納米藥物包封率測定中的影響因素分析及對策

★ 溫沁楠 張銳 魏朵朵 王毓婕 孫勇兵（.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004；.江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心 南昌 330006）

納米藥物一般是將藥物溶解、包裹在高分子材料中或是吸附在載體表面形成的載藥納米粒，其粒徑在10～1 000 nm。將藥物制成納米制劑可以有效解決其溶解度、滲透性、穩定性差等問題，并且可以實現藥物靶向、緩釋、提高生物利用度等目的［1-2］。目前有超過51 種納米藥物獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準［3］，但是同期的申請量卻多達359 項［4］。僅有1/7 的申請獲得批準，主要原因之一是早期評價納米藥物體外和體內性質的標準化測試方案存在不足，可能導致不可預測的治療結果，從而增加了臨床試驗失敗的風險，這些問題阻礙了納米藥物的開發［5-6］。

在所有納米藥物體外研究實驗中，包封率是關鍵性評價指標，為納米藥物制劑成型工藝提供了關鍵信息。因此必須精確量化，合格的包封率是納米藥物能作為藥物傳遞系統的先決條件。國家藥監局新藥審評中心2021 年8 月27 日發布的《納米藥物質量控制研究技術指導原則（試行）》特別強調了應根據納米藥物的特點對包封率進行方法的適用性研究和驗證。該研究的難點在于游離藥物和載藥納米粒的分離，既要保證分離完全，又要保證包封藥物不泄漏，這是一項具有挑戰性的工作。而目前尚無規范的藥典方法或監管標準，以不同的分離方法測定包封率所得到的結果不一致，由此引發了人們對包封率準確度的質疑［7］。本文通過綜述目前包封率測定的主要方法、方法學驗證中存在的缺陷、導致準確度問題的因素以及應對策略，為選擇最佳的包封率測定方法提供參考。

1 包封率的計算方法

目前包封率的測定策略主要是通過間接法測定，即采用某種分離手段將游離藥物和載藥納米粒分離，再測定游離藥物的含量，最后通過質量平衡計算納米藥物的包封率［包封率=（W總藥量-W游離藥量）/W總藥量×100%］。但是由于載藥納米粒的多分散性，無法獲得（標定）不含游離藥物相應的定量用載藥納米粒對照品，因此僅能以游離藥物為指標進行方法學驗證。但需要特別注意的是，使用該策略的前提是載藥納米粒在分離過程中不發生藥物的泄漏。

2 游離藥物的分離方法

2.1 離心

離心法是基于粒子重量的差異，在離心力的作用下不同重量粒子沉降速度不同而使密度小的部分浮在上，密度大的部分沉降在下，以此分離游離藥物與載藥納米粒的方法，其優點在于操作簡單，分離過程中納米藥物不被稀釋，藥物溶出的可能性較低。一般來說，經過離心后，溶解在介質中的游離藥物往往存在于上清部分，而納米粒子則沉淀在下。但也存在藥物溶解度極小，游離藥物沉降在下，被包封的納米粒子處于上清的情況［8-9］，后者不再適用于高速離心法。故應根據藥物的性質選擇合適的離心力（或是離心轉速）。

2.2 透析

透析法與反透析法均是利用透析袋對分子量的選擇性，將游離藥物與載藥納米粒分離。載藥納米粒由于粒徑較大被阻礙，而游離藥物會在濃度梯度差的作用下，由濃度高處向濃度低處擴散，達到平衡后即可測得游離藥物含量，但達到分離平衡的時間在所有分離方法中最長，最可能出現伴隨在分離過程中載藥納米粒內藥物溶出的問題。

2.3 超濾

超濾法又分為超濾離心法、加壓超濾法、中空纖維超濾法等［7］。與透析法相似，也是利用超濾膜的分子截留量大小將游離藥物與載藥納米粒分開，使游離藥物透過超濾膜，但其借助外力加快了分離的過程。游離藥物由于粒徑較小、分子量小，可以透過超濾膜，而載藥納米粒則被截留在超濾膜上。此方法兼具離心法的優點，借助超濾膜的截留分子量的特性，相比于離心法分離的速度更快，也更容易判斷分離的終點。

