蘆臺春醬香型白酒釀造過程中真菌菌群多樣性及代謝分析

王佳麗，胥 強，路程順，趙淑先，張同存，羅學(xué)剛*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；3.山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031；4.天津蘆臺春釀造有限公司，天津 301500）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，其是在相對開放的生產(chǎn)環(huán)境下，以高粱等谷物為原料，采用大曲等糖化發(fā)酵劑，由多種復(fù)雜微生物與谷物相互作用固態(tài)發(fā)酵而成的[1-3]。由于釀造工藝和環(huán)境的不同，目前，根據(jù)風(fēng)味類型，中國白酒主要可分為12種香型[4]。其中，醬香型白酒有著悠久的生產(chǎn)歷史，是中國傳統(tǒng)白酒的三種基本香型之一（醬香型、濃香型、清香型）[5]。窖池發(fā)酵是醬香型白酒釀造過程中的重要步驟，乙醇和白酒的風(fēng)味物質(zhì)在這個階段產(chǎn)生[6]。由于發(fā)酵環(huán)境的變化（即氧氣的減少，乙醇的增加），微生物群落的多樣性也發(fā)生變化，曲霉屬（Aspergillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、畢赤酵母菌屬（Pichia）、釀酒酵母菌屬（Saccharomyces）、裂殖酵母菌屬（Schizosaccharomyces）等一些耐受厭氧和乙醇的微生物群落通常會在這個階段占主導(dǎo)地位[7]。然而，目前人們對窖池發(fā)酵的研究還較少。

白酒的品質(zhì)不僅與生產(chǎn)工藝有關(guān)，還與地理環(huán)境、水質(zhì)、氣候、糧食選擇等因素密切相關(guān)[8]。不同的生產(chǎn)地區(qū)、生產(chǎn)工藝會導(dǎo)致發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的演化存在差異，從而導(dǎo)致白酒成分和質(zhì)量出現(xiàn)差異[9-10]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物區(qū)系的研究[6，11]，這些技術(shù)的應(yīng)用為進一步研究白酒發(fā)酵提供了技術(shù)支撐。傳統(tǒng)上，醬香型白酒主要產(chǎn)于中國西南地區(qū)（貴州省和四川省）[12]，然而，近幾十年來，中國其他一些地區(qū)（如山東、湖南、廣西、黑龍江、北京、河南等）也能夠生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的醬香型白酒[13-14]。生產(chǎn)地區(qū)的增加，也帶來了醬香型白酒口味的多樣性[15]。1972年，中國著名白酒專家周恒剛利用從茅臺酒窖泥中分離出來的己酸菌，在天津研制出了中國第一代優(yōu)質(zhì)麩曲醬香酒，命名為“蘆臺春”，是中國北方醬香型白酒的經(jīng)典代表之一[16]，但迄今為止，其發(fā)酵過程中的微生物區(qū)系特征及與白酒香氣、風(fēng)味、品質(zhì)之間的關(guān)系和機理尚不清楚。

前期已對蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中的細菌菌群多樣性進行分析[17]，在此基礎(chǔ)上，本研究進一步對其不同輪次出窖酒醅中的真菌菌群多樣性進行分析，同時對釀酒過程中的理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味成分進行檢測，并探究微生物與其代謝物間的相關(guān)性，從而解析北方醬香型白酒發(fā)酵過程中的分子機理，以期為今后北方醬香型白酒的生產(chǎn)研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

同一批次第1輪次（LTJP1C）（前期輪次）、第4輪次（LTJP4C）（中期輪次）、第7輪次（LTJP7C）（后期輪次）出窖酒醅樣品：天津蘆臺春釀造有限公司，每輪次樣品各3份，共9個樣品，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）、2-辛醇（色譜純）：天津市江天化工技術(shù)有限公司；次甲基藍（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；OMEGA-soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：美國Omega Bio-Tek公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美國Axygen Biosciences公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：天津市華儀鑫達儀表有限公司；BS210S電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；0-30酒精計：河北省武強縣阜陽儀表廠；5975C+7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；固相微萃取（solid-phase micro-extrac tion，SPME）進樣器、萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/DVB）：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅樣品微生物菌群基因組抽提及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增

