新型生物反應器對濃香型酒醅微生物群落及理化指標的影響

莫玉婷，袁思棋，周 帥，稅梁楊，楊明永，劉 君，楊周林，范宏筠*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.瀘州國之榮耀酒業有限公司，四川 瀘州 646000；3.瀘州老窖集團有限責任公司，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000）

據國家統計局和中國酒業協會的相關數據顯示：2022年全國白酒產量為671.2萬kL，其中上半年濃香型白酒產量375.1萬kL，占白酒總產量55.88%。濃香型白酒釀造原料為單糧或多糧，以泥窖作為發酵容器，在微氧或無氧的條件下厭氧菌或兼性厭氧菌將可發酵性糖轉化成乙醇和風味物質，形成具有獨特風味的白酒[1-2]。濃香型白酒窖池發酵過程中絕對厭氧或微氧狀態促進乙醇和風味物質的生成和轉化，從而要求窖池具有良好的密封性，即濃香型白酒窖池的封窖泥質量和生產過程中窖泥維護等對窖池發酵有至關重要的作用。為提升濃香型白酒固態發酵窖池釀造密閉性，相繼對濃香型白酒的封窖方式進行探索和實驗。劉念等[3-4]對濃香型白酒的密封方式進行了初步研究，相繼發明了濃香型固態發酵容器；蘇占元等[5-6]探究了生物反應器和發酵窖池中酒醅理化變化和白酒產量和品質，表明生物反應器在白酒釀造生產實踐是可行的。羅杰等[7]運用生物反應器進行濃香型白酒發酵生產并采取不同控溫措施對比發酵工藝白酒品質，結果顯示相較于對照組而言，控溫窖池的窖泥和酒醅經過發酵后出酒率和酒質最優。相較于傳統窖皮泥和塑料薄膜封窖方式而言，白酒釀造生物反應器不僅密閉性好、衛生、提高了白酒產量，而且能夠有效利用土地資源，節約后續護養資金和人工成本，進一步推動了生產機械化[8]。

酒醅是白酒釀造的物質載體，是白酒釀造過程生化反應、物質循環、能量轉換、代謝產酒產香等轉化介質，即酒醅質量與白酒品質密切相關[9-10]。黃水是酒醅發酵的副產物，其不僅富含醇、酸、醛、酯等呈香呈味物質，還含有大量有益微生物、糖類物質、含氮化合物以及少量的單寧、色素等有機物[11]。隨著對黃水的不斷研究，黃水在白酒釀造中具有不可替代的價值，將其逐漸運用于白酒釀造和窖池養護過程，促使黃水重復應用。

高通量測序技術已經被廣泛運用到白酒釀造的微生物群落結構分析[12-13]，有利于對白酒酒醅在發酵過程中微生物群落組成及群落演替研究。本研究以新型生物反應容器和傳統窖池為研究對象，探索傳統窖池生產工藝（對照組）、新型生物反應器生產工藝（實驗組I），以及在此基礎上優化后的白酒新型生物反應器生產工藝（實驗組II）對發酵酒醅中微生物的影響，聯合酒醅理化指標和微生物指標，運用高通量測序技術分析酒醅發酵過程中微生物群落結構和群落動態變化規律，探討新型生物反應器優化工藝的生產實踐可行性；同時，利用冗余分析（redundancy analysis，RDA）技術綜合分析理化因子與微生物生長演替的相關性，以期在生物反應器基礎優化生產工藝而提升酒醅發酵狀態，進而為新型生物反應器在白酒釀造生產過程中應用提供理論指導，進一步推動白酒企業機械化、自動化生產，提高白酒產量和品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅：四川省瀘州市某酒廠。選用9口窖齡和出酒率基本一致的窖池用于3組研究實驗中，每組工藝設置3口平行組且做3次重復試驗，共取54個樣品用于理化與微生物檢測。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.RSoil DNA Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；次甲基蘭、酚酞、鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004B 電子天平：上海市安亭電子儀器廠；101-E 電熱鼓風干燥箱：北京市永光醫療儀器有限公司；WST-411數顯溫度計：上海博取儀器有限公司；GeneAmp9700R型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI 有限公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序儀：美國Illumina公司；NanoDrop2000 DNA濃度測定儀：美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與保存

