微生物合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮的研究進展

宋金鵬，仲秀芳，李學思，曹振華，彭新輝，范光森*

（1.德州市纖維檢驗所，山東 德州 253000；2.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048；3.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州450046；4.河南省宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477265；5.湖南中煙工業有限責任公司技術中心，湖南 長沙 410000）

4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H）-furanone，HDMF），商品名稱為呋喃酮，又名草莓酮或菠蘿酮，廣泛分布于自然界中，如在草莓、菠蘿、橙桔、黑莓、葡萄、芒果、覆盆子等水果中都有檢測出HDMF。另外，在牛肉清湯、新烤面包、炒杏仁、炒榛子、葡萄酒、白蘭地酒、爆玉米花、咖啡、木材和煙等眾多產品中也有HDMF的發現[1-4]。HDMF香氣復雜，是一種具有類似麥芽酚強烈焙烤焦糖氣的雜環香料，在低質量濃度時呈現清香的草莓、菠蘿的香氣特征，高質量濃度時呈現焦糖味，同時具有濃郁的水果香氣及果醬味[5-6]。HDMF香氣閾值很低，為0.04 μg/L，香味強度分別為麥芽酚和乙基麥芽酚的12.5倍和2.5倍，增香效果明顯，且香味持久，是一種優良的甜味香料和增香劑，廣泛被用作食品、煙草和飲料等產品中的增香劑，是食品安全國家標準GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》、美國食用香料與提取物制造者協會（the flavor and extract manufacturers association of the United States，FEMA）（登記號3174）和歐洲理事會（Council of Europe，COE）（登記號536）認可允許使用的安全食用香料，并被業界冠以“香料之王”的美稱[1，4，7-9]。

鑒于HDMF閾值低、香勢好和特征性強等優良呈香特性，市場對HDMF的需求量越來越大。然而，天然產物中HDMF的含量很少，遠遠不能滿足迅速發展的香料及其他工業的需要，而當前普遍采用的化學合成法則由于存在合成步驟多、純度不高、產品香氣特征不佳且有溶劑及其他中間產物殘留等問題，在一些產品中，尤其是崇尚天然的食品中的應用受到限制。通過生物方法，即利用微生物的代謝合成HDMF成為了一種趨勢[6]。為此，本文將對HDMF的研究現狀，尤其是微生物法合成HDMF的現狀進行簡述，以期為相關研究提供參考。

1 HDMF的應用

因其獨特的感官特性，HDMF在食品、煙草和化妝品等產品中都有著廣泛的應用，具有明顯增香和增味的作用。如在成品啤酒中，具有焦糖和烘烤香的HDMF含量遠高于其風味閾值，對啤酒風味有著顯著貢獻，是啤酒呈現麥芽香的物質基礎[10]；在黍米黃酒中，HDMF有較高的香氣活力值，對黃酒香味貢獻較為明顯，尤其是在半甜、甜型的黍米黃酒中能顯著增加產品中的焦甜香味[11]；在葡萄酒中，HDMF則與4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）-furanone，HEME）共同賦予葡萄酒的果味和焦糖味[12-13]；在醬油中，HDMF是重要的特征風味物質，為醬油貢獻焦糖香味和醬香味[14]；HDMF在茶香中也具有重要的作用，是茶烘焙過程中具有獨特甜味和焦糖香的主要貢獻者[15]；HDMF在煙草產品中可以提高煙草口感和香味品質，是卷煙主流煙氣中焦甜香關鍵成分之一[16]；除此之外，HDMF還有屏蔽不愉快味道、抗菌抑菌、預防白內障、抑制黑色素等功能[17-20]，如HDMF可用來調配食用香精，在牛肉香精中添加HDMF可增加焦甜香，對牛肉整體風味的形成具有重要貢獻，模擬出的烤牛肉香精和實際樣品香氣相似度達90%以上[21-22]；GULE N P等[23]則采用含HDMF的聚乙烯醇制備了具有良好抗菌和抑菌作用的納米纖維膜；DEVADAS S M等[24]將HDMF用作涂層生物材料，降低了醫療器械的相關感染；LEE J等[20]研究發現，HDMF可以通過抑制環磷酸腺苷信號通路來抑制黑色素生成，推測HDMF可有效抑制色素的過度沉著，應用于皮膚美白產品中。

