基于高通量測序山西老陳醋和懷仁醋酒精發酵初期酒醅真菌菌群研究

楊 玲，彭佳偉，郭旭凱，段 冰，邵 強，郭 睿，溫賢將，王 琪*

（1.山西農業大學 高粱研究所，山西 晉中 030600；2.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

山西老陳醋是“四大名醋”之一，以特定產區的高粱、麩皮為主要原料，以稻殼和谷殼為輔料，以大麥、豌豆制作的大曲作為糖化發酵劑，經酒精發酵后采用固態醋酸發酵，再經熏醅、陳釀等工藝釀制而成，具有綿、酸、甜、香、鮮等特點而備受消費者青睞[1]。但是山西老陳醋工藝（GB/T19777—2013《地理標志產品山西老陳醋》）的生產周期較長，因此，探索降低成本的工藝改進是企業生存發展的方向。而懷仁醋釀造工藝（T/SXMYT 0601—2020《懷仁醋釀造工藝規程》）將生產周期縮短了7 d，有效節省了企業的時間成本。懷仁醋釀造工藝在酒精發酵階段進行了改動，大曲種類是燈山井大曲，且用量縮減了近50%，另外還加入了淀粉酶、糖化酶和酵母菌；而且在發酵初期使用的是淀粉酶和糖化酶，后期再加大曲和酵母菌。

迄今為止，對山西食醋發酵過程中真菌菌群的研究對象主要為山西老陳醋，而針對改進的其他食醋工藝釀造過程中的真菌菌群的報道則很少[2]。傳統的純培養法由于耗時、耗力、結果不準確等缺點而限制了其在環境微生物樣品中的應用。近些年，基于免培養方法的分子生物學技術在釀造微生物研究中的應用越來越多，如溫度梯度凝膠電泳技術、單鏈構象多態性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）、變性梯度凝膠電泳技術（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）和基因文庫法等[3-5]。高通量測序技術具有效率高、成本低、準確率高等優點[6]，因此被廣泛用于食醋領域的研究[7-10]。

本研究以山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝酒精發酵初期的酒醅為研究對象，采用高通量測序技術，對比分析兩種工藝酒醅中真菌群落結構的差異，以期從真菌組成的角度為山西陳醋工藝的改進提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

酒醅樣品采集自山西省晉中市某醋廠。分別對山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝過程的酒精發酵第3天酒醅樣品進行采集，分別編號為S和X，各3個重復，采集后迅速置于液氮保存。

1.1.2 主要試劑

DP812土壤/糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase：北京全式金生物技術有限公司；超保真酶試劑盒：北京百靈克生物科技有限責任公司；e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit：美國Omega公司；Monarch DNA Gel Extractionn：北京鴻躍創新科技有限公司；瓊脂糖（西班牙）：北京博美富鑫科技有限公司；Invitrogen Collibri NGS文庫制備試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

ALS 1296聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、GelDoc 2000 UV凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；Nova-Seq6000測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅真菌菌群基因組DNA的提取

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌樣品3次，4 ℃離心（8 000×g，10 min）收集菌體。采用DP812土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒提取真菌菌群基因組DNA，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.2 酒醅真菌菌群ITS1區基因序列的PCR擴增及測序

以提取的基因組DNA為模板，采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌菌群的ITS1區基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（30 μL）：2×Mix 15 μL；上下游引物（2 mol/L）各3 L；基因組DNA 10 μL（5～10 ng）；雙蒸水（ddH2O）補至30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測合格的PCR擴增產物使用建庫試劑盒構建文庫，經Nova-Seq6000測序儀上機測序，委托百邁客生物工程有限公司完成。

1.3.3 酒醅真菌菌群序列分析

利用FLASH（version 1.2.11）對原始數據進行拼接[11]，再用Trimmomatic（version 0.33）進行質量過濾[12]，并采用UCHIME（version 8.1）去除嵌合體[11]，得到有效序列。利用USEARCH（version 10.0）將有效序列按97%的相似度進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，即分子水平的“種”[11]。在每個OTU中選取一條代表序列，通過UNITE（v.8.0）數據庫進行物種注釋[11]。

1.3.4 酒醅真菌菌群多樣性分析和統計分析

采用Mothur（http：//www.mothur.org//wiki/Main_Page）計算α-多樣性指數（香農（Shannon）指數和超1（Chao 1）指數）[13]。使用QIIME軟件進行β-多樣性分析[13]。利用edge R軟件進行統計分析。根據各個物種在各個樣品中的豐度以及變化情況，進行斯皮爾曼（Spearman）秩相關分析，并篩選相關性＞0.1且P＜0.05的數據構建物種相關性網絡圖。