取樣方法參照五點取樣法分別對出、入窖酒醅面、上、下3層分別取樣并置于無菌取樣袋中立即密封混合均勻。將混勻后酒醅樣品平均分成2 份裝入無菌袋并冷藏，一份用于理化實驗分析（4 ℃保存），一份用于高通量測序（-20 ℃保存）。樣品根據分組和層面進行編號，樣品Ⅰ（入窖：C1、C2、C3；出窖：C_1、C_2、C_3），樣品Ⅱ（入窖：N1、N2、N3；出窖：N_1、N_2、N_3），樣品Ⅲ（入窖：S1、S2、S3；出窖：S_1、S_2、S_3）。羅馬數字I、II、III分別代表傳統窖池生產工藝、新型生物反應器生產工藝、優化白酒新型生物反應器生產工藝。新型生物反應器示意圖見圖1[4]。

圖1 新型生物反應器裝置示意圖Fig. 1 Diagram of new bioreactor device

對照組窖池為傳統黃泥＋窖皮封窖工藝；實驗組I為新型生物反器封窖工藝；實驗組II根據實驗I裝置經過改造優化后形成具有黃水處理和控溫、保溫設施的新型生物反應器。3組工藝的發酵時間均為60 d，冬季頂溫為32～35 ℃。

1.3.2 酒醅理化指標測定

酒醅溫度測定：使用數顯溫度計對窖池和容器內發酵酒醅實時測溫；水分含量：參照國標GB 5009.3—2016《食品中水分含量的測定》中的第一法直接干燥法進行測定；酸度、淀粉含量、還原糖含量的測定：參照《白酒生產技術全書》[1]。酸度測定：采用氫氧化鈉滴定法；淀粉含量測定：采用酸水解法；還原糖含量的測定：采用斐林試劑滴定法。

1.3.3 樣品總DNA提取

本實驗采用E.Z.N.A.RSoil DNA Kit DNA 抽提試劑盒提取樣品中的總DNA，提取步驟參考試劑盒說明方法，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量，并用NanoDrop 2000檢測DNA 濃度和純度。

1.3.4 PCR擴增

細菌采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對V3-V4可變區進行PCR 擴增，真菌采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增ITS1區。

細菌PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，35 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），再72 ℃穩定延伸10 min，10 ℃保存直至反應結束；真菌PCR擴增條件參照衛春會等[14]實驗方法。

PCR擴增體系：上、下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，5×FastPfu緩沖液吸取4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）取2 μL，Fast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模版DNA 10 ng，添加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。

1.3.5 高通量測序

質檢合格的PCR擴增樣品送至上海美吉生物技術有限公司進行高通量測序和生物信息學分析。生物公司返回測序數據后，使用Fastp（version 0.19.6）軟件對雙端原始測序序列進行質控，FLASH（version 1.2.11）軟件進行拼接，過濾reads尾部質量值20以下的堿基，去除含N堿基的reads，根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列。然后，使用Qiime2流程中的Deblur插件對質控拼接之后的優化序列進行降噪處理后得到擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）。物種分類學分析基于Sliva 16S rRNA基因數據庫（v138），通過Qiime2中的Naivebayes分類器，置信度閾值為0.7，對ASVs進行數據分析。

1.3.6 數據處理

含高通量測序數據于上海美吉生物醫藥科技有限公司的多樣性云分析平臺進行統計分析及數據可視化。Alpha多樣性分析Chao1、香農（Shannon）等指數運用Mothur軟件計算，Wilxocon秩和檢驗進行α-多樣性的組間差異分析。使用RDA技術來反映酒醅理化指標與微生物群落結構的關系。酒醅理化指標則是運用IBM SPSS Statistics 27.0和Origin 2021進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 酒醅理化指標分析