2 HDMF的檢測

HDMF存在于許多產品中，對這些產品的風味品質有著重要的作用，甚至成為衡量這些產品品質以及品種的重要參數，有必要對這些產品中HDMF含量進行測定。另外，在HDMF生產合成過程中，也需要對其含量進行檢測，以此評估該合成方法的效率。因此，建立有效的HDMF檢測方法十分重要。

2.1 前處理

雖然HDMF廣泛存在于多種水果、食品、煙草和化妝品中，但其含量都比較低，并且這些產品中還存在著其他復雜的成分。因此，對這些產品中HDMF的含量進行檢測十分困難，需要對其進行適當的前處理，才能有效地準確檢測到這些產品中HDMF的含量。另外，在以微生物法合成HDMF中，其含量也往往較低，并且發酵體系中同樣存在著較復雜的其他代謝產物，對其含量的檢測產生干擾，為此，也需要預先對發酵液進行前處理。目前，檢測HDMF常用的前處理方法主要為液液萃取和頂空-固相微萃取等。

液液萃取適用于所有沸點范圍的化合物，雖然費時、污染、浪費等問題突出，但萃取成本低、重現性好，是測定食品、煙草等產品中HDMF含量有效的前處理方法[25]。WANG X J等[26]采用液液萃取方法對5種高鹽稀態醬油進行前處理，結合全二維氣相色譜-嗅聞-質譜聯用方法分析表明，HDMF是醬油中的關鍵風味化合物；張增顯[27]采用液液萃取法前處理啤酒，并檢測了萃取物中的甜味化合物，結果表明，HDMF對啤酒焦糖甜味和香味具有重要作用。

頂空-固相微萃取利用吸附/脫附技術富集樣品中的揮發和半揮發性成分，無需有機溶劑、所需樣品量少、靈敏度高且可直接與氣質聯用儀或液相色譜儀聯用，是檢測樣品中HDMF含量的一種有效的前處理方法。如，VAN DE CANS M G等[28]利用頂空固相微萃取法對特種麥芽中的揮發性風味物質進行前處理，后采用氣相色譜質譜法進行分析，結果發現HDMF是麥芽呈焦糖味的重要貢獻物質之一。

2.2 檢測方法

當前，有關HDMF的檢測主要是氣相色譜法和高效液相色譜法。氣相色譜法適合分析揮發性物質，常與質譜、三重四級桿質譜、嗅聞技術聯用，在對樣品中HDMF定性和定量分析方面具有靈敏度高和精密度好的特點，是分析檢測HDMF含量的主要方法。張海林等[9]采用氣相色譜方法對酵母菌發酵產HDMF進行了定量測定；張澤宇等[29]采用氣相色譜質譜聯用法分析了儲存期間熱反應香味料的香辛料香氣屬性，結果表明HDMF與其香氣屬性具有強相關性，是區分熱反應香味料是否添加香辛料的關鍵化合物之一。雖然氣相色譜法在檢測樣品中HDMF含量時需要對樣品進行前處理，不能直接進樣，但十分適合于食品等復雜體系中風味物質的分析檢測。

高效液相色譜法是一種普及性好，簡便易操作，靈敏度高，分析速度快，樣品處理相對簡單，選擇性好的方法，也常被用于檢測樣品中HDMF含量，尤其是在合成HDMF產物含量的檢測中。如王鵬霄等[30-31]在研究產呋喃酮酵母菌分離和發酵條件優化時，都采用了高效液相法對其含量進行檢測，但在具體方法參數上存在一定差異，這主要與其所選用的色譜柱不同有關。高效液相色譜法無需對樣品進行前處理即可檢測其中HDMF含量，但對于含量極少且成分非常復雜的樣品則可能受限于其檢測靈敏度及色譜柱的分離效果而無法采用。