采用OMEGA-soil DNA Kit提取酒醅樣品中的微生物菌群基因組，以其為模板，采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌菌群的ITS1可變區(qū)基因序列進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增體系（20 μL）：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL，引物ITS1F（5 μmol/L）0.8 μL，引物ITS2R（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL；模板DNA 10 ng。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量[14，17-18]。

1.3.2 Illumina Miseq高通量測序及生信分析

根據(jù)Illumina MiSeq平臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的PCR擴增片段構(gòu)建文庫，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Miseq PE300平臺進行高通量測序。使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，并使用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/）根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Unite數(shù)據(jù)庫（Release 8.0），設(shè)置比對閾值為70%[14，17-18]。

1.3.3 酒醅理化指標(biāo)的測定

參照DB34T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》，采用酒精計法測定酒精度，采用中和滴定法測定總酸含量，采用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定法測定還原糖含量。

1.3.4 酒醅揮發(fā)性香氣成分的測定

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質(zhì)譜法[19]測定酒醅中的揮發(fā)性香氣成分。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SIMCA-P11.5軟件進行主成分分析（principal componentsanalysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），使用Canoco 5軟件進行典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅真菌菌群α-多樣性分析

不同輪次出窖酒醅樣品真菌菌群的α-多樣性分析結(jié)果見表1。由表1可知，蘆臺春醬香型白酒不同輪次出窖酒醅樣品的Shannon指數(shù)由第一輪次的0.92逐步上升至第七輪次的2.53，Simpson指數(shù)變化則相反，說明醬香型白酒發(fā)酵過程中真菌菌群的多樣性隨著輪次的增加而有所增加。同時，出窖酒醅樣品的Chao1指數(shù)由第一輪次的56.25增加至第四輪次的96.23，隨后降至第七輪次的86.96，ACE指數(shù)變化趨勢相同，表明真菌菌群的豐度隨著輪次的增加呈先升高后降低的趨勢。

表1 蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品中真菌菌群的α-多樣性分析結(jié)果Table 1 Analysis of fungal alpha diversity in fermented grains in different rounds during Lutaichun sauce-flavor Baijiu fermentation

2.2 蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平對醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 基于門水平蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of fungal communities in fermented grains in different rounds during Lutaichun sauce-flavor Baijiu fermentation at phylum level

由圖1可知，從三個輪次出窖酒醅樣品中共檢測出2個主要的真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）（92.27%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（7.57%），其中子囊菌門（主要是酵母菌和霉菌）是白酒發(fā)酵的主要真菌，從第一輪次到第七輪次，隨著輪次的增加，子囊菌門逐步降低，相對豐度由前期的99.87%降至后期的78.98%，但子囊菌門在三個輪次中依然維持較高水平，而擔(dān)子菌門則與子囊菌門的變化趨勢相反，相對豐度由0.13%升至20.73%，但一直保持較低水平。

2.2.2 基于屬水平真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平對醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于屬水平蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of fungal communities in fermented grains in different rounds during Lutaichun sauce-flavor Baijiu fermentation at genus level