2.1.1 不同生產工藝條件下酒醅溫度的變化

3種不同生產工藝條件下，酒醅溫度的變化見圖2。由圖2可知，發酵溫度整體呈現先上升后降低的趨勢，符合白酒釀造生產溫度變化趨勢。3種生產工藝入窖酒醅溫度范圍在20.0～23.9 ℃，實驗II入窖溫度較高（23.9 ℃）。在0～30 d發酵過程中，窖池內發酵溫度均呈現上升趨勢，其中實驗組II溫度上升幅度大。發酵時間達到15 d時，實驗組I窖池和對照組窖池溫度上升幅度放緩，直到27～28 d，酒醅溫度上升到最高，分別為33.0 ℃和33.2 ℃，后緩慢降溫。但是，實驗組II酒醅溫度15 d后繼續上升，到第30天達到頂溫35.5 ℃，后緩慢回落，直至第60天溫度回落至30.8 ℃。實驗組II在第35天經過生物反應器中控溫裝置調控處理后，溫度呈現小幅度上升趨勢，且該工藝封窖下保持適宜溫度時間更長。結果表明，對照組和實驗組在發酵周期內，溫度變化趨勢基本一致，但是優化新型生物反應器生產工藝的保溫效果更好。

圖2 酒醅溫度在三種不同生產工藝條件下的變化Fig. 2 Changes of temperature of fermented grains under 3 different production process conditions

2.1.2 不同生產工藝條件下酒醅理化指標的變化

將出、入窖酒醅樣品進行理化指標分析，結果見圖3。水分含量是釀酒生產活動的必須條件之一，且濃香型入窖酒醅水分含量合適范圍為52%～56%[1]。由圖3a可知，3組入窖酒醅水分含量為53.2%～55.8%，出窖酒醅水分含量為58.5%～62.3%。從整體上看，出窖酒醅水分含量均高于入窖酒醅，且增長了約5.3%～6.5%。3種不同生產工藝中，實驗組II出窖酒醅下層水分含量（62.3%）比對照組（60.0%）、實驗組I（60.9%）稍高，其中，水分含量下層（62.3%）＞上層（60.1%）＞面層（59.6%），實驗組II下層出窖水分含量最高，達到62.3%，說明實驗組II封窖模式下，密封性效果最好。

圖3 酒醅水分（a）、酸度（b）、淀粉（c）、還原糖（d）含量在三種不同生產工藝條件下的變化Fig. 3 Changes of moisture (a), acidity (b), starch (c) and reducing sugar (d) contents of fermented grains under 3 different production process conditions

在適當的酸度范圍內，酸度增長對抑制雜菌生長和糊化作用起著積極影響。由圖3b可知，酒醅酸度隨發酵時間延長而顯著增大，且出窖酒醅下層樣品酸度值比面層、上層更大，這可能是下層醅長期與黃水浸泡的因素引起酸度較高。出窖酒醅酸度為2.28～4.24 mmol/10 g，對照組與實驗組II面層、下層酸度分別為2.28 mmol/10 g、3.39 mmol/10 g和3.81 mmol/10 g、4.24 mmol/10 g，兩組釀造工藝存在顯著差異（P＜0.05），然而，實驗組II中下層出窖醅S_3的酸度高達4.24 mmol/10 g，可能是采用黃水控溫和保溫裝置后，持續穩定的溫度和豐富的營養成分利于微生物生長和代謝，促進濃香型白酒風味物質生成。

淀粉與還原糖在白酒釀造中為微生物提供營養成分和發酵能量，入窖淀粉含量應在16%～22%[1]。由圖3c和圖3d可知，酒醅淀粉與還原糖含量隨發酵而呈現下降趨勢，且各層酒醅淀粉含量均大幅度降低且下層消耗量最多，對照組與實驗組II下層酒醅淀粉含量由18.76%和20.65%分別下降至10.72%、9.36%，兩者差異顯著（P＜0.05）。由圖3d可知，還原糖含量由1.76%～2.06%降至0.09%～0.27%，其中，實驗組II各層淀粉消耗量均比其余兩組消耗多，對照組、實驗組I上層出窖醅還原糖分別為0.23%、0.31%，而實驗組II還原糖由1.93%降至0.09%，三組生產工藝還原糖含量差異顯著（P＜0.05）。結果表明，實驗組II生產工藝在保溫裝置的作用下，微生物代謝旺盛，持續利用淀粉類物質和可發酵性糖，從而一定程度上降低了殘余糖類，對濃香型白酒酒醅作用效果最佳。