3 HDMF的生產方法

HDMF生產方法有天然提取、化學合成和生物合成3種[32]。

3.1 天然提取

1965年，RODIN J O等[4]首次在菠蘿中發現并用乙醚萃取方法分離出了呋喃酮，呋喃酮類化合物在食品風味中的重要性引起了關注。呋喃酮廣泛存在于多種植物體內，主要以四種形式存在：4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-羥基-2,5-二甲基-2H-呋喃-3-酮葡糖苷、4-羥基-2,5-二甲基-2H-呋喃-3-酮6'-O-丙二?；?β-D-吡喃葡萄糖苷和游離糖苷元，因此，可以從含有HDMF的菠蘿、草莓等蔬菜水果中直接提取和分離[2，33]。但是，由于植物體內呋喃酮含量均較低，分離、提取困難且成本較高，無法滿足當前工業應用中對HDMF的需求量。

3.2 化學合成

1966年，HENRY D W等[34]采用化學合成方法獲得了HDMF，后續圍繞化學合成HDMF開展了大量的科學研究，開發出了多種化學合成HDMF的方法，如以化學合成原料的來源不同分為：①以烯醇和炔醇為原料；②以丙酮醛為原料；③以3,4-己二酮及其鹵化物為原料；④以有機羧酸以及羧酸酯為原料；⑤以呋喃類及吡喃類化合物為原料；⑥以糖類化合物為原料（圖1）[5，7，35-36]。

圖1 2,5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮的化學合成方法Fig. 1 Chemical synthesis methods of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone

由于化學合成方法合成速率快，所以目前一般采用此方法生產HDMF。但隨著人們生活水平的提高，人們越來越崇尚天然制品?；瘜W合成方法存在的眾多弊端，諸如合成步驟較多、得率低、生產成本仍較高、尤其是污染物排放量大、產物香氣特征不佳及存在溶劑殘留等問題日益顯現，不符合人們對當前產品質量的高要求，特別是將其應用于食品產品中[11]。

3.3 生物合成

按照歐洲和美國食品法規的規定，生物技術法生產的HDMF與從蔬菜水果中提取獲得的HDMF一樣，也屬于“天然的”HDMF，與化學合成的HDMF相比，該方法獲得HDMF不僅香氣純正濃厚、香韻好、品質高，而且安全性更好，具有不可替代性，逐漸成為生產天然HDMF主流趨勢，受到眾多研究者的關注[6，32-33]。目前，生物合成法生產HDMF的研究尚處于探索階段，主要用微生物模擬植物次級代謝產HDMF為主，集中于篩選產HDMF微生物菌株及其發酵條件優化等相關研究。除此之外，也有少量研究側重于微生物合成HDMF的機制研究，探究其代謝途徑[9，30-31]。目前研究發現，能夠代謝合成HDMF的微生物種類比較少，且產量普遍偏低，所利用的培養基成本相對較高，尚不能滿足市場對天然HDMF的需求量。但相比天然提取而言，其產量相對較高，且步驟簡單，是滿足人們對天然HDMF需求量日益增加的有效方法。為此，應加強高產HDMF菌種的研究，尤其是利用廉價培養基篩選高產HDMF菌種和優化發酵條件，并解析其形成HDMF的代謝途徑及關鍵酶，通過現代分子生物學改造和構建高產HDMF的工程菌株，從而提高微生物合成HDMF的能力。

4 合成HDMF的微生物種類

起初，研究者認為醬油等食品中的HDMF形成于生產制造過程中的美拉德反應，但隨著在更多有酵母菌和乳酸菌參與發酵的食品中（如啤酒、味噌和奶酪等）檢測出HDMF，研究者們逐漸意識到微生物在食品HDMF的形成中發揮著重要作用。經過研究發現，某些昆蟲、酵母菌和細菌在固定培養基中或特定條件下進行培養，可通過次級代謝合成呋喃酮類化合物。目前，國內外有關微生物轉化生產HDMF的研究仍相對較少，已報道能夠產HDMF的微生物種類不多，主要有魯氏酵母（Zygosaccharomycessp.）、畢赤酵母（Pichiasp.）和乳酸菌等，并且主要集中于酵母菌株（表1）。由表1可知，在已有報道微生物中，其所產HDMF含量普遍較低，且發酵培養中普遍含有1,6-二磷酸果糖（fructose-1,6-diphosphate，FDP）前體物質。

表1 合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮的微生物Table 1 Microorganisms for synthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone

4.1 魯氏酵母

在研究醬油HDMF的形成機制時發現，醬油釀造期間魯氏酵母可通過次級代謝作用產生HDMF，在醬油獨特風味的形成中發揮著積極的作用[47-50]。基于此背景，科研人員加強了對魯氏酵母產HDMF的研究，相關研究主要是從不同醬油釀造環境中篩選獲得魯氏酵母，并對其發酵產HDMF條件進行優化，如DAHLENT等[38，51]優化了魯氏酵母產HDMF的培養基組成，在添加10 g/LD-葡萄糖、80 g/L FDP、50 g/L CaCl2和120g/LNaCl的培養基中產HDMF最高，約為35mg/L；周亞男[39]優化了高密度發酵產呋喃酮風味物質的培養條件，結果表明當接種量為5×108CFU/mL、FDP添加量為120 g/L、NaCl添加量為180 g/L、培養5 d時，HDMF產量最高，為6.77 mg/L；HECQUET L等[37]研究則表明，魯氏酵母在添加10%的FDP和5%D-葡萄糖的培養基中培養發酵11 d，培養基中HDMF的質量濃度達到最高，約為80 mg/L（表1）。由上述可見，魯氏酵母是產HDMF的主要微生物菌種，也是研究微生物產HDMF最早的菌種，有關微生物產HDMF的相關機制也主要是基于此菌種開展的，但總體而言，該菌株所產HDMF能力有限，且相關研究多在以高價格的FDP為底物的培養基中進行的，發酵成本較高。

4.2 畢赤酵母

畢赤酵母是另一類能代謝合成HDMF的酵母，早期研究發現該酵母可以轉化L-（+）-鼠李糖代謝合成HDMF，如莢膜畢赤酵母（Pichia capsulata）在含有鼠李糖和酪蛋白培養基中可以產HDMF，產量最高約為2 mg/L[52]。另外，該酵母菌屬也可利用FDP或果糖產HDMF，如從酒曲中分離篩選獲得的季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）SX-21，在高濃度的NaCl和FDP培養基中，其產量為100 mg/L，而從菠蘿、草莓等水果中分離篩選到的畢赤酵母在含有D-果糖的培養基中也能產HDMF，產量可達6.84 mg/L[9，30]。值得注意的是，已報道最高產HDMF的菌株是該菌屬中的一株突變株，即經亞硝基胍誘變季也蒙畢赤氏酵母的突變株，在含400 g/LFDP的培養基中HDMF產量高達700 mg/L以上（表1）[43]。

4.3 乳酸菌

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌的統稱，許多乳酸菌被公認為安全的食品級微生物，在部分發酵食品生產過程中能促進產品風味物質的形成。有研究表明，在含有瑞士乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus）的氨基酸脫脂牛奶培養基中檢測到HDMF，推測該菌株能產HDMF[53]，在后來的研究結果中也證實了該推測，瑞士乳酸桿菌和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）在乳清粉水懸液中都能產HDMF，培養7 d后分別產598 μg/L和427 μg/L[45]；廣泛用于乳酪生產的菌種-乳酸乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus lactissubsp.cremoris）在含有谷氨酸鈉和核糖或半乳糖培養基中均有HDMF產生，且在添加半乳糖的培養基中產量較高，培養3 d時產量可達到1.17 mg/L（表1）[46]。

綜上可見，目前天然微生物轉化生產HDMF的菌種種類較少，主要是魯氏酵母，其次為畢赤酵母和乳酸菌，并且所產HDMF能力都較低，通過微生物發酵法尚不能滿足工業生產對HDMF的需求。但隨著對產HDMF微生物菌株研究的重視，將會有越來越多產HDMF的菌株被挖掘出來，如有研究發現，漢遜酵母（Hansenulasp.）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）、白假絲酵母（Candida albicans）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、東方伊薩酵母（Pichia kudriavzevii）、路德類酵母（Saccharomycodes ludwigii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、佛氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）和扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）等菌株也能產HDMF，并且隨著分子生物技術的發展，可以通過基因構建、改造或修飾來提高微生物法發酵產HDMF的能力[43-44，54-56]。