由圖2可知，從三個輪次出窖酒醅樣品中共檢測到17個主要的真菌屬，分別為伊薩酵母屬（Issatchenkia）（35.08%）、紅曲霉屬（Monascus）（15.74%）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）（14.01%）、Leiothecium（6.81%）、曲霉屬（Aspergillus）（5.90%）、未分類的酵母目（unclassified_o__Saccharomycetales）（4.66%）、Apiotrichum（2.97%）、絲衣霉屬（Byssochlamys）（2.05%）等，其中，伊薩酵母屬、紅曲霉屬和哈薩克斯坦酵母屬占據(jù)優(yōu)勢地位。由于在窖池發(fā)酵過程中，環(huán)境處于厭氧狀態(tài)并進行酒精發(fā)酵，使得上述菌屬成為絕對的優(yōu)勢真菌。伊薩酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬、未分類的酵母目、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）等均屬于酵母菌，酵母菌為白酒釀造過程中的絕對優(yōu)勢真菌菌群，平均總相對豐度為57.57%。ZHANG H X等[20]對白酒多批次發(fā)酵過程中真菌群落的多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒發(fā)酵中涉及的主要真菌種類為畢赤酵母屬（Pichia）（41.75%）、酵母菌屬（13.07%）、嗜熱菌（9.16%）、紅曲霉屬（6.80%）、曲霉屬（4.69%）、裂殖酵母屬（3.76%）、嗜熱真菌屬（3.74%）和接合酵母菌屬（1.41%），另外，隨著發(fā)酵批次的增加，真菌菌群多樣性也隨之增加。本研究也有類似結(jié)果，但具體菌屬的種類及豐度有所差異。

從第一輪次到第七輪次，酵母菌的相對豐度隨著輪次的增加而降低，由第一輪次的97.56%逐漸下降至第七輪次的26.90%，霉菌則逐漸升高。其中，伊薩酵母屬的相對豐度由第一輪次的97.48%逐漸下降至第七輪次的3.53%；哈薩克斯坦酵母屬和復(fù)膜孢酵母屬的相對豐度則在第四輪次達到最高，分別為41.26%和1.10%，其他輪次處于極低水平；而未分類的酵母目、Apiotrichum和Cutaneotrichosporon均在第一輪次相對豐度極低，隨后逐漸升高，第七輪次相對豐度最高，分別為13.51%、7.87%和1.14%。在不同發(fā)酵時期酒醅中的真菌群落是動態(tài)變化的，微生物結(jié)構(gòu)會因不同輪次發(fā)酵的差異而改變。王琳[21]運用高通量測序技術(shù)對茅臺鎮(zhèn)1～7輪次窖池發(fā)酵酒醅中的微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)七個輪次共有的優(yōu)勢真菌屬為酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬，第一和第二輪次的絕對優(yōu)勢真菌屬為酵母菌屬，第三和第四輪次的第一優(yōu)勢真菌屬為裂殖酵母屬，接合酵母菌屬為第五到七輪次的第一優(yōu)勢真菌屬。由此可以看出，天津地區(qū)蘆臺春醬香型白酒窖池發(fā)酵酒醅中真菌與茅臺鎮(zhèn)生產(chǎn)醬香白酒中的真菌菌群具有一定差異，其優(yōu)勢真菌屬在不同輪次均不同。

蘆臺春醬香型白酒與茅臺醬香型白酒均以優(yōu)質(zhì)糯高粱為原料，采用相同的純糧固態(tài)釀造工藝釀造而成。然而，白酒生產(chǎn)也會受到氣候、地形和土壤等方面的影響[18]。茅臺、郎酒醬香型白酒的釀酒用水取自赤水河，西南地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，夏熱冬暖，每年大部分時間氣溫在3～25 ℃，平均氣溫15 ℃左右，每年多云天數(shù)一般在150 d以上，年相對濕度在70%以上。而蘆臺春醬香型白酒產(chǎn)自天津?qū)幒訁^(qū)蘆臺鎮(zhèn)，其釀酒用水取自蘆臺當(dāng)?shù)氐叵?00 m。蘆臺鎮(zhèn)屬于溫帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，全年大部分時間氣溫在-5～27 ℃，平均氣溫在12 ℃左右，年日照時數(shù)可達近3 000 h，年相對濕度在60%以上，且較茅臺鎮(zhèn)四季更為分明[17]。顯然，這種環(huán)境差異會改變環(huán)境微生物群落的組成[18]。而白酒的風(fēng)味和品質(zhì)依賴于微生物群落之間的協(xié)同作用，這些微生物群落的差異就會賦予白酒不同的風(fēng)味[9]。因此，探索醬香型白酒窖池發(fā)酵酒醅中的菌群可以為了解白酒發(fā)酵的完整微生態(tài)提供有價值的信息，為調(diào)節(jié)醬香型白酒的發(fā)酵過程提供理論指導(dǎo)。