2.2 酒醅微生物α-多樣性指數分析

采用降噪后的樣本擴增子序列變體（ASV）序列進行酒醅微生物α-多樣性分析，酒醅樣品中細菌和真菌微生物的α-多樣性分析結果分別見表1和表2。細菌測序共得到有效序列790 608條；真菌測序共得到有效序列1 234 842條。ASV數是樣本擴增子序列數；Sob指數和Chao1指數均反映群落豐富度；香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數表示群落多樣性反映譜系多樣性[15]，且Simpson指數與Shannon指數含義相反，Simpson指數越大，說明群落多樣性越低。

表1 酒醅細菌Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity indexes of bacteria of fermented grains

表2 酒醅真菌Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity indexes of fungi of fermented grains

由表1可知，所有樣本覆蓋率均達到99.9%以上，說明測序結果可以全面準確地反映物種信息。整體來看，酒醅發酵過程中細菌菌群入窖樣品的豐富度和多樣性均高于出窖樣品；對照組、實驗組II的出窖酒醅真菌群落數略高于入窖酒醅，實驗組I出窖酒醅相較入窖酒醅菌落數呈下降趨勢。結果表明，隨著酒醅發酵的進行，微生物生長和代謝，以及溫度、酸度等理化指標的變化而影響酒醅中微生物群落多樣性，從而利于釀酒的微生物生長。

由表1可知，物種豐富度和多樣性隨發酵進行呈下降趨勢，3組入窖酒醅的細菌群落豐富度（Sob指數、Chao1指數）和細菌群落多樣性（Shannon指數）整體上均高于出窖酒醅樣品，說明入窖酒醅微生物豐度和多樣性高于出窖酒醅，推測可能是由于發酵前期營養物質充分且入窖微生物主要來源于大曲和窖池，隨著發酵后期氧氣和底物的減少以及環境變化，不適應發酵環境微生物被淘汰，出窖酒醅多樣性及豐度隨之降低。其中對照組入窖酒醅的上、下層微生物物種豐富度最大，發酵結束后出窖醅最大豐富度為面層，可能是隨著發酵時間的延長，實驗組面層酒醅原料大量被利用，形成風味化學物質，部分微生物生長受到抑制；實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ入窖酒醅面、上兩層物種豐富度和多樣性最高，出窖醅則存在差異，其中，實驗組Ⅰ物種豐度以面層和下層較高，實驗組Ⅱ物種豐度則以上、下層較為突出，說明優化后的白酒新型生物反應器可使上、下層的溫度更有利于微生物生存。各層不適應發酵環境的細菌群落不斷減少，3組樣品出窖酒醅微生物豐富度和多樣性則是實驗組Ⅱ＞對照組＞實驗組Ⅰ。

由表2可知，對照組出窖酒醅的ASV數增加，面層出窖酒醅多樣性指數降低，上、下層出窖酒醅多樣性則是升高；實驗組Ⅰ上、下層入窖酒醅多樣性高于出窖酒醅，而面層物種多樣性發酵后增加；實驗組Ⅱ各層出窖酒醅多樣性均高于入窖酒醅。Simpson 指數越小，多樣性越大，對照組、實驗組Ⅱ總體上顯示出窖各層酒醅樣品真菌群落多樣性大于入窖，說明發酵后期微生物群落分布更均勻；實驗Ⅱ組則是隨發酵時間推移真菌群落數逐漸減少。

2.3 稀釋曲線

稀釋曲線主要利用各樣本在不同測序深度時的微生物Alpha多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性，可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度和多樣性，亦可證明樣本的測序數量是否合理。多樣性指數Sob反映實際觀測到的物種數，以此構建稀釋曲線見圖4。

圖4 基于Sob多樣性指數構建細菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig. 4 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) based on Sob diversity index

由圖4可知，對照組和實驗組的稀釋曲線隨著序列數的增加趨于平坦，說明測序數據量合理。

2.4 酒醅微生物群落結構分析

2.4.1 酒醅發酵過程中細菌群落組成分析

根據降噪得到的ASV在門分類水平的物種分類信息檢出酒醅細菌構成有33門、93綱、227目、374科、717屬。不同釀造工藝中發酵前后對照組和實驗組酒醅樣品細菌的相對豐度，選取樣品在門、屬水平上相對豐度≥1%（相對豐度＜1%為others）ASV生成相對豐度堆積柱狀圖分別見圖5和圖6。

圖5 基于門水平酒醅發酵過程中細菌群落結構Fig. 5 Bacterial community structure of fermented grains during fermentation process based on phylum level

