基于CRISPR-Cas9系統構建LEU1基因缺失釀酒酵母用于釀造低醉酒度米酒

王澤翔，何嬌嬌，梁思宇，周世水*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東石灣酒廠集團有限公司，廣東 佛山 528031）

米酒是大米經過毛霉（Mucorsp.）、根霉（Rhizopussp.）以及酵母發酵后得到的產品，具有歷史悠久、種類繁多等特點。米酒在發酵過程中通過糖代謝途徑（Harris途徑）和氨基酸代謝途徑（Ehrlich途徑）生成多種高級醇，包括正丙醇、異丁醇、異戊醇等[1-2]，是形成米酒風味的重要化合物，但因高級醇具有較強的致醉性，飲用后會出現嘔吐和“上頭”等不適癥狀，對人體健康有危害[3-6]。不同高級醇比例導致醉酒度不同[7-8]，其對神經刺激程度隨分子質量的增大而加劇，其中對醉酒度影響最大的物質是異戊醇，尤其是異戊醇與異丁醇的比值越高，米酒的醉酒度越高[9]。因此，降低異戊醇/異丁醇的比值，能夠降低米酒的醉酒度，進而改善米酒的品質，減少對人體健康的危害。

在Ehrlich途徑中，LEU1基因編碼的異丙基蘋果酸合成酶催化由丙酮酸轉化而來的檸康酸生成β-蘋果酸甲酯，隨后轉化成α-酮丁酸，α-酮丁酸進一步轉化成異丁醇的前體物質α-酮異戊酸和異戊醇的前體物質α-酮異己酸[10]。目前LEU1基因對不同酒類影響均有較多研究[11-12]，但對米酒醉酒度影響的研究較少。

成簇規則間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPRassociated protein 9，CRISPR-Cas9）基因編輯技術利用向導核糖核酸（guide ribonucleic acid，gRNA）識別目標序列，依靠Cas9蛋白切割靶位點序列，使得細胞內的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）雙鏈斷裂，以此來激發非同源末端連接修復機制或同源重組修復機制，達到基因組高效定點敲除、定點敲入和基因修飾的目的[13-18]。與傳統的基因改造技術相比，CRISPR-Cas9系統具有精準、高效的優勢，避免了在基因改造過程中對釀酒酵母基因組的污染，使得改良酵母應用于釀造酒更加安全[19-20]。本研究以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）XF0為出發菌株，通過構建重組質粒p414-Cas9- BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX，建立通過博來霉素和G418抗生素來篩選釀酒酵母的基因敲除系統，以此獲得非營養缺陷型LEU1基因缺失的重組菌，探究LEU1基因缺失對高級醇生成的影響，通過優化高級醇之間的比例釀造低醉酒度米酒，為提高米酒品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒載體見表1。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

從美國國家生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnology information，NCBI）獲得釀酒酵母S288c的LEU1基因組序列（序列號：NC-001139），采用SnapGene 5.2.4軟件設計引物，并由上海生物工程技術有限公司負責合成。本研究所用引物見表2。

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.1.3 試劑

G418硫酸鹽：北京普博欣生物科技有限責任公司；博來霉素TM篩選試劑：賽默飛世爾科技公司；氨芐青霉素、D-山梨醇、乙酸丁酯、醋酸鋰：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；質粒小量快速抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：上海邁跟生物科技有限公司；Apex HF HS DNA聚合酶預混液-FS：湖南艾科瑞生物科技有限公司；Clon ExpressRII One Step Cloning Kit試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；2×GSTaq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）mix：北京金沙生物科技有限公司；酵母總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）快速抽提試劑盒、一步法反轉錄熒光定量試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；無酵母米酒酒曲：本實驗室。其他試劑均為國產分析純。

1.1.4 培養基

Luria-Bertani（LB）液體培養基[9]：酵母提取粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、蛋白胨10 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基[21]：酵母提取粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、無水葡萄糖20 g/L。

模擬發酵培養基[12]：麥芽粉130 g/L、白砂糖100 g/L。

以上對應固體培養基需添加2%瓊脂，以上培養基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.2 儀器與設備