2 結果與分析

2.1 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的高通量測序結果及OTU分析

兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的原始序列數、有效序列數和OTU數見表1。由表1可知，懷仁醋釀造工藝酒醅樣品真菌菌群的有效序列數及OTU數均高于山西老陳醋工藝酒醅樣品，說明懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的真菌種類更多。

表1 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群高通量測序結果及OTU數Table 1 High-throughput sequencing results and OTU number of fungal flora in fermented grains samples of two processes

兩種工藝酒醅樣品真菌菌群OTU的韋恩圖見圖1。

圖1 兩種工藝酒醅樣品真菌菌群OTU的韋恩圖Fig. 1 OTU Venn diagram of fungal flora in fermented grain samples from two kinds of processes

由圖1可知，兩種工藝酒醅樣品的共有OTU數有82個；山西老陳醋工藝酒醅樣品特有的OTU數僅為9個，而懷仁醋釀造工藝酒醅樣品特有的OTU數多達48個，說明真菌物種的數量受釀造工藝的影響較大。

對山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝得到的酒醅樣品的真菌菌群繪制稀釋曲線和豐度等級曲線，結果見圖2。

圖2 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的稀釋曲線（a）及豐度等級曲線（b）Fig. 2 Rarefaction curves (a) and Rank-abundance curves (b) of fungal flora in fermented grain samples from two kinds of processes

稀釋曲線反映測序數據量的飽和度，當曲線趨向平坦時，說明測序數量達到要求[1]。豐度等級曲線可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度，在橫軸方向，曲線的跨度越大，表示物種的豐富度越高；在縱軸方向上，曲線越平緩，表示物種分布越均勻[14]。由圖2a可知，隨著測序深度的增加，兩種工藝酒醅樣品真菌菌群的稀釋曲線呈逐漸平坦趨勢，說明本研究測序深度可以較全面地覆蓋酒醅的物種。由圖2b可知，懷仁醋釀造工藝的酒醅樣品真菌菌群的物種豐富度更高，而山西老陳醋工藝酒醅樣品真菌菌群的物種分布更均勻。

2.2 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的多樣性

2.2.1α-多樣性分析

Coverage是測序的庫容指標，數值越大，表明測序量越大，測序結果越可信；香農（Shannon）指數可以反映樣品的物種多樣性，其值越大，說明樣品的物種多樣性越高；超1（Chao1）指數即物種豐富度指數，可以預測樣品中真菌的總物種數，其值越高，豐富度越大[15]。兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的α-多樣性分析結果見表2。由表2可知，山西老陳醋和懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的Coverage均＞0.99，說明庫容均達到了要求，測序結果可信。就香農指數而言，懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的數值高于山西老陳醋工藝酒醅樣品，說明懷仁醋釀造工藝提高了真菌菌群的α-多樣性。與香農指數結果類似，懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的Chao1指數更高，表明懷仁醋釀造工藝有利于酒醅真菌菌群豐富度的提高。

表2 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的α-多樣性分析結果Table 2 Results of α-diversity analysis of fungal flora in fermented grain samples from two kinds of processes

2.2.2β-多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種對多維數據進行降維后提取出最主要元素的方法，結果以二維坐標圖反映，組成越相似的樣品在圖中的距離則越近[16]。基于真菌屬相對豐度對不同工藝酒醅樣品進行PCA，結果見圖3。由圖3可知，主成分1和主成分2對酒醅樣品中真菌菌群差異的方差貢獻率分別為98.96%和0.94%，累計方差貢獻率為99.90%，說明該結果包含了99.90%的原始信息，結果可信；兩種工藝酒醅樣品相距甚遠，說明二者的真菌菌群組成相差很大。

圖3 基于真菌屬相對豐度兩種工藝酒醅樣品的主成分分析結果Fig. 3 Principal component analysis results of fermented grain samples from two kinds of processes based on the relative abundance at genus level

2.3 兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群結構分析

2.3.1 基于門水平的真菌群落結構

采用擴增序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）分析從山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝酒醅樣品分別注釋到4個真菌門和5個真菌門，結果見圖4。

圖4 基于門水平兩種工藝酒醅樣品真菌菌群結構Fig. 4 Fungi community structure of fermented grain samples from two kinds of processes at phylum level