但需要注意的是，如果游離藥物會發生締合、結晶導致流體尺寸的變化，則需要根據藥物的性質合理使用濾膜。如陳倩倩［10］利用游離的白藜蘆醇絕大部分是以微晶形式存在，通過微孔濾膜過濾截留游離的微晶，而使載藥乳脂體通過濾膜。實驗表明，極小部分溶解于水中的白藜蘆醇對包封率測定結果無明顯影響。

2.4 分子排阻

分子排阻法（size exclusion chromatography，SEC）是利用被分離物質流體力學尺寸差異而將游離藥物與載藥納米粒分離的方法［11］。一般來說納米粒的粒徑大于游離藥物，當粒子粒徑大于凝膠孔徑時，便無法進入凝膠內部，只能順著凝膠顆粒外部縫隙流出，而游離藥物分子量小，被吸附進凝膠內部，在洗脫劑的作用才下逐漸被洗脫，所以在凝膠柱上納米粒先被洗脫流出，小分子藥物后出。但是由于分離的過程引入了色譜流動相和固定相兩個影響因素，SEC 的應用也需要較長的洗脫時間和較大的洗脫體積，這導致樣品被稀釋并伴有藥物的泄漏［12-14］。實際使用過程中除了凝膠柱層析法外，為達到快速分離目的，還有微柱離心法可供選擇。微柱離心法可加快分離的速度，可以同時并行處理多個樣品，但需注意離心作用可能導致柱床斷裂［15］。

2.5 非對稱場流分析法

非對稱場流分 析（asymmetric flow field flow fractionation，AF4）也是根據納米粒的流體力學尺寸進行細分的一種技術，場流分離的分離通道中無固定相填料，不同尺寸的樣品在載液的層流作用下，分布在液流拋物線剖面不同高度的位置上，因此不同尺寸分析物具有不同的保留時間。同時垂直于半透膜的方向會產生交叉流，大粒子擴散作用弱，趨向于靠近積累壁，因而更晚被洗脫。相比于SEC，此方法不存在因填料孔徑而導致的排阻極限的限制，幾乎可以分離和表征橫跨整個膠體尺寸范圍的復雜樣品。但是和SEC 的情況相似，此法也存在分析時間較長的問題，耗時常在1 h 以上，而長時間的稀釋過程易導致納米制劑的藥物泄漏，特別是油水分配系數較低的藥物更會發生這種情況［16］。膜材如選擇不當還可能導致游離藥物從半透膜滲漏。

2.6 其他

除以上方法外，通過分離介質、游離藥物和載藥納米粒三者間相互作用的差異，也有一些特異性的分離方法被運用于測定納米藥物的包封率。井水泉［17］運用D101 大孔樹脂能特異性吸附游離藥物而不吸附載藥脂質體的特性，上樣后用少量蒸餾水將脂質體洗脫下來，而游離藥物留在樹脂柱上，使二者分離。劉敏等［18］基于納米粒的包裹不改變紫杉醇的紫外吸收特性，運用熒光素示蹤法結合HPLC 直接測定，將游離紫杉醇與紫杉醇納米粒在C18同時定性定量測定，并且交叉驗證了所測定的包封率值，結果無明顯差異。吳瑾瑾等［19］根據獼猴桃根多糖帶有負電性這一特征，用陰離子交換樹脂分離游離藥物與脂質體。李文靜等［20］利用硫酸長春新堿在溶液狀態下可形成有機銨鹽離子，被陽離子交換樹脂完全吸附，以達到分離游離硫酸長春新堿目的。更有學者利用多聚陽離子魚精蛋白與帶負電的脂質體納米粒產生絮凝作用，使載藥脂質納米粒沉淀，離心后取上清測定游離藥物含量［21-22］。

