病理切片

2.5 質量控制方法研究

16 批鳳尾草全草藥材，經江西中醫藥大學鐘國躍教授鑒定為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物鳳尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa 與 井 欄 邊 草Pteris multifidaPoir.，樣品采集信息見表1。

表1 鳳尾草全草樣品采集信息

2.5.1 性狀 鳳尾蕨植株高50～70 cm。根莖短而直立或斜升，粗約1 cm，先端被黑褐色鱗片。葉片卵圓形，長25～30 cm，寬15～20 cm，一回羽狀；先端漸尖并有銳鋸齒，基部闊楔形。主脈下面強度隆起，禾稈色，光滑。側脈兩面均明顯，稀疏，斜展，單一或從基部分叉。葉干后紙質，綠色或灰綠色。

井欄邊草植株高30～45 cm。根莖較短，直立，葉片緊密呈簇狀生長，葉片卵狀長圓形，一回羽狀葉，葉邊緣比較柔軟但不整齊，并且呈鋸齒狀，頂部葉片為三瓣，垂直向下延伸。主脈兩面均隆起，顏色呈淡棕色。葉片干后形如草的質地，顏色為暗綠色。見圖4。

圖4 原植物及其干燥植株藥材、粉末圖

2.5.2 顯微鑒別

2.5.2.1 制片方法 將植物組織進行修剪，溫水浴煮泡發1 h，用固定液FAA 固定［20］。

2.5.2.2 鳳尾草根橫截面 根橫切面呈類圓形，細胞排列緊密，呈類梯形。表皮為一列薄壁細胞，基本組織中有4 個分體中柱，周韌型，基本對稱。維管束木質化、木栓化和角質化細胞被番紅染液染紅，在偏光鏡下顯紅色［21］。

2.5.2.3 鳳尾蕨莖橫截面 莖橫切面呈蝴蝶形，內部有2 個似海馬細胞的分體呈 “八” 字形排列，從邊緣往里部，細胞交錯排列，往里面有木質細胞，在顯微鏡下顯橙紅色。

2.5.2.4 鳳尾蕨葉脈及葉橫截面 中脈上部凹陷，呈兩山峰狀，下部凸出。表皮為一列薄壁細胞，被角質層，內側均有3～5 層厚壁細胞。維管束呈類三角形，周韌型。管胞1～2 層，呈淡紅色，在偏光鏡下呈亮紅色。見圖5。

圖5 鳳尾蕨根莖葉橫截面顯微圖

2.5.2.5 鳳尾蕨顯微粉末鑒別 粉末呈淡黃綠色。葉表皮細胞波浪彎曲狀。孢子囊柄長短不一，為4～6 個細胞，一般為2 列。呈近橢圓形，基部略窄，孢子呈三角形，呈棕紅色光芒。管胞可見網狀或梯狀紋孔。根狀莖鱗葉細胞為棕色薄壁細胞，長多邊形。見圖6。

圖6 鳳尾蕨粉末顯微鑒別圖

2.5.2.6 井欄邊草根橫截面 井欄邊草根部橫截面細胞排列緊密，外圍細胞較厚，在顯微鏡下顯橙紅色。內部有幾層薄壁細胞，呈無色透明狀。整個橫截面呈圓形，有4 個小型弧狀的分體，內部分布著薄壁細胞，且大小不一。

2.5.2.7 井欄邊草莖葉橫截面 莖橫切面呈蝴蝶形，內部有2 個似海馬細胞的分體呈 “V” 字形排列，從邊緣往里部，細胞交錯排列，往里面有木質細胞，在顯微鏡下顯橙紅色。見圖7。

圖7 井欄邊草根莖葉橫截面顯微圖

2.5.2.8 井欄邊草粉末顯微鑒別 粉末呈淡暗綠色。孢子呈三角形［22］；管胞可見網狀或梯狀紋孔；根狀莖鱗葉細胞為棕色薄壁細胞，長多邊形。見圖8。

圖8 井欄邊草粉末顯微鑒別圖

2.5.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末2 g，加入甲醇30 mL，超聲15 min，冷卻，濾過，補重蒸干，加入純水復溶，用二氯乙烷萃取至無色，取下層萃取液蒸干復溶，作為供試品溶液。吸取供試品溶液，對照藥材溶液，對照品溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）為展開劑，展開。置紫外光燈254 nm 下檢視檢。結果表明，上述條件能夠較好地將各斑點分離，顯色較清晰。見圖9。

圖9 16批鳳尾草薄層色譜鑒別圖（254 nm）

2.5.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物測定 按照2020 年版《中國藥典》一部附錄方法測定了16 批鳳尾蕨藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物。見表2。

表2 鳳尾蕨水分、灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物測定結果 %

2.5.5 含量測定

2.5.5.1 色譜條件和系統適用性試驗 使用Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液（17∶83）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長348 nm，進樣量10 μL，對照品溶液和供試品溶液的HPLC 色譜見圖10。

圖10 對照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜

2.5.5.2 供試品溶液的制備 取鳳尾蕨藥材粉末（過4 號篩）約0.5 g，精密稱定，加入70%甲醇20 mL，稱定質量，超聲45 min，冷卻，稱重，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，得續濾液作為供試品溶液。

2.5.5.3 對照品溶液的制備 取對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成含木犀草素-7-O-蕓香糖苷濃度為0.060 1 mg/g 與木犀草素-7-O-葡萄糖苷濃度為0.014 1 mg/g 的對照品溶液。

