大紅浙醋酒精發酵階段非釀酒酵母產香機制研究

倪嘉迎，朱 玲，王鳳軍，修 雨，張 越，姚云平，趙國忠*

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；2.安琪酵母股份有限公司，江西 宜昌 443000）

食醋是我國傳統的調味品，具有悠久的歷史[1]。大紅浙醋是傳統食醋中的典型代表，其玫瑰紅色來源于氨基和羰基化合物之間的美拉德反應，發酵過程中不同于其他食醋的微生物群落豐度與組成也使得大紅浙醋具有獨特的風味[2，3]。大紅浙醋的主要釀造階段包括糖化階段、酒精發酵階段以及醋酸發酵階段[4]，其中酒精發酵階段的主要微生物為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），它能夠將糖類轉化為乙醇，為后續的醋酸發酵提供底物，而產香非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）的存在能夠提升食醋風味的豐富性和芳香性[5-7]。目前對大紅浙醋的研究主要集中于釀造工藝的改進以及微生物群落的組成，而對產香非釀酒酵母在其風味組成上的貢獻鮮有報道[8-10]。

產香非釀酒酵母是釀造工業廣泛應用的微生物菌株，這些酵母雖不像釀酒酵母那樣可以產生高濃度的乙醇，但可以產生具有不同香氣的風味物質[11-12]。袁英豪等[6]從20份醋源樣品中分離得到了一株產酯能力強，產香濃郁、柔和的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），其可產59種揮發性風味物質。韓志雙等[13]從醋醅中篩選得到的粟酒裂殖酵母（Scizosaccharomyces pombe）產酯量達到3.66g/L。這些非釀酒酵母的存在使得食醋的風味更加濃郁。

本實驗以大紅浙醋酒精發酵階段為研究對象，為了探討非釀酒酵母弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzeii）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）在大紅浙醋酒精發酵階段的產香機制，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定其還原糖代謝能力，失重法測定CO2生成能力，通過頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術測定其揮發性風味物質組成，研究非釀酒酵母對酒精的耐受性，以及在以大米為發酵底物的條件下對糖分的利用情況和揮發性風味物質的生成情況，旨在探究不同非釀酒酵母對大紅浙醋酒精發酵階段風味形成的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

大米（依嬌兒南陵大米）：市售；產香非釀酒酵母（弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii，Pf）、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans，Kt）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzeii，Pk）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera，Sf）），商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc），酒曲（Jiuqu，JQ）：安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SHQ630：本實驗室從大紅浙醋中篩選保藏。

1.1.2 化學試劑

2-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；乳酸（分析純）：天津市津東天正精細化學試劑廠；丙三醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；α-淀粉酶（10 000 U/g）：福建福大百特生物科技有限公司；糖化酶（100 000 U/g）：內蒙古霸潤酶制劑制作有限公司；酸性蛋白酶（150 000 U/g）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1115C超凈工作臺、ZWY-100H溫振蕩培養箱：上海智誠儀器有限公司；TQS-Ⅱ厭氧培養箱：上海龍躍儀器設備有限公司；GZX-9070MBE恒溫干燥箱：上海博訊實業有限公司；DY04-13-44-00 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海東亞壓力容器有限公司；CX23LEDRFS1C 生物顯微鏡：奧林巴斯（廣州）工業有限公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad Laboratories公司；DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭：日本島津公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；QP2010Ultral氣相色譜-質譜聯用儀：上海安譜實驗科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗模擬食醋酒精發酵

在浸泡過夜的大米中加入2倍體積的水，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后按照料液比1∶6（g∶mL）加滅菌蒸餾水，加入酶制劑（糖化酶0.2%、淀粉酶0.1%和蛋白酶0.05%）和0.1%的干酵母（4株非釀酒酵母、2株釀酒酵母以及酒曲），共七組試驗，模擬食醋酒精發酵。

1.3.2 分析檢測

（1）還原糖和CO2的測定

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定[14]；CO2采用失重法[15]。

（2）菌株耐乙醇和耐酸的測定

將實驗所用的四株非釀酒酵母、兩株釀酒酵母以及酒曲活化后，按2%的接種量分別接種至乙醇體積分數分別為0、6%、9%、12%、15%、18%的YPD培養基中；再按2%的接種量分別接種至pH值為3.6、3.4、3.2、3.0、2.8、2.6和自然pH（5.8）的YPD培養基中，28 ℃、120 r/min培養24 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

（3）揮發性風味物質的測定

揮發性風味物質采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法[16]。

頂空固相微萃取（HS-SPME）：將模擬食醋酒精發酵的糧食發酵液8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液2 mL于頂空瓶中，加入質量濃度為20mg/L的2-辛醇標準品30μL，并加入轉子。將頂空瓶密封后置于加熱磁力攪拌器上，60 ℃平衡20 min；然后插入經過老化的萃取頭，保持溫度不變，萃取30 min，250 ℃解吸15 min。