由圖4可知，兩種工藝酒醅樣品中共有的真菌有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）及未確定分類地位的類群（Unclassified），懷仁醋釀造工藝酒醅樣品特有的真菌門為球囊菌門（Glomeromycota）。子囊菌門在兩種工藝酒醅樣品中占絕對優勢，在山西老陳醋工藝酒醅樣品中的平均相對豐度為99.86%，而在懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中的平均相對豐度則為98.63%。魏莎莎[17]研究發現，紫林、東湖、通寶、四眼井、燈山井、山河、格萬、晉源、雙樓、玉根和寧化府大曲的絕對優勢真菌門均為子囊菌門；陳旭峰等[18]也研究發現，山西福源昌老陳醋大曲中子囊菌門為優勢菌門（94.74%）。這就很好地解釋了子囊菌門在酒精發酵初期酒醅中相對豐度最高的原因。其余真菌門相對豐度較小，山西老陳醋工藝酒醅樣品中擔子菌門、Unclassified、毛霉門、被孢霉門的平均相對豐度分別為0.07%、0.04%、0.03%、8.04×10-6%；而在懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中擔子菌門、Unclassified、毛霉門、被孢霉門及球囊菌門的平均相對豐度分別為1.11%、0.13%、0.07%、0.05%、7.88×10-5%。

2.3.2 基于屬水平的真菌群落結構

從山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝酒醅樣品分別注釋到46個屬和64個屬。由圖5可知，兩種工藝酒醅樣品的真菌組成差別非常大。在山西老陳醋工藝酒醅樣品中的第一優勢真菌屬為未確定分類地位類群（Unclassified）（82.82%），其次是維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）（7.40%），之后是紅曲霉屬（Monascus）（3.12%）、念珠菌屬（Candida）（2.91%）、曲霉屬（Aspergillus）（1.96%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（0.59%）、Others（0.51%）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）（0.44%）、鏈格孢屬（Alternaria）（0.18%）、枝孢霉屬（Cladosporium）（0.04%）等。而在懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中，第一優勢真菌屬則是哈薩克斯坦酵母屬（75.08%），其次是Unclassified（14.21%），之后是曲霉屬（3.48%）、念珠菌屬（1.95%）、青霉屬（1.35%）、Cystofilobasidium（0.96%）、嗜熱子囊菌屬（0.46%）、維克漢姆酵母屬（0.39%）、枝孢霉屬（0.24%）、Pseudallescheria（0.23%）等。范三紅等[2]研究發現，伊薩酵母屬（Issatchenkia）和曲霉屬是山西陳醋酒精發酵階段的優勢真菌屬；在發酵第3天，伊薩酵母屬的相對豐度達到67.2%。與本研究結果有很大區別，造成這些差異可能與生產工藝、原料、地理位置、氣候等多種因素有關。

圖5 基于屬水平兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群結構Fig. 5 Fungi community structure of fermented grain samples from two kinds of processes at genus level

作為山西老陳醋工藝酒醅樣品中的第二優勢真菌屬，維克漢姆酵母屬在提升紅心曲糖化力、液化力和酒體風味方面起到正向作用[19]。第三優勢真菌屬—紅曲霉能分泌酶、脂肪酸、有機酸等多種物質[20-21]。而懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中第一優勢真菌屬—哈薩克斯坦酵母屬被證實與清香型白酒酒醅中酸類代謝呈正相關，而與酯類代謝呈負相關[22]。第二優勢真菌屬—曲霉屬有很強的糖化酶和淀粉酶活力[23-24]，還與酸性蛋白酶和纖維素酶活力呈正相關[25]，也與異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯等風味成分的形成有關[26]，還與特香型大曲的酸度和品溫呈正相關[27]。第三優勢真菌屬—念珠菌屬，是濃香型大曲制備初始階段的差異真菌[25]，在特香型大曲中與酯化力、糖化力和液化力呈正相關[27]。由此可見，兩種釀造工藝酒醅樣品中優勢真菌屬的作用不同，從而導致成品食醋口感和風味的差異。

一般認為，大曲是食醋發酵過程中真菌種群的主要來源。本研究中山西老陳醋的大曲與汾酒大曲一脈相連。甄攀等[28]研究發現，汾酒大曲的優勢真菌屬是畢赤酵母屬（Pichia）和覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。羅惠波等[29]基于ITS基因文庫法研究發現，汾酒大曲的優勢真菌為畢赤酵母屬、根霉屬和橫梗霉屬（Lichtheimia）。綜上可知，不同醋廠的大曲中主要真菌差異較大。而本研究的懷仁醋釀造工藝中除使用燈山井大曲外，還額外添加了糖化酶與酵母菌。這就從源頭上造成了山西老陳醋工藝酒醅與懷仁醋釀造工藝酒醅中真菌群落結構的區別。

2.4 基于屬水平兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的方差分析

山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中真菌菌群在屬水平（P值最小的前20個物種）的組間方差分析結果見表3。由表3可知，在兩種工藝酒醅樣品中平均相對豐度差異極顯著的真菌屬有：Unclassifed、畢赤酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬、Cystofilobasidium、Cladosporium和被孢霉屬（Mortierella）（P＜0.01）。