5 微生物合成HDMF的機制及其關鍵酶

目前，已知產HDMF的微生物菌株，無論是酵母菌還是細菌，其合成HDMF的內在機制都處于探索階段，生產機理尚不清楚[57]。從已有研究中可知，微生物合成HDMF需要己糖存在，推測可能是微生物通過代謝己糖直接產生HDMF或者是代謝己糖與氨基酸在高溫下發生美拉德反應的中間產物生成HDMF，但均無完整且清晰的代謝途徑，這極大限制了微生物合成HDMF的深入研究和生物法工業化的生產[57-58]。相較而言，有關魯氏酵母生物合成HDMF代謝途徑的研究比較多，如HAYASHIDA Y等[55]認為Mugi味噌、大豆醬和大麥曲等發酵基質中含有的己糖和氨基酸首先經美拉德反應產生Amadori中間產物，然后在魯氏酵母作用下轉化為6個碳的1-脫氧二酮糖后再轉化形成HDMF；DAHLEN T等[38]采用同位素標記法分析發現，魯氏酵母細胞壁或細胞膜上相關生物酶在催化FDP產生HDMF時發揮了重要的作用；隨后HAUCK T等[51]利用魯氏酵母細胞質和細胞內蛋白提取液將FDP成功轉化合成了HDMF，這表明HDMF的產生需要以上兩種提取液中的酶類參與。

基于已知微生物代謝合成HDMF時需要己糖類化合物存在的事實，學者推測與己糖代謝相關的糖酵解代謝途徑（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）及磷酸戊糖代謝途徑（pentose phosphate pathway，PPP）在微生物合成HDMF中發揮著重要的作用。基于此，有學者提出了如圖2所示的有關微生物合成HDMF的代謝途徑，有關微生物，尤其是魯氏酵母合成HDMF的機制基本上是通過以上兩條途徑展開研究的。

圖2 通過EMP和PPP途徑合成4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮Fig. 2 Metabolic synthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone through EMP and PPP pathways

5.1 通過EMP合成HDMF及其關鍵酶

在酵母糖類化合物代謝中，EMP發揮著重要的作用，因此，在酵母合成HDMF中發揮著積極的作用。EMP中磷酸果糖激酶（posphofructokinase，PFK1）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和己糖激酶（hexokinase，HK）三種單向酶在促進反應進行、調節能量方面起著關鍵性的作用[59]。果糖和葡萄糖在HK的作用下分別轉化為6-磷酸-果糖和6-磷酸-葡萄糖，而6-磷酸-葡萄糖在磷酸葡萄糖異構酶（glucose-6-phosphate isomerase，G6PI）作用下轉化為6-磷酸-果糖，在PFK1作用下6-磷酸-果糖催化為FDP，隨后在醛縮酶（fructose-bisphosphate aldolase，FBA）作用下將FDP裂解為三磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，GAP）和二羥基磷酸丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP），后者再經過一系列未知代謝途徑轉化為HDMF（圖2）[60]。

5.2 通過PPP合成HDMF及其關鍵酶

PPP也是微生物細胞中糖代謝的關鍵途徑，在微生物利用己糖合成HDMF中同樣發揮著重要的作用。在氧化過程中，6-磷酸-葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）作用下氧化為6-磷酸-葡萄糖內酯，然后在6-磷酸-葡萄糖內酯酶（6-phosphogluconolactonase，6PGL）作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸，隨后在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，G6PDH）的作用下生成5-磷酸核酮糖，經轉酮酶（transketolase，TKT）作用轉化為3-磷酸甘油醛或6-磷酸-果糖，3-磷酸甘油醛再通過磷酸丙糖異構酶（triose phosphate isomerase，TPI）轉化生成磷酸二羥丙酮，繼而生成HDMF，而6-磷酸-果糖則通過EMP途徑生產HDMF（圖2）[40]。

6 微生物合成HDMF的培養條件

影響微生物合成HDMF的因素眾多，按其內因和外因主要包括微生物菌種本身的基因特性和其培養發酵條件[61]。微生物菌種本身特性主要通過從不同環境中篩選、基因誘變或基因改造獲得優良菌種而得到改善，而一旦菌種確定后就需要通過調控其培養條件，如碳源種類和濃度、氮源種類和濃度、鹽濃度、初始pH值、搖床轉速、培養溫度、接種量、培養時間等因素對其合成HDMF產量進行調控[6，9]。