氣相色譜條件：使用Rtx-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序為初始溫度40 ℃保持3 min，以4 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min；再以8 ℃/min上升到250 ℃保持6 min；載氣為高純氦氣（He），恒定流速為1.0 mL/min，分流比為10∶1，進樣口溫度250 ℃，進樣時間1 min。

質譜條件：離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，溶劑延遲時間1.3 min，電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描質量范圍為33～500 m/z，掃描速率3.00次/s。

定性定量方法：根據美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17數據庫檢索選取相似度＞80%的化合物，并結合離子碎片及保留指數（retention index，RI）進行定性。以2-辛醇（20 mg/L）作為內標，通過內標法進行半定量。

1.3.3 香氣活性值的計算

香氣活性值（ordor activity value，OAV）是表征某一香氣成分對食物整體香氣特征貢獻度的指標，OAV=香氣成分質量濃度/感覺閾值[17]。某種香氣成分的OAV越大，其對食物的香氣體系的貢獻度越大，對食物香氣體系特征的形成作用也越大。當OAV＞1時，說明該揮發性香氣成分對主體香氣有顯著貢獻，是關鍵揮發性香氣成分。

1.3.4 數據處理

數據分析采用3次平行實驗，結果以“平均值±標準差”表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），Duncan 多重范圍檢驗顯著性水平設為P＜0.05。采用SPSS軟件27.0 進行統計分析，Origin 2023軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酒精發酵階段還原糖及CO2變化

酵母菌消耗葡萄糖生成乙醇的同時釋放出CO2，在還原糖減少的同時測量CO2的生成量可大致估算酵母菌的乙醇生成能力和發酵動力[18]。酒精發酵過程中還原糖含量和CO2生成量變化結果見圖1。

圖1 不同非釀酒酵母酒精發酵過程中還原糖含量（a）和CO2生成量（b）的變化Fig. 1 Changes of reducing sugar contents (a) and CO2 production(b) during alcoholic fermentation with different non-Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，不加菌只加酶制劑的空白組（CK）中，在發酵前4 d，還原糖含量由88.71 mg/L顯著增加到124.68 mg/L，第4天后增加趨勢變緩慢。在發酵前期，糖化酶和淀粉酶作用于淀粉分子的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，將淀粉大分子分解為小分子葡萄糖[19]，還原糖含量不斷升高。在發酵第5天，淀粉分子基本被分解完全，還原糖含量不再增加。在加菌的實驗組中，第2天的還原糖含量基本高于第1天，說明菌種用于生長繁殖消耗還原糖的速率低于淀粉分子分解產生還原糖的速率。菌株Sf酒精發酵過程中還原糖含量呈上升趨勢，這表明菌株Sf可在發酵過程中生成還原糖或者生成了能夠促進大分子淀粉水解成還原糖的酶，且在發酵過程中，這株酵母產生的CO2量相較于其他酵母少得多，這表明其利用還原糖生成乙醇的能力也較差，從而導致還原糖的生成速率高于其消耗速率，使得最終還原糖含量高于空白組。除這株酵母外，其他酵母在發酵兩天后還原糖含量均呈現下降的趨勢，且在第7天時，還原糖基本被利用完全，CO2也不再繼續生成。其中釀酒酵母SHQ630在發酵過程中還原糖被利用的最快，發酵結束后，其CO2生成量也最多，這表明SHQ630產乙醇能力最強。JQ和產香非釀酒酵母Pf、Kt、Pk與商業釀酒酵母Sc的CO2生成量基本相同，其中菌株Pk在24～60 h生成的CO2量較多，JQ、Pf、Kt、Sc的CO2主要在36 h內合成，這表明他們產乙醇能力也基本相同，但是乙醇生成速率不同。

2.2 酒曲和酵母的耐酸性和耐乙醇性

酵母菌適合在酸性環境下生存，一般最適生長pH為4.5～5.0，偏酸或偏堿環境都會影響酵母菌的正常生長繁殖和代謝。然而酵母自身在代謝過程中也會生成一些呈酸性的物質使pH降低[20]，在醋酸發酵過程中有時也需要酵母菌發揮作用，這就要求酵母菌必須具有一定的耐酸能力。耐乙醇是作為發酵用酵母必須具備的能力，在酒化階段酵母菌自身利用底物生成乙醇并積累增多，當達到一定量的時候這些乙醇會反過來抑制菌株本身的生長和代謝水平[21]，因此，能耐高濃度乙醇的菌株會在這種環境下獲得優勢，并且能夠生成更多的乙醇。

酒曲和6株酵母在不同乙醇體積分數和pH環境中的生長情況見圖2。

圖2 酒曲和不同酵母的酸（a）及乙醇（b）耐受性Fig. 2 Acid (a) and ethanol (b) tolerance of Jiuqu and different yeasts

由圖2a可知，菌株Sc和SHQ630具有最強的耐酸能力，在pH 2.6的強酸環境下，菌株Sc的OD600nm值為0.517，SHQ630的OD600nm值為0.501仍具有生長能力，而其他菌株在此酸度環境中基本已無法生長（OD600nm值幾乎為零）；酒曲（JQ）和菌株Sc有相似的耐酸性，但其在pH 3.0時活力急劇下降，pH 2.8時幾乎喪失了活力；在四株產香非釀酒酵母中，菌株Sf和Pk的耐酸性相對較好。這說明在與醋酸菌發酵的末期這四株產香非釀酒酵母和酒曲已經不能發揮作用了，而釀酒酵母還能生長。