3 影響因素

3.1 藥物的溶解性

藥物的溶解性是影響包封率測定的一大原因，在使用超速離心法測定包封率時，脂溶性藥物難以溶解在分散介質中，在巨大的離心力作用下沉降在底部，難以與密度較大的載藥納米粒分開，這時通過測定上清中游離藥物含量而計算包封率的結果會偏大。使用超濾法與透析法時，脂溶性藥物由于難以溶解在分散介質中，聚集而成的微粒容易堆積、阻塞超濾膜與透析膜的孔徑，阻塞游離藥物的透出，也會導致測得的包封率值偏大。

3.2 密度

根據沉降理論公式，離心法只適用于載藥納米粒的密度與離心液體介質密度不同的載藥納米粒的沉淀。這就需要專業離心儀器來支持超高的離心力。因此，在一般的操作條件下，特別是當顆粒密度與液體介質相似時，超速離心常常導致分離效率低下［11,23］。并且加樣回收實驗無法證明 “上清液” 中是否還含有載藥納米粒，也無法證明較長時間的超速離心是否導致了藥物泄漏。

3.3 溶劑量

運用超濾離心法測定包封率時，濃差極化是阻礙游離藥物透過膜的主要因素，超濾過程中，超濾膜內藥物逐漸濃縮，可能形成膠束，進一步使低分子量物質難以透過超濾膜，使包封率測定結果偏大［24］。而葡聚糖凝膠柱層析法與透析法［25］皆是由于洗脫液體積過大或透析介質體積過大，使載藥納米粒被大量稀釋，致使部分納米粒破裂，包載的藥物泄漏，使游離藥物含量增大，測得的包封率會比真實值小。因此分離溶劑的量對包封率測定結果也有明顯的影響。

3.4 分離時間

SEC、AF4 和透析法分離時間均較長，但在游離藥物與載藥納米粒分離過程中，不可避免地伴隨著載藥納米粒內藥物的溶出（釋放），因此，分離時間應該盡可能短。但分離時間不夠又無法使游離藥物與載藥納米粒完全分開，所測得的包封率往往偏大。此外，在使用超速離心法時，離心時間過長使納米粒長時間處于很大的離心力下［26］，強大外力可能致納米粒破裂，包載藥物泄漏，使測得的包封率偏小。離心法中長時間的離心也可能導致納米粒聚集，阻礙了游離藥物的分離，使測得的包封率過大。離心時間不夠又無法將全部載藥納米粒完全沉淀，分離不完全，測得的包封率偏小。因此分離時間的優化尤為重要。

3.5 納米粒的結構穩定性

納米粒在長時間的高速離心［26］、大量稀釋［25］、不合適洗脫劑的作用下，均可能破裂使其中包載的游離藥物泄漏，使測得的包封率偏小，因此在考察游離藥物回收率的同時，還需要考察載藥納米粒在分離過程中結構的變化。

3.6 膜的孔徑和膜材質

對于透析、超濾離心、AF4 法均涉及膜材的選擇，如果在方法學驗證中為追求游離藥物的回收率符合驗證要求而選擇過大孔徑的膜，也可能導致載藥納米粒透過到濾液中，造成錯誤的結果［11］。因此，必須根據游離藥物的分子量，對分離膜的截留分子量進行限制，一般不能超過游離藥物分子量的10 倍。

膜材質的選擇問題也需要注意，從實驗室常用的Millipore 及Amicon 超濾離心管說明書中得知，其常用的膜材質為聚醚砜（PES），僅適用于生物液體及水溶液，對甲醇的耐受僅≤60%，所以實驗中使用甲醇作為溶劑并不恰當，結果表明超濾離心法測包封率的重復性一般，推測實驗中超濾膜的結構可能已發生變化［22,27］，因此該研究得到的包封率結果的準確性有待進一步考察。