2.3 基于真菌屬水平蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅的主成分分析

基于真菌屬的相對豐度對蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品進行主成分分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，第一主成分（PC1）的方差貢獻率為42.0%；第二主成分（PC2）的方差貢獻率為33.8%，兩個主成分共解釋了75.8%的變量，可以反映真菌屬在出窖酒醅樣品間的分布情況。由圖3A可知，相同輪次的出窖酒醅樣品相距較近聚在一起。結(jié)合圖3B可知，第一輪次出窖酒醅樣品與伊薩酵母屬（Issatchenkia）相關(guān)性較大；第四輪次出窖酒醅樣品與哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、曲霉屬（Aspergillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、青霉屬（Penicillium）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）等相關(guān)性較大；而第七輪次出窖酒醅樣品與紅曲霉屬（Monascus）、Leiothecium、未分類的酵母目（unclassified_o__Saccharomycetales）、Apiotrichum、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、Cutaneotrichosporon、凱氏腔菌屬（Keissleriella）等相關(guān)性較大。

圖3 基于真菌屬相對豐度蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的主成分分析得分圖（A）及載荷圖（B）Fig. 3 Principal component analysis score diagram (A) and load chart(B) of pit-unloading fermented grains samples from different rounds of Lutaichun sauce-flavor Baijiu during fermentation process based on the relative abundance of fungi

2.4 醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅的理化指標(biāo)

總酸、還原糖和酒精度為重要的理化因子[22]，不同輪次出窖酒醅樣品的理化指標(biāo)見圖4。由圖4可知，隨著輪次的增加，出窖酒醅樣品的酒精度呈先上升后下降的趨勢，從第一輪次的2.9%vol上升到第四輪次的5.0%vol，之后下降至第七輪次的1.9%vol；出窖酒醅樣品中的總酸含量呈上升的趨勢，從第一輪次的1.08 g/100 g逐漸上升至第七輪次的4.80 g/100 g；而出窖酒醅樣品中的還原糖含量呈先升高后下降的趨勢，從第一輪次的0.60 g/100 g上升到第四輪次的1.50 g/100 g，之后下降至第七輪次的0.90 g/100 g，整體處于較低水平。

圖4 醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品酒精度（A）、總酸（B）和還原糖（C）含量的變化Fig. 4 Changes of alcohol (A), total acid (B) and reducing sugar (C)content of pit-unloading fermented grains samples from different rounds of Lutaichun sauce-flavor Baijiu during fermentation process

2.5 醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味成分

通過HS-SPME-GC-MS測定醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果見表2。由表2可知，從不同輪次出窖酒醅樣品中共檢出67種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括29種酯類、12種醇類、3種酸類、1種酮類、3種醛類、6種吡嗪和13種其他類組分。隨著輪次的增加，揮發(fā)性風(fēng)味成分的總量和種類基本呈先上升后下降的趨勢，在第四輪次時揮發(fā)性風(fēng)味成分的總量和種類最多，為優(yōu)質(zhì)基酒的產(chǎn)出提供了物質(zhì)前提。酯類和醇類物質(zhì)呈先上升后下降的趨勢，醛類物質(zhì)呈上升趨勢，而酸類、酮類和吡嗪類物質(zhì)則在中后期輪次相對較高。酯類物質(zhì)由第一輪次的7.09 μg/g上升至第四輪次的13.65 μg/g，之后下降至第七輪次的12.57 μg/g；醇類物質(zhì)由第一輪次的10.76 μg/g上升至第四輪次的17.87 μg/g，之后下降至第七輪次的15.67 μg/g；酸類物質(zhì)由第一輪次的0.56 μg/g上升至第四輪次的2.81 μg/g，之后在第七輪次維持在2.76 μg/g；酮醛類和吡嗪類物質(zhì)則基本處于較低的水平。其中，第四輪次酒醅樣品中正己酸乙酯、庚酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、十五酸乙酯、油酸乙酯、乙醇等含量最高，而第七輪次酒醅樣品中壬酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己醇、2,3-丁二醇、糠醇、糠醛等含量最高。