圖6 基于屬水平酒醅發酵過程中細菌群落結構Fig. 6 Bacterial community structure of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖5可知，酒醅在發酵過程中主要的細菌有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota），整個發酵過程中厚壁菌門（Firmicutes）是豐度最高的優勢門，并且在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為73.02%、69.65%、77.95%；變形菌門（Proteobacteria）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為20.84%、17.83%、16.42%，放線菌門（Actinobacteriota）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ組平均相對豐度分別為5.41%、8.58%、4.97%。經過對比發現，厚壁菌門（Firmicutes）在對照組、實驗組Ⅱ的相對豐度明顯高于實驗組Ⅰ，變形菌門（Proteobacteria）在對照組中略高于實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ，而放線菌門（Actinobacteriota）在實驗組Ⅰ高于對照組、實驗組Ⅱ。

通過對比3組生產工藝，3組的出窖酒醅中厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度明顯高于入窖酒醅，而變形菌門（Proteobacteria）則與之相反；對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ中厚壁菌門（Firmicutes）平均相對豐度分別由55.30%、58.70%、63.47%上升到90.74%、80.61%、92.44%，變形菌門（Proteobacteria）平均相對豐度分別由38.66%、29.58%、30.41%下降至6.20%、13.25%、5.07%。隨著發酵時間的延長，酒醅中細菌豐度隨時間而變化，厚壁菌門（Firmicutes）在發酵過程中整體呈大幅度上升趨勢，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度則顯著降低，雜菌減少，與宋建陽等[16]研究結果基本一致。由此可知，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是發酵過程中常見的細菌門，二者主要來源于大曲優勢微生物，且VITAL M等[17]研究發現，厚壁菌門（Firmicutes）是主要合成丁酸的潛力細菌，同時上述兩種菌富集可能是酒醅高醇、高酸的主要因素[18]。

由圖6可知，酒醅發酵過程中共檢出21個優勢細菌屬，且各樣品細菌菌落組成相似，但豐富度存在差異。其中，優勢細菌屬主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus），與李澤等[19]研究結果基本一致。上述5類細菌優勢屬在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ中平均相對豐度分別達到78.80%、68.89%、82.35%；酒醅入窖發酵前后，乳桿菌屬（Lactobacillus）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由6.13%上升到90.47%，14.66%上升到80.37%，3.02%劇增到92.30%，與陳進等[20]研究結論基本一致。經過對比發現，不同酒醅層的群落結構無明顯差異，而不同發酵階段酒醅的微生物菌群差異相對較大。泛菌屬（Pantoea）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由18.17%、9.44%、14.82%均降至0；魏斯氏菌屬（Weissella）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由12.73%、18.87%、16.71%均降至0，葡萄球菌屬（Staphylococcus）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別由10.08%、10.72%、20.82%降至0.01%，芽孢桿菌屬（Bacillus）在3組酒醅中平均相對豐度分別由19.83%下降到0.17%，3.69%下降到0.03%，16.97%下降到0.02%。

由此可得出，當酒醅入窖發酵后，隨著發酵時間推移和酒醅理化性質的變化，酒醅中優勢細菌屬相對豐度有顯著性變化，即酒醅發酵前細菌優勢菌屬由泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）所構成，而酒醅發酵后則由乳桿菌屬（Lactobacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）和潘多拉菌屬（Pandoraea）所取代，且酒醅發酵結束后乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優勢，也是酒醅發酵后豐度最高的優勢菌屬。乳桿菌屬（Lactobacillus）微生物代謝產物為乳酸及乙酸等有機酸能力，代謝過程還可以這些有機酸為底物發生酯化反應生成乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質，為白酒風味的形成提供前體物質，提升相應酒體中風味成分[21-24]。與實驗組Ⅰ相比，對照組、實驗組Ⅱ發酵前乳桿菌屬（Lactobacillus）較少；發酵后大幅度增長，對照組、實驗組Ⅱ乳桿菌屬（Lactobacillus）多于實驗組Ⅰ，其中實驗組Ⅱ乳桿菌屬（Lactobacillus）增長最多。乳桿菌屬（Lactobacillus）是酒醅發酵中重要呈香脂肪丁酸的合成代謝主要貢獻菌[25]，其在發酵中后期大量繁殖，是由于發酵過程中微生物代謝導致還原糖分解生成乙醇和乳酸等物質[26]，酒醅顆粒間隙中的氧氣近乎消耗殆盡，以及產物的抑制作用使得霉菌和酵母活性減弱，產酸菌開始大量生長繁殖，總酸含量快速上升。因此，乳桿菌屬（Lactobacillus）的大量生長可作為酒醅在發酵后期的標志性象征，優化后的生物反應器在酒醅發酵過程中能起到較好封閉效果，加上其自帶的保溫、降溫裝置能夠有效控制酒醅發酵過程，有一定促進效果；隨著發酵階段推移，3組酒醅樣品中物種多樣性顯著下降，大量原始微生物被抑制、淘汰，適合生長的微生物富集成優勢群，相對豐度得以提高[27]，其中實驗組Ⅱ相對豐富度最高，雜菌大量減少；實驗組Ⅰ相對豐度最低。