2.5.5.4 線性關系考察 精密稱取木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O- 葡萄糖苷對照品，加甲醇將木犀草素-7-O-蕓香糖苷配制成1、4、8、16、64、256 μg/mL 濃度，將木犀草素-7-O-葡萄糖苷配制成1.7、7.1、14.1、28.2、56.5、113 μg/mL 濃度對照品溶液，進樣10 μL，按上述色譜條件測定，以峰面積值為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程，相關系數與范圍見表3。

表3 鳳尾蕨中2種指標性成分線性關系考察結果

2.5.5.5 精密度試驗 取 “2.5.5.3” 項對照品溶液，按 “2.5.5.1” 項下色譜條件于同1 d 內連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果顯示，木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.17%和0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.5.6 重復性試驗 取同一批藥材6 份，按 “2.5.5.2” 項下供試品溶液制備方法和 “2.5.5.1” 項HPLC 測定方法進行分析，記錄2 種成分的峰面積，代入標準曲線計算樣品中各成分的含量。結果顯示，木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的RSD分別為1.97%和3.57%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5.5.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液按上述色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，木犀草素-7-O-蕓香糖苷峰面積平均值的RSD為2.29%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面積平均值的RSD為4.68%，結果表明供試品溶液中木犀草素-7-O-蕓香糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷均穩定。

2.5.5.8 色譜柱耐用性 取同一供試品溶液按上述色譜條件分別用Global Chromatography C18、依利特Hypersil ODS 和Cosmosil C18色 譜 值 進 樣 分 析，木犀草素-7-O-蕓香糖苷的RSD為4.41%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的RSD為5.00%。

2.5.5.9 回收率試驗 精密稱取已知含量同一批鳳尾蕨樣品6 份各0.5 g，精密稱定，再加入適量的木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷對照品，木犀草素-7-O-蕓香糖苷加樣回收率為100.49%～107.20%，平均加樣回收率為104.02%，RSD為2.75%；木犀草素-7-O-葡萄糖苷的回收率為90.52%～95.10%，平均加樣回收率為92.49%，RSD為1.92%。見表4。

表4 鳳尾草樣品2種指標性成分含量測定結果 mg/g

2.6 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，16 批鳳尾蕨中木犀草素-7-O-蕓香糖苷的含量為0.078 2～8.867 3 mg/g，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量為0.112 2～2.997 1 mg/g。

3 討論

本研究采用LPS/D-gal誘導ICR小鼠急性肝炎，肝損傷指標ALT、AST、TNF-α、IL-6、MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低。鳳尾蕨與井欄邊草在給藥量均為10 g/kg 時，能夠顯著降低AST、ALT、TNF-α、IL-6 的水平，井欄邊草抵御氧化應激的效果比鳳尾蕨效果好，井欄邊草能夠顯著提高SOD 的活性。鳳尾蕨與井欄邊草均能夠顯著降低MDA 含量，起到保護肝組織，減輕氧化應激。實驗結果表明，2 種基原鳳尾草均可通過降低相關炎癥因子水平，發揮保肝作用［23］。本研究確定了鳳尾蕨提取物對急性肝炎的保護和治療作用，為鳳尾草治肝損傷提供科學理論依據。

在薄層色譜鑒別中，經過多次試驗，對展開劑三氯甲烷、甲醇、正丁醇、乙酸進行條件摸索，最終選用硅膠GF254薄板。三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）為展開劑條件，同時進行方法學考察，分別考察溫度25 ℃和濕度34%、溫度19 ℃和濕度52%、溫度4 ℃和濕度75%的3 種不同展開環境，結果表明該鑒別方法耐用性良好，色譜圖Rf值適中，且分離度好。在對含量測定方法的提取方法、提取溶媒、提取時間、流動相系統的實驗考察中，得出最佳的含量測定方法為70%的甲醇超聲提取45 min，乙腈-0.1%甲酸進行洗脫最佳。各峰的保留時間適中，實驗重復性較好，有利于含量測定。

根據16 批樣品的測定結果，結合2020 年版《中國藥典》中同類藥材標準［24］，取均值上浮20%為10.9%，綜合分析確定鳳尾草水分不得高于10.9%，16 批次樣品全部合格，合格率為100%，建議規定鳳尾草水分測定不得超過10.9%；總灰分均值為12.5%，取均值上浮20%為15.0%，16 批次樣品中14 批合格，合格率為87.5%；酸不溶性灰分平均值為8.1%，取均值上浮20%為9.8%。16 批次樣品中13 批合格，合格率為81.3%，建議規定鳳尾草總灰分不得超過15.0%，酸不溶灰分不超過10.0%；醇溶性浸出率均值為20.4%，取均值下浮20%為16.3%，16 批次樣品全部合格，合格率為100%，建議規定鳳尾草醇溶性浸出物不得少于16.3%，鳳尾草樣品中木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的平均值為0.13%，取平均值下浮80%，合格批次16 批，合格率為81.3%。木犀草素-7-O-葡萄糖苷平均值為0.10%，取平均值下浮60%，確定含量限度值為0.04%，合格批次16 批，合格率為81.3%。建議規定鳳尾草中木犀草素-7-O-蕓香糖苷（C27H30O15）不得少于0.06%，木犀草苷（C21H20O11）不得少于0.04%。

通過定量犀草素-7-O-蕓香糖苷，合理規范藥材，并發現其具有治療急性肝損傷的作用。在薄層色譜研究中，使用蕨類植物特征性成分蕨素C 與對照藥材進行定性鑒別，為后期對藥材假偽的判定提供依據。