表2 蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次出窖酒醅樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of GC-MS analysis of volatile flavor compounds of pit-unloading fermented grains samples during Lutaichun sauce-flavor Baijiu during fermentation process

2.6 蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中不同輪次酒醅真菌菌群與代謝物間相關(guān)性分析結(jié)果

2.6.1 理化因子與真菌微生物的CCA

在醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中，微生物組成和環(huán)境因素對群落演替有很大影響[22-23]。因此，對蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程不同輪次酒醅理化因子與真菌屬進行CCA，結(jié)果見圖5。由圖5可知，酒精度與總酸含量呈負相關(guān)，而與還原糖含量呈正相關(guān)。酒精度、還原糖含量與第四輪次酒醅樣品呈正相關(guān)，而總酸含量與第七輪次酒醅樣品呈正相關(guān)，說明第四輪次是醬香型白酒發(fā)酵最重要的時期，這個階段發(fā)酵產(chǎn)生大量酒精，而到發(fā)酵第七輪次，醬香型白酒發(fā)酵中產(chǎn)酒能力降低，產(chǎn)酸成為主要的發(fā)酵過程。哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、青霉屬（Penicillium）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）等與酒醅中酒精度呈正相關(guān)，說明在白酒發(fā)酵的主要輪次，上述菌屬（主要是酵母菌）在白酒發(fā)酵中起到重要作用。而紅曲霉屬（Monascus）、Leiothecium、未分類的酵母目（unclassified_o__Saccharomycetales）、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon、凱氏腔菌屬（Keissleriella）等則與總酸含量呈正相關(guān)，表明隨著輪次的增加，后期發(fā)酵由產(chǎn)酒為主轉(zhuǎn)為產(chǎn)酸，產(chǎn)酒的菌屬逐漸被替代，其他霉菌屬豐度有所升高。綜上，總酸、還原糖和酒精度是窖池發(fā)酵微生物演替的重要理化因子。

圖5 理化因子與真菌屬的典范對應(yīng)分析結(jié)果Fig. 5 Canonical correspondence analysis results of physicochemical factors and fungal communities

2.6.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分與真菌微生物的PLS-DA

在窖池發(fā)酵過程中，窖池中某些有害微生物的生長會受到抑制，原料繼續(xù)被分解，為己酸菌、甲烷菌和產(chǎn)酯酵母提供碳源，促進風(fēng)味前體的增加，為醬香風(fēng)味的形成創(chuàng)造了有利環(huán)境[24]。為探究真菌對窖池發(fā)酵過程中酒醅風(fēng)味物質(zhì)的影響，根據(jù)文獻[25-26]報道的酒醅中重要揮發(fā)性風(fēng)味成分以及含量較高的成分，從67種揮發(fā)性香氣物質(zhì)中挑選出31種重要的揮發(fā)性風(fēng)味成分，對不同輪次酒醅樣品中31種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分與真菌微生物間的相關(guān)性進行PLS-DA，結(jié)果見圖6。由圖6可知，伊薩酵母屬（Issatchenkia）與白酒發(fā)酵過程中具有水果香味的乙酸乙酯、有愉快的香蕉香味的乙酸異戊酯、有蘋果白蘭地香氣和辛辣味的異戊醇等相關(guān)性較大；哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、青霉屬（Penicillium）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）等與白酒發(fā)酵過程中有水果香氣味的正己酸乙酯、有菠蘿香氣味的庚酸乙酯、呈果香、葡萄香、青香和白酒似香氣的3-羥基丁酸乙酯、有愉快氣味的丁二酸二乙酯、有濃烈而甜的蜂蜜香氣的苯乙酸乙酯、十五酸乙酯、呈鮮花香氣的油酸乙酯、有酒的氣味和刺激性辛辣味的乙醇等相關(guān)性較大；而Leiothecium、未分類的酵母目（unclassified_o__Saccharomycetales）、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon等菌屬則對白酒發(fā)酵過程中的具有油脂、水果和白蘭地酒似香氣的壬酸乙酯、近似于玫瑰的、帶有蜜樣的底香的花香香氣、甜的草莓似的水果樣味道的乙酸苯乙酯、有淡青的嫩枝葉氣息、微帶酒香、果香和脂肪氣息的正己醇、2,3-丁二醇、有苦味的糠醇、有類似苯甲醛的特殊氣味的糠醛等形成起到重要作用。