Gel Doc 2000凝膠成像分析系統、MicroPulser電穿孔儀：伯樂生命醫學產品有限公司（bio-rad）；EPS300電泳儀：上海天能生命科學有限公司；TC1000-G PCR基因擴增儀：大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；GC8100氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：滕州市經緯分析儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 CRISPR-Cas9系統的構建

CRISPR-Cas9系統包括Cas9蛋白和gRNA，Cas9蛋白通過與gRNA結合實現基因編輯[22]。Cas9質粒的構建需要含有Cas9基因和博來霉素抗性基因。以質粒p414-Cas9為模板，Cas9-F和Cas9-R為引物，經PCR擴增得到含有Cas9基因的片段（8 330 bp）；以pPICZ（alpha）質粒為模板，BleoR-F和BleoR-R為引物，經PCR擴增得到兩端與含有Cas9基因片段末端20 bp序列同源的BleoR抗性基因片段（1 324 bp）；將兩個片段混合后，用同源重組試劑盒實現DNA的體外環化。直接轉化感受態大腸桿菌DH5α，取100 μL轉化液涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到Cas9表達質粒p414-Cas9-BleoR。

gRNA質粒的構建需要將LEU1基因設置為靶位點，并含有G418抗性基因。以質粒p426-gRNA為模板，gRNA-F和gRNA-R為引物，進行PCR擴增得到含有SNR52啟動子、gRNA scaffold及SUP4終止子的片段（4 953 bp）；以pUG6質粒為模板，kanMX-F和kanMX-R為引物進行PCR擴增，得到兩端與含有gRNA基因片段末端20 bp序列同源的G418抗性基因片段（1 482 bp）；將兩個片段混合后，用同源重組試劑盒實現DNA的體外環化。直接轉化感受態大腸桿菌DH5α中，取100 μL轉化液涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到gRNA表達質粒p426-gRNA-kanMX。

參照NCBI中釀酒酵母S288c基因組序列（序列號：NC-001139）信息，選取LEU1基因為目標基因，利用SnapGene軟件找到間隔序列前體旁基序位點（5-NGG或NAG結構）。通過融合PCR技術得到含有20 ntLEU1靶點序列的片段（60 bp），以質粒p426-gRNA-kanMX為模板，LEU1r-F和LEU1r-R為引物進行PCR擴增，得到與含有LEU1靶點序列片段末端20 bp序列同源的片段（6 375 bp）；將兩個片段混合后，用同源重組試劑盒實現DNA的體外環化。直接轉化感受態大腸桿菌DH5α，取100μL轉化液涂布于含有100mg/mL氨芐青霉素的LB平板，篩選得到能夠識別LEU1靶點的gRNA表達質粒p426-gRNA.LEU1-kanMX。

以釀酒酵母S288c基因組為模板，在LEU1靶點序列的上游和下游，分別用引物LT-F1和LT-R1、LT-F2和LT-R2進行PCR擴增得到上下游兩段同源臂，再通過融合PCR技術即可得到donor DNA。

1.3.2 釀酒酵母電轉化和陽性轉化子篩選

將1 μL純化后的p414-Cas9-BleoR質粒加到100 μL釀酒酵母XF0感受態進行電轉化，30 ℃溫育30 min后涂布于含有200 μg/mL博來霉素的YPD平板，30 ℃倒置培養2～3 d，挑取陽性菌落進行PCR驗證。在此酵母的基礎上制備感受態，加入1 μL純化后的p426-gRNA.LEU1-kanMX質粒和10 μL donor DNA進行電轉化，30 ℃溫育30 min，將溫育的轉化子涂布于含有100 μg/mL G418抗生素的YPD平板，30 ℃倒置培養2～3 d，挑取陽性菌落進行PCR驗證[23]。

1.3.3 基因敲除菌的篩選驗證

將菌落振蕩裂解，采用引物LEU1-A/LEU1-D進行菌落PCR驗證，確認donor DNA通過酵母的同源重組修復機制正確地整合到基因組上。用酵母總RNA快速抽提試劑盒提取陽性菌株總RNA，以其為模板再用一步法反轉錄熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR。