由圖2b可知，菌株Pf和Kt的乙醇耐受性明顯高于菌株Sc、SHQ630和酒曲（JQ）；菌株Pf和Kt與商業釀酒酵母Sc的乙醇耐受性基本相同。因此，在還原糖充足的條件下，菌株Pf和Kt在酒精發酵末期高濃度乙醇的脅迫下在產乙醇方面更具優勢。

2.3 酒曲和酵母酒精發酵產物中揮發性風味物質的測定

酒曲和不同酵母發酵液中揮發性風味物質的GC-MS測定總離子流色譜圖見圖3，各揮發性風味物質檢測結果見表1，酒曲和不同酵母發酵液中揮發性風味物質種類及含量見圖4，產香非釀酒酵母揮發性風味物質韋恩圖見圖5。由圖3和表1可知，揮發性風味物質檢出最多的是產香非釀酒酵母Sf，共24種，其中OAV＞1的有13種，其次是商業釀酒酵母Sc，共檢出23種，其中OAV＞1的只有9種，雖然產香非釀酒酵母Pk只共檢出18種揮發性風味物質，但其OAV＞1的有12種。

表1 酒曲和不同菌株發酵液中揮發性風味物質測定結果Table 1 Determination results of volatile flavor substances in fermentation broth by Jiuqu and different strains

圖3 酒曲和不同菌株發酵液中揮發性風味物質GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in fermentation broth by Jiuqu and different strains analyzed by GC-MS

圖4 酒曲和不同酵母發酵液揮發性風味物質種類（a）及含量（b）Fig. 4 Types (a) and contents (b) of volatile flavor compounds in fermentation broth by Jiuqu and different yeasts

圖5 不同非釀酒酵母發酵液揮發性風味物質韋恩圖Fig. 5 Venn diagram of volatile flavor substances in fermentation broth by different non-Saccharomyces cerevisiae

由圖4a和圖4b可知，產酯種類最多的為產香非釀酒酵母Pk，共10種，酯類物質含量最多的為產香非釀酒酵母Pf，為10.64 mg/L；產醇種類最多的為商業釀酒酵母Sc，共7種，醇類物質含量最多的為產香非釀酒酵母Pk，為12.43 mg/L。

由圖5可知，油酸乙酯、亞油酸乙酯、異戊醇、2-甲基丁醇和苯乙醇是產香非釀酒酵母酒精發酵產物中所共有的揮發性風味物質。所檢測到的酯類物質呈現不同的水果香味和花香[22]；醇類物質是酵母代謝的次級產物之一，是酒中主要香氣物質，醇類物質呈現出的香味較為復雜[23]，如產香非釀酒酵母酒精發酵產物中所共有的揮發性風味物質異戊醇具有濃郁的威士忌香味，2-甲基丁醇具有酒香，而苯乙醇是果香和花香；幾組發酵液中醛、酸、酮、苯以及酚的種類和含量都較少，然而卻可以為風味做出獨特的貢獻。

酒曲和不同酵母發酵液中揮發性風味物質測定結果表明，酒曲和酵母的存在能夠豐富食醋的風味，產香非釀酒酵母能夠產生釀酒酵母所沒有的獨特風味，其中產香非釀酒酵母Sf產生風味最為豐富并且能生成具有丁香香料風味的4-乙基愈創木酚和4-乙烯基愈創木酚兩種獨特物質，能夠增添食醋的柔和感，起到呈香、助香的作用[24-26]。

3 結論

本實驗研究了酒曲和6株酵母在模擬食醋酒精發酵階段消耗還原糖產乙醇的能力以及在不同酸度和乙醇脅迫下菌株的生長情況，并以大米為底物，利用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術檢測酒精發酵初期各菌株產生的揮發性風味物質特征。結果表明，在酒精發酵過程中，菌株SHQ630產乙醇能力最強，菌株Pf、Kt及Pk的產乙醇能力與菌株Sc和酒曲（JQ）相當，菌株Sf產乙醇能力最弱。耐受性試驗結果表明，菌株Sf和Pk耐酸性較好，菌株Pf和Kt乙醇耐受性較好。GC-MS結果表明，菌株Sf、Pk、Pf及Kt發酵液分別共檢出揮發性風味成分24種、18種、13種、10種，菌株Pk產酯種類最多（10種）、產醇最高（12.43 mg/L），菌株Pf產酯最高（10.64 mg/L）。結果顯示，非釀酒酵母能夠提升大紅浙醋酒精發酵階段風味的豐富性和芳香性。在大紅浙醋酒精發酵階段，不同產香非釀酒酵母的存在，能夠使大紅浙醋酒精發酵階段的風味更加豐富、芳香，并能提升乙醇產量，使接下來的醋酸發酵階段，醋酸菌有更多的底物。