6.1 糖種類及其濃度

不同的糖種類對微生物合成HDMF會產生不同的影響。在前期研究中認為，酵母合成HDMF的前體物質是FDP，如DAHLEN T等[38]利用同位素標記法證明，HDMF是魯氏酵母利用FDP產生的次級代謝產物。隨著對微生物合成HDMF研究的深入，后續研究表明，除FDP外，麥芽糖、乳糖、鼠李糖、D-果糖等也是微生物合成HDMF的前驅物質，促進HDMF的生成。如張海林[43]探究了葡萄糖、FDP、果糖、乳糖、鼠李糖和麥芽糖等不同碳源對酵母合成HDMF的影響，結果表明，雖然以FDP為碳源時最有利于酵母合成HDMF，但果糖、鼠李糖和麥芽糖也能促進酵母合成HDMF；同樣，在王鵬霄[41]研究中也證明了鼠李糖、麥芽糖和果糖都是酵母菌發酵產HDMF的有效前體。另外，糖濃度會對酵母合成HDMF產生一定影響，較高的糖濃度會對微生物細胞產生一定的滲透壓脅迫，從而促進EMP和PPP中相關酶活性的提高，增加HDMF的生成[62]。如在周亞男[39]研究中發現，在不同濃度的FDP下酵母所產HDMF量有所不同，在0～120 g/L的FDP質量濃度范圍內，隨著培養基中FDP濃度的增加，酵母菌所產HDMF的能力呈現先升高后下降的趨勢；HECQUET L等[37]研究發現在FDP含量為10%時，魯氏酵母所產HDMF較高，而當其含量增加至20%時，其合成HDMF的能力則受到一定程度的抑制；DAHLEN T等[38]研究發現FDP濃度與HDMF濃度及酵母細胞數量呈正相關。

6.2 氮源種類及其濃度

有研究表明，美拉德反應的產物可以促進微生物生成HDMF。由此可以推測氮源對微生物合成HDMF具有重要的影響。如在無氮源的L-鼠李糖溶液中接種莢膜畢赤酵母發酵后未檢測到HDMF，而將L-鼠李糖加入到含有蛋白胨的培養基中進行濕熱滅菌后，再接種莢膜畢赤酵母發酵后則檢測出HDMF，可見氮源會影響微生物合成HDMF[63]。然而，在張海林[43]研究中卻發現，不同種類的氮源對酵母NTG-SX-103合成HMDF的影響較小，這可能是由于其所采用的初始培養基為麥汁，其中含有比較豐富的氮源的緣故。雖然有關氮源種類及其濃度對微生物合成HDMF的研究較少，但從其對微生物生長繁殖及其對微生物生物酶的調控和表達以及可能通過美拉德反應形成微生物合成HDMF的前體物質等方面分析，氮源種類及其濃度一定會對微生物合成HDMF產生影響。

6.3 NaCl和Ca2+質量濃度

有研究表明，在鹽脅迫培養條件下會增加EMP中各代謝產物含量及其相關基因的表達，繼而會影響微生物合成HDMF[64]。如周亞男[39]研究發現，隨著發酵培養基中NaCl濃度的增加，魯氏酵母合成HDMF的能力呈現先上升后下降趨勢，當NaCl質量濃度為180 g/L時，酵母所產HDMF濃度最高；HAUCK T等[51]研究結果也表明，在NaCl含量為17%時有利于微生物合成HDMF。另外，有研究表明，Ca2+是一種滲透壓傳遞信使，一定濃度的Ca2+有助于微生物合成HDMF，如有研究發現在培養基中添加1 mol/L Ca2+有助于酵母合成HDMF，其產量相比未添加Ca2+的培養基增加了23.3%，并且在0～1 mol/L范圍內，HDMF的產量隨著Ca2+濃度的增加而提高[43]；DAHLEN T等[38]探究了酵母在含有不同濃度CaCl2的培養基中生長和產HDMF的情況，結果表明，在CaCl2質量濃度為10～50 g/L時有助于促進酵母合成HDMF。