1.3.4 質粒丟失

將驗證陽性的菌株劃線至YPD平板，挑取單菌落接種于10 mL液體培養基，30 ℃、200 r/min條件下24 h，連續傳代培養12代以上，用含200 μg/mL博來霉素平板和100 μg/mL G418抗生素平板挑選質粒丟失、沒有抗性的重組酵母菌XF0-L[9]。

1.3.5 生長曲線的繪制

取3 mL酵母種子液接種到100 mL YPD液體培養基，30 ℃、200 r/min搖床培養，每2 h取2 mL菌液測定OD600nm值。

1.3.6 模擬發酵酒的制備

將斜面保存的酵母菌接種于YPD液體培養基，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h得到種子液。取3 mL種子液接種到100mL模擬發酵培養基，30℃靜置發酵4d，即得模擬發酵酒。

1.3.7 米酒的制備

將80 g米煮飯冷卻后置于500 mL燒杯中，加20%無酵母米酒酒曲和100 mL水，接種12%酵母種子液，33 ℃靜置發酵10 d，即得米酒。

1.3.8 分析方法

將模擬發酵酒液過濾后測定CO2產生量、pH值、還原糖含量、酒精度及高級醇；將米酒蒸餾出100 mL酒液，測定高級醇。

CO2產生量：稱量法測定[24]；還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定[25]；pH值：pH計測定；酒精度：酒精計測定；高級醇：氣相色譜內標法測定[26-27]。

1.3.9 數據處理

每個試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示，通過SPSS 29.0軟件進行顯著性分析，使用Origin pro 2021軟件繪制柱狀圖、生長曲線圖。

2 結果與分析

2.1 CRISPR-Cas9系統的構建

2.1.1 重組質粒p414-Cas9-BleoR的構建

重組質粒p414-Cas9-BleoR的構建結果見圖1。將重組質粒委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果顯示，質粒序列正確，證明重組質粒構建成功。

圖1 重組質粒p414-Cas9-BleoR的構建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid p414-Cas9-BleoR

2.1.2LEU1基因gRNA打靶質粒的構建

重組質粒p426-gRNA.LEU1-kanMX的構建結果見圖2。將重組質粒委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果顯示，質粒序列正確，證明重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒p426-gRNA.LEU1-kanMX的構建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid p426-gRNA.LEU1-kanMX

2.2 LEU1靶點基因敲除的結果

電轉化后篩選出重組菌株XF0-L，以其基因組DNA為模板，出發菌株XF0基因組DNA為陰性對照，采用引物LEU1-A和LEU1-D進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。由圖3可知，以重組菌株XF0-L和出發菌株XF0基因組DNA為模板分別擴增出1 279 bp（敲除510 bp）和1 789 bp片段，結果與預期一致，證明LEU1基因已成功被敲除。

圖3 重組菌株XF0-L的PCR驗證結果Fig. 3 PCR validation results of recombinant strain XF0-L

為進一步驗證LEU1基因是否被敲除，提取重組菌株XF0-L和出發菌株XF0的總RNA并反轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），以其為模板進行實時熒光定量PCR，分析LEU1基因的表達量，結果見圖4。由圖4可知，重組菌株XF0-L的LEU1基因表達量極低，這說明LEU1基因已成功被敲除。

圖4 出發菌株XF0和重組菌株XF0-L中LEU1基因表達量的測定結果Fig. 4 Determination results of LEU1 gene expression in original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.3 質粒丟失驗證

通過影印平板法篩選傳代丟失質粒的重組菌株XF0-L，結果見圖5。由圖5可知，重組菌株XF0-L在不含G418抗生素的平板上正常生長，在含G418抗生素的平板上不會生長或生長緩慢。這說明重組菌株XF0-L中質粒p426-gRNA.LEU1-kanMX已成功被去除。

圖5 重組菌株XF0-L質粒丟失驗證結果Fig. 5 Verification results of plasmid loss of recombinant strain xf0-l

2.4 LEU1基因敲除對菌株生長性能的影響

出發菌株XF0和重組菌株XF0-L的生長曲線見圖6。由圖6可知，LEU1基因缺失重組菌株XF0-L的生長速率與出發菌株XF0無明顯區別，說明LEU1基因缺失不影響酵母菌的生長性能。

圖6 出發菌株XF0和重組菌株XF0-L的生長曲線Fig. 6 Growth curves of original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.5 LEU1基因敲除對菌株發酵性能的影響