表3 基于屬水平兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of fungi community in fermented grain samples from two kinds of processes at genus level

Unclassifed在山西老陳醋工藝酒醅樣品中的平均相對豐度（82.82%）極顯著高于懷仁醋工藝酒醅樣品的平均相對豐度（14.21%）（P＜0.01）。畢赤酵母屬（Pichia）在山西老陳醋工藝酒醅樣品中的平均相對豐度為0.02%，而在懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中未發現。而哈薩克斯坦酵母屬、Cystofilobasidium、Cladosporium、被孢霉屬則正好相反，在山西老陳醋工藝酒醅樣品中的平均相對豐度（0.44%、0.02%、0.04%、0）極顯著低于懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的相對豐度（75.08%、0.96%、0.24%、0.05%）（P＜0.01）。NIEZ Q等[10]對山西老陳醋的研究發現，Cladosporium在酒精發酵初期未檢測到，只出現在醋酸發酵初期。

2.5 基于屬水平兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群的相關性分析

物種相關性網絡圖是根據每個樣品中每個真菌屬的豐度及變化情況繪制的，可直觀明確物種在環境中的共存關系[30]，正相關的物種間是互利共生關系[31]，而負相關的物種間是競爭關系[32]。對山西老陳醋和懷仁醋兩種工藝酒醅樣品真菌中相關性最高的前50個真菌屬（P＜0.05）繪制相關性網絡圖，結果見圖6。

圖6 基于屬水平兩種工藝酒醅樣品中真菌菌群間的相關性分析網絡圖Fig. 6 Network diagram of correlation analysis between fungi community in fermented grain samples from two kinds of processes at genus level

由圖6可知，與其他物種聯系度居首的是Cystofilobasidium，聯系度排第二的是Metarhizium，聯系度排第三的是Kodamaea、Pseduallescheria和Rhizomucor。在山西老陳醋工藝酒醅樣品中，僅次于Unclassified、平均相對豐度排第二的維克漢姆酵母屬，與絲孢畢赤酵母屬（Hyphopichia）呈高度正相關，與離蠕孢屬（Bipolaris）呈正相關；而與Rhizomucor呈負相關。絲孢畢赤酵母屬在特香型大曲中與酯化力、糖化力、酸度和品溫呈正相關；Rhizomucor與特香型大曲的酸度和品溫呈正相關[27]。平均相對豐度排第三的紅曲霉屬與單端孢屬（Trichothecium）呈正相關，單端孢屬是濃香型白酒新窖泥的優勢真菌屬[34]；而與Arcopilus呈高度負相關，與德巴利酵母屬（Debaryomyces）呈負相關，德巴利酵母屬是醬香型青稞大曲中的優勢屬[35]。在懷仁醋釀造工藝的酒醅中，平均相對豐度排第一的哈薩克斯坦酵母屬與被孢霉呈高度正相關，與Millerozyma呈正相關；平均相對豐度排第二的曲霉屬與嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）呈高度正相關，與枝孢霉屬、青霉屬、Meyerozyma和Rhizomucor呈正相關；而與畢赤酵母屬呈負相關。平均相對豐度第三的念珠菌屬與單端孢屬呈正相關；而與Didymella和Castanediella呈負相關。

綜上，食醋釀造過程中真菌類群的變化會對相關酶系的活力、大曲的理化性質造成直接影響，從而進一步影響發酵產物的質量。因此，后續研究食醋釀造過程中的真菌之間的作用方式對食醋釀造工藝的改進具有直接指導意義。

3 結論

本研究利用高通量測序技術對山西老陳醋工藝和懷仁醋釀造工藝酒精發酵初期酒醅樣品的真菌菌群多樣性及組成進行分析。結果發現，懷仁醋釀造工藝酒醅樣品的真菌菌群多樣性及豐富度更高。兩種工藝酒醅樣品的真菌菌群組成有較大差異，山西老陳醋工藝酒醅樣品的優勢類群分別是未確定分類地位（Unclassified）、維克漢姆酵母屬、紅曲霉屬等；而在懷仁醋釀造工藝酒醅樣品中的優勢類群則分別是哈薩克斯坦酵母屬、Unclassified、曲霉屬等。在兩種工藝酒醅樣品中差異顯著的真菌類群為Unclassifed、畢赤酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬、Cystofilobasidium、Cladosporium和被孢霉屬。物種相關性分析表明，Cystofilobasidium、Metarhizium、Kodamaea、Pseduallescheria和Rhizomucor與其他物種聯系密切。