2.4.2 酒醅發酵過程中真菌群落組成分析

真菌內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）分析共檢測出6門、23綱、51目、98科、178屬。物種相對豐度堆積圖根據物種注釋結果分別見圖7和圖8。選取樣品在門、屬水平上相對豐度≥1%的物種（相對豐度＜1%合并為others）而生成的不同工藝中發酵前后酒醅真菌的相對豐度。

圖7 基于門水平酒醅發酵過程中真菌群落結構Fig. 7 Fungal community structure of fermented grains during fermentation process based on phylum level

圖8 基于屬水平酒醅發酵過程中真菌群落結構Fig. 8 Fungal community structure of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖7可知，酒醅在發酵過程中檢測出優勢真菌門3個，主要真菌為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），子囊菌門（Ascomycota）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的平均相對豐度分別為94.75%、93.69%、97.59%，占據絕對優勢；而擔子菌門（Basidiomycota）在對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的平均相對豐度分別為4.91%、6.10%、2.04%。子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）主要來源于大曲微生物且是大曲在酒醅發酵中的優勢真菌門，與李義等[28]研究結果基本一致。

所有酒醅的微生物隨著發酵時間推移，子囊菌門（Ascomycota）相對豐度增加，擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度降低。入窖酒醅開始發酵時子囊菌門（Ascomycota）比例最高，表明其能在該釀造環境條件下生長代謝，將原料中的淀粉與蛋白質分解成葡萄糖與氨基酸。子囊菌門（Ascomycota）在整個發酵過程中是豐度最高的優勢門，占據了酒醅發酵前后真菌絕對優勢門的地位，高含量的子囊菌門（Ascomycota）對驅動酒醅活性微生物群落變化起重要作用[25]。擔子菌門（Basidiomycota）在發酵中相對豐度逐漸減低，原因可能為擔子菌門（Basidiomycota）是好氧性微生物，隨著發酵時間增加，氧氣含量不斷減少且養分不斷消耗，導致真菌含量減少[29]。

由圖8可知，酒醅樣品檢出優勢真菌屬17個，主要優勢真菌屬包括未分類的曲霉菌科（unclassified_f__Aspergillaceae）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），這4種真菌屬在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ平均相對豐度分別為70.72%、63.82%、77.47%。曲霉屬在釀造過程中能產生糖化酶、液化酶、蛋白酶等多種酶，降解原料，提高出酒率以及生香[30-31]。隨著發酵時間的推移，unclassified_f__Aspergillaceae在發酵前期豐度較高，在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ相對豐度分別達到41.75%、32.40%、60.84%，對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ隨發酵后相對豐度分別降低至15.52%、13.87%、22.96%，可能是unclassified_f__Aspergillaceae菌群不適應高酸、高醇、厭氧環境而生長代謝受阻礙或死亡，該實驗結果與車路萍[32]研究結果基本一致。其次，伊薩酵母屬（Issatchenkia）在對照組發酵過程中呈下降趨勢，下降了5.67%；其在實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ的相對豐度上升，分別由14.72%、7.59%上升至25.34%、33.97%，與以往的研究結論相同[33]，其對酒醅的香氣形成具有重要作用[34-36]。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）在酒醅樣品對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ發酵過程中整體呈現下降趨勢；哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）在3組樣品的發酵前期未檢出，但隨著發酵過程的進行而不斷增長，其在對照組相對豐度最高，達到51.56%，該菌主要存在于C_1和C_2酒醅樣品中，可能原因是面層、上層酒醅淀粉殘余量充足且氧氣含量較高利于生長，實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ分別上升至16.26%、17.60%。因此，unclassified_f__Aspergillaceae和伊薩酵母屬（Issatchenkia）為酒醅發酵中優勢真菌，對白酒糟醅形成更多風味物質起到積極作用。