6.4 初始pH值

pH值對微生物的生長有多方面影響，主要是通過影響關鍵酶酶活、微生物細胞膜所帶電荷狀態等，從而影響微生物對營養物質的吸收和新陳代謝。每種微生物都有其最適生長pH值和一定的生長pH值范圍以及所產代謝產物的最佳pH值，適宜的初始pH值有利于促進微生物生長代謝和產代謝產物。如彭輝等[31]研究發現，魯氏酵母QOR6在不同的初始pH值條件下所產HDMF含量有所不同，隨著發酵液初始pH值的增加（由3.7增加至5.7時），其所產HDMF的量呈現先升高后降低趨勢，在初始pH值為4.2時，產量最高，為2.18 mg/L；HAUCK T等[51]的研究結果也同樣證實了初始pH值對微生物合成HDMF具有較大的影響。

6.5 搖床轉速

搖床轉速會影響培養基中營養物質與微生物細胞的接觸、氧氣傳遞效率以及對微生物細胞的剪切力，從而影響微生物生長代謝，對HDMF的合成產生影響。彭輝等[31]研究表明，轉速對酵母合成HDMF也具有較大的影響，隨著轉速的增加，發酵液中HDMF含量呈現先上升后下降趨勢，在轉速為180 r/min時最高，適當的轉速為其生長提供了充足的氧氣；同樣，在HECQUET L等[37]研究中也充分證明了相比厭氧發酵而言，有氧發酵更有利于其合成HDMF。

6.6 培養溫度

培養溫度會對酵母生長和代謝產生重要的影響，從而影響到其合成HDMF的能力，而不同的微生物其發酵合成HDMF的最佳培養溫度會有所不同。如畢赤酵母菌株P3發酵產HDMF的最佳培養溫度為34 ℃，其產量相比在38 ℃時提高了50%以上[41]；而酵母QOR6的最佳發酵溫度則為28 ℃，顯著高于其他溫度條件下發酵HDMF產量[31]。研究表明，發酵溫度主要是通過影響微生物生物酶活性來調控其產HDMF的量，溫度過低或過高都會影響到微生物代謝途徑中合成HDMF的生物酶活性[65]。

6.7 接種量

接種量能調節微生物的生長代謝，適宜的接種量對微生物代謝產物的積累具有積極影響[66]。彭輝等[31]研究表明，隨著接種量的增加，魯氏酵母QOR6合成HDMF的產量先升高后降低，不同接種量之間存在著差異；周亞男[39]研究也發現，接種量會對酵母產HDMF產生一定影響；張海林[43]研究發現，接種量對酵母NTG-SX-103產HDMF影響不顯著，這可能是與其所選用的接種量水平相關，在其所選用的不同接種量水平下，發酵后期酵母菌體濃度都沒有太大的差異，從而導致HDMF含量差異不明顯。

6.8 培養時間

培養時間不同，微生物代謝過程中相關生物酶的表達水平有所差異，對微生物合成HDMF會產生影響，因此，需要選擇合適的培養時間[62]。如LI X等[40]在探索添加D-果糖條件下酵母合成HDMF的分子機制時發現，在發酵等3天時，HDMF的合成主要是通過EMP產生，而在第5天時，EMP和PPP則都是生成HDMF的主要途徑，且HDMF含量達到最大；周亞男[39]在探究培養時間對微生物生成HDMF的影響時，均發現HDMF的含量隨著發酵時間的增加先上升后下降，分別在第4天、7天和6天時HDMF含量達到最大。

7 結論與展望

基于HDMF本身具有的風味特性，未來其將會在眾多食品中有著更為廣泛的應用，尤其是天然源HDMF。目前，雖然化學法是生產HDMF的主要方法，但隨著人們對天然性的偏愛，具有天然屬性來源的HDMF的市場需求將會更大。天然源HDMF可以采用天然提取法和微生物法獲得，但天然提取方法由于受原料來源及其本身含量的限制，無法滿足市場的需求，而微生物法則因其產量相對較高且步驟簡單，有希望成為天然HDMF的主要來源。然而，目前仍十分缺乏有關微生物合成HDMF的研究，當前已報道產HDMF的微生物主要集中于酵母菌株，并且產量都相對較低，尚無法滿足工業化生產的需要。另外，有關其形成內在機制尚不清楚，無法對其發酵進行有效的調控。因此，后續應加強微生物法合成HDMF的研究，首先從不同環境中網羅一批高產HDMF性能優良的菌株，并對其合成機制進行系統研究，然后采用基因工程和酶工程等技術改造或構建相應工程菌株，并對其發酵條件進行優化，從而逐漸滿足人們對天然HDMF的需求。