4 應對方法

4.1 通過方法學驗證可以控制的因素

可以得知，分離條件選擇不當，會導致包封率測定結果偏離真實值。所以對游離藥物與載藥納米粒的分離方法進行方法學驗證是必要的。例如在苦參堿凍干脂質體的包封率測定中［28］，分別使用了透析法、葡聚糖凝膠柱色譜與微柱離心法，每種方法都依次進行了條件優化及方法學驗證，確定了透析袋及空白脂質體對游離藥物均沒有吸附、截留作用，透析時間能夠使游離藥物釋放完全；確定了葡聚糖凝膠柱對游離藥物沒有吸附作用，空白脂質體的加入不影響游離藥物的洗脫，合適的柱體積，洗脫液的用量及合適的上樣量；確定了制得的微柱對空白脂質體沒有截留作用，可以將載藥脂質體與游離藥物分開的離心條件，認為此3 種方法都可行。但是3 種方法最終的測定結果并不一致，通過比較，透析法測定包封率偏低，推測與脂質體中的藥物泄漏有關，同時說明藥物泄漏問題及影響因素難以通過常規方法學驗證發現。

為進一步提高方法學驗證的可靠性，還需要對分離過程中載藥納米粒結構的穩定性進行考察，例如莊英華等［29］使用超濾離心法測定連翹酯苷脂質體包封率，通過方法學驗證，證明超濾膜對連翹酯苷沒有吸附。其可進一步利用定磷法測定濾液中的磷脂含量［30］，如為陰性，則可確認所選擇的超濾離心管可以完全截留住脂質體，并且脂質體結構完整沒有發生破裂，這樣藥物泄漏可能性就大大降低。

4.2 目前尚不能通過常規方法學驗證發現的因素

在現有的間接測定包封率的分離方法中，水溶性強的藥物制備的納米制劑比較容易出現方法學考察驗證失真的問題，因為只要膜或者填料不對游離藥物產生非特異性吸附，那么通過加標回收的方法，回收率測定的結果就一定能滿足方法學驗證的要求。但分離過程中是否存在載藥納米粒中藥物的泄漏問題卻不可得知。

為了克服這個缺陷，筆者認為必須采用更為直接的方法，主要是利用被測藥物特殊的結構，依靠光譜學或電化學技術，不經分離直接地測定納米制劑中游離藥物的含量。比如COULIBALY 等［31］利用核磁共振定量硼譜（11B-qNMR）基于測定硼替佐米（BTZ）海藻酸鈉微粒中的BTZ 含量，包封于海藻酸鈉中的BTZ，由于分子的轉動受到聚合物的抑制，譜峰展寬不干擾游離BTZ 的測定。AGRAHARI等［32］也采用了類似的思路，在31P-qNMR 中游離的含磷化合物會產生一個尖峰，而被包封的藥物譜峰會展寬，可以方便區分游離藥物和包封藥物。如果能找到合適峰位的吸收峰代表游離藥物的含量，1H-qNMR 也可以用于游離藥物的直接定量［33］。其他的方法還包括電化學方法，如MORA 等［34］采用伏安法測定了直接阿霉素的脂質體中游離藥物的含量。但這些方法極度依賴藥物及載體輔料的結構特異性和差異性，方法的專屬性很強但通用性仍然較差。因此，還是需要對載藥納米粒和游離藥物在物理、化學性質等方面的不同點進行挖掘，開發出具有不同工作原理的新方法，在各種方法之間進行交叉驗證，保證測定結果更為準確。

5 小結

對同一納米藥物進行包封率測定時，應當分別測試不同的分離方法，如所得結果具有明顯差異，則提示應當根據待測物的特性以及結合實驗實際優選合適的測定方法，而非僅僅選擇得到包封率測定結果最高的方法。

總的來說，在所有的間接測定法中，超濾離心法是現階段最佳的分離方法，其分離時間最短，防止包封藥物在分離中的釋放，其分離過程中也未對納米粒進行稀釋，只要能通過選擇合適的超濾膜避免非特異性吸附，并結合對載藥納米粒結構穩定性的考察，二者相互驗證，便能得到現階段最能逼近真實值的包封率測定結果，是可以采用的通用方法。也相信在后續的實驗中科研工作者能摸索出更多有效的方法在納米藥物包封率測定的實際應用中發揮作用。