2.5 理化指標與優勢微生物屬相關性分析

根據獲取的ASV數據集，將不同生產工藝的酒醅發酵過程中的理化指標與優勢細菌屬、真菌屬進行RDA，結果見圖9。

圖9 酒醅發酵過程中基于屬水平細菌與理化因子（a）、真菌與理化因子（b）冗余分析Fig. 9 Redundancy analysis of bacteria and physicochemical factors(a), fungi and physicochemical factors (b) of fermented grains during fermentation process based on genus level

由圖9a可知，水分和溫度與乳桿菌屬（Lactobacillus）呈顯著正相關（P＜0.05），淀粉與乳桿菌屬（Lactobacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）呈顯著負相關（P＜0.05），淀粉與芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）呈顯著正相關（P＜0.05）。由圖9b可知，水分、溫度和酸度與unclassified_f__Aspergillaceae、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、unclassified_f__Metschnikowiaceae呈顯著負相關（P＜0.05），與哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）呈正相關性，淀粉與unclassified_f__Aspergillaceae、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）呈正相關關系，這與湯涵嵐等[37]研究結論基本一致。通過RDA，微生物對白酒發酵產酒生香中起到推動作用，白酒質量的優劣取決于發酵中微生物的群落組成，濃香型白酒發酵過程中在理化因子的作用下，與微生物之間相互影響、相互協同或拮抗，從而影響著微生物群落的演替和組成情況。

2.6 不同生產工藝條件下白酒產量分析

對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ分別投入原料為4 200 kg、6 300 kg、6 300 kg，經過發酵后對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ所產濃香型白酒產量分別為1 376 kg、1 704 kg、2 055 kg。實驗組Ⅱ白酒產量和出酒率均最高，相較于對照組和實驗組Ⅰ白酒產量分別多產679 kg、351 kg，說明優化后白酒生物反應器對白酒產量和出酒率均有著顯著的提高。優化后白酒生物反應器采用控溫和黃水結合，使得一系列產酒微生物獲得舒適生境和營養底物，大量生長繁殖，從而促進白酒產量的提升。

3 結論

通過研究傳統窖池、新型生物反應器，以及優化后新型生物反應器進行釀酒生產而對比分析3種不同發酵模式下，實驗組和對照組的酒醅微生物群落和理化指標的影響。結果表明，與對照組相比，實驗組II升溫效果最優且保持適宜溫度時間更長，實驗組水分含量、淀粉及還原糖消耗量更高，實驗組II下層酒醅酸度最高（4.24 mmol/10 g）?；诟咄繙y序技術分析可知，3組工藝發酵過程中酒醅樣品的細菌豐富度和多樣性均顯著高于真菌，其中厚壁菌門和子囊菌門分別為豐度最高的優勢細菌門和優勢真菌門。RDA結果表明，酒醅發酵過程中微生物群落結構變化與理化因子有著顯著的相關性，水分和溫度與Lactobacillus呈顯著正相關（P＜0.05），淀粉與Bacillus、Staphylococcus、Weissella呈顯著正相關（P＜0.05）；水分、溫度和酸度與unclassified_f__Aspergillaceae、Thermoascus、Saccharomycopsis呈顯著負相關（P＜0.05），與Kazachstania、Issatchenkia呈正相關性。

綜上所述，采用優化后的白酒生物反應器封窖能夠更好的保持窖池內密封性，從而保障微生物在相對厭氧或厭氧條件下的生存，后續發酵控制更加有利于微生物長期處于適宜的生存環境，充分利用營養物質，提升糧食利用率和出酒率。優化后白酒生物反應器在濃香型白酒釀造中實踐應用，為實際生產釀造濃香型白酒工藝改良以及智能化生產優質的白酒提供理論依據和實踐支撐。