出發菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發酵酒的理化指標見表3。由表3可知，重組菌株XF0-L與出發菌株XF0模擬發酵后的CO2產生量、還原糖含量、pH值和酒精度均無顯著差異（P＞0.05），說明LEU1基因缺失對酵母發酵性能沒有影響。

表3 出發菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發酵酒的理化指標Table 3 Physicochemical indexes of simulated fermented wine with original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

2.6 LEU1基因敲除對菌株生成高級醇的影響

采用出發菌株XF0與重組菌株XF0-L進行發酵，模擬發酵酒和米酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇和總高級醇的含量檢測結果見圖7。

圖7 出發菌株XF0和重組菌株XF0-L模擬發酵酒（a）及發酵米酒（b）中的高級醇含量Fig. 7 Higher alcohols contents in simulated fermented wine (a)and fermented rice wine (b) with original strain XF0 and recombinant strain XF0-L

由圖7a可知，重組菌株XF0-L模擬發酵酒中正丙醇、異丁醇、總高級醇含量分別為26.27mg/L、88.64mg/L、256.72mg/L，比出發菌株XF0分別提高21.96%、85.25%、8.18%；異戊醇含量為141.82 mg/L，比出發菌株XF0降低15.53%。由圖7b可知，重組菌株XF0-L發酵米酒中正丙醇、異丁醇、總高級醇含量分別為268.67 mg/L、992.33 mg/L、2 277.33 mg/L，比出發菌株XF0分別提高14.17%、52.90%、10.53%，異戊醇含量為1 016.33 mg/L，比出發菌株XF0降低13.58%。重組菌株XF0-L模擬發酵酒和發酵米酒中的異戊醇/正丙醇分別為5.39和3.78，比出發菌株XF0分別降低30.99%、24.40%；異戊醇/異丁醇分別為1.60和1.02，比出發菌株XF0分別降低54.42%、43.65%。

結果表明，利用LEU1基因敲除重組菌株XF0-L發酵酒能夠提高正丙醇和異丁醇含量，降低異戊醇含量。這與LI W等[11-12]敲除釀酒酵母LEU1基因使得正丙醇、異丁醇提高，異戊醇降低的結論類似。這證明LEU1基因的缺失影響了蘇氨酸及高絲氨酸合成α-酮丁酸的代謝流，導致正丙醇升高；LEU1基因的缺失阻礙了α-酮異己酸的合成，直接導致異戊醇生成量降低，而下游代謝途徑受阻導致α-酮異戊酸的積累，造成異丁醇生成量提高。

3 結論

本研究基于CRISPR-Cas9基因編輯技術構建重組質粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX，建立了通過博來霉素和G418抗生素來篩選釀酒酵母的基因敲除系統，并通過電轉化成功獲得LEU1基因敲除的重組菌XF0-L。結果表明，菌株XF0-L與XF0模擬發酵酒的理化指標無顯著差異（P＞0.05），說明LEU1基因的缺失對釀酒酵母發酵性能無影響。相較于出發菌株XF0，重組菌株XF0-L模擬發酵酒中正丙醇（26.27 mg/L）和異丁醇含量（88.64 mg/L）分別提高21.96%和85.25%，異戊醇含量（141.82 mg/L）、異戊醇/正丙醇（5.39）、異戊醇/異丁醇（1.60）分別降低15.53%、30.99%、54.42%；相較于出發菌株XF0，重組菌株XF0-L發酵米酒中正丙醇（268.67 mg/L）和異丁醇含量（992.33 mg/L）分別提高14.17%、52.90%，異戊醇含量（1 016.33 mg/L）、異戊醇/正丙醇（3.78）、異戊醇/異丁醇（1.02）分別降低13.58%、24.40%、43.65%，說明重組菌株XF0-L能夠顯著降低發酵酒中的異戊醇/正丙醇、異戊醇/異丁醇從而降低醉酒度（P＜0.05），這為釀造低醉酒度高品質米酒提供了新的技術思路。綜上所述，利用CRISPR-Cas9技術改良釀酒酵母菌是優化釀造酒中不同高級醇比例實現降低醉酒度和提高口感品質的可行釀酒技術。