圖6 揮發(fā)性風(fēng)味成分與真菌群落的偏最小二乘-判別分析結(jié)果Fig. 6 Partial least squares-discriminant analysis results of volatile flavor compounds and fungal community

目前，已有研究人員對白酒發(fā)酵菌群與代謝物的相關(guān)性進行了研究，鄒恬杏等[25]研究了洞釀醬香酒第四輪次酒醅發(fā)酵過程中的微生物群落與揮發(fā)性代謝物之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)嗜熱子囊菌屬、復(fù)膜孢酵母屬與多種酯類物質(zhì)呈正相關(guān)；吳成等[26]對醬香型白酒四輪次堆積發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)與微生物群落進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)酵母菌主要與醇類物質(zhì)如丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等呈顯著正相關(guān)，而絲狀真菌主要與酸類和酯類物質(zhì)如乙酸、丙酸、異丁酸、乳酸乙酯、油酸乙酯、己酸丁酯等呈顯著正相關(guān)。本研究也同樣得出了類似的結(jié)果，微生物產(chǎn)生的代謝物與白酒的質(zhì)量和風(fēng)味密切相關(guān)，這些微生物發(fā)揮它們各自的和/或協(xié)同作用，釋放不同的酶來催化一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，并將原料轉(zhuǎn)化為醇、醛、酸、酯和其他芳香化合物，這些化合物從根本上影響了白酒的風(fēng)味和質(zhì)量[6]。

3 結(jié)論

通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，天津地區(qū)蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中真菌菌群的多樣性隨著輪次的增加而有所增加，豐度則呈先升高后降低的趨勢，酵母菌（主要為伊薩酵母屬）是發(fā)酵過程中的主要真菌，且其相對豐度隨著輪次的增加逐步降低。蘆臺春醬香型白酒發(fā)酵過程中，隨著輪次的增加，酒精度及還原糖含量呈先上升后下降的趨勢，而總酸含量呈上升趨勢；發(fā)酵過程中理化因子與真菌菌群的CCA結(jié)果表明，總酸、還原糖和酒精度是窖池發(fā)酵微生物演替的重要理化因子。隨著輪次的增加，揮發(fā)性風(fēng)味成分的總量和種類基本呈先上升后下降的趨勢，其與真菌菌群的PLS-DA結(jié)果表明，伊薩酵母屬（Issatchenkia）與乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇等相關(guān)性較大；哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）等與正己酸乙酯、庚酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、油酸乙酯、乙醇等相關(guān)性較大；而Leiothecium、未分類的酵母目（unclassified_o__Saccharomycetales）、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon等則對壬酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己醇、2,3-丁二醇、糠醇、糠醛等的形成起到重要作用。本研究首次揭示了天津地區(qū)醬香型白酒不同輪次出窖酒醅的真菌微生物演替及其代謝，有助于闡釋白酒發(fā)酵過程中的深層分子機制，為傳統(tǒng)白酒的工藝控制和改進提供一定的理論指導(dǎo)。