老面傳代發酵過程中細菌菌群結構及其功能預測

吳 慶，楊小萍，辛世華，方海田*

（1.寧夏工商職業技術學院 旅游管理學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

老面，又稱為老面酵頭、酵子、面肥、起子、老酵面、傳統酸面團等，是我國發酵面食中用到的一種傳統發酵劑[1-2]。老面發酵技術是將上次制作面食制品留下的一塊面團作為發酵劑用于下次面團的發酵，這樣的過程稱為傳代發酵處理[3-4]。相比較于市售的單一酵母純種發酵，老面發酵面團的優勢在于其主要是以酵母菌、乳酸菌為主的多菌發酵體系，混合協同發酵不僅能夠產生更加豐富的風味和口感，同時乳酸菌發酵過程中產生的有機酸還能夠抑制病原微生物生長，延長發酵面食的保質期[5-6]。

老面發酵技術作為一種自然、有效的食品加工技術在改善面食制品品質方面的應用得到了越來越多的關注[7-9]。老面中的微生物菌群會被多種因素影響，如不同原料、地域環境和發酵工藝等[10-12]。MICHEL E等[13]通過高通量測序技術和實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR）法檢測16個法國發酵面團樣品中乳酸菌的相對豐度結果表明，舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）是主要的優勢菌種；高靜等[14]采用高通量技術分析老面中的菌群組成發現，河北、山西、山東樣品中以片球菌屬（Pediococcus claussen）為主，而云南樣品中以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主；李曉敏等[15]對山西、河北、青海、甘肅和河南5個地區酸面團樣品中的細菌菌群結構進行分析發現，優勢菌群為乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）；閆博文[16]采用傳統分離手段結合高通量測序技術對山東和河南2個地區的15個老面酵頭樣品的菌群多樣性進行分析發現，山東老面酵頭中主要是舊金山乳桿菌、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），而河南酵頭主要由食竇魏斯氏菌、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）構成。目前對我國不同區域老面樣品及發酵不同時期的菌群結構差異的研究報道較多，對于老面傳代發酵過程中的菌群結構變化的研究報道較少。老面中的微生物菌群結構是保障發酵面食產品質量和風味的前提與基礎[17]。老面發酵因其菌群結構復雜，目前主要局限于家庭自用和小作坊生產。探究老面傳代發酵過程的細菌多樣性和菌群結構的演替規律，對于老面的工業化生產尤為重要。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術考察了傳代發酵過程（1代、2代和4代）中老面樣品中細菌菌群結構，對高通量測序結果進行α多樣性及β多樣性分析，并對其細菌菌群進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以期揭示老面傳代發酵過程中細菌群落結構的動態變化，為傳統老面發酵劑的工業化生產提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用老面（sourdough，SD）（即每次面團發酵完成后留取的部分面團，循環使用）：來自于實驗室保存；小麥粉（塞北雪）：市售。Power Soil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：上海天根生化科技有限公司，2×TaqPlus Master Mix：美國KAPA公司；甲醇、乙腈、氨水、醋酸銨、2-氯苯丙氨酸（均為色譜純）：麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高通量二代測序儀：美國Illumina公司；Agilent 2100生物分析儀：德國Agilent公司；Labchip GX生物大分子分析儀：美國PerkinElmer公司；ABI 9700 PCR儀：美國ABI公司；Nanodrop2000 超微量分光光度計：美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 傳代發酵面團的制備

以老面50 g、小麥粉200 g、蒸餾水105 mL于UKOEO全自動揉面機智能模式下揉面15 min，取出覆保鮮膜在室溫條件下（25～28 ℃）自然發酵至16 h，命名為第一代，取出50 g老面面團繼續上述步驟，連續傳代4代，取第1代、第2代、第4代老面發酵面團的樣品分別命名為SD1、SD2和SD3[3]。每代發酵時期平行取3個發酵面團樣本，編號分別為1、2和3。

1.3.2 Illumina MiSeq測序和數據分析[18]

根據Power Soil DNA試劑盒說明書，以老面發酵面團微生物總DNA為模板，采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為上下游引物擴增細菌16S rRNA的V3-V4區域。25 μL PCR擴增體系：DNA樣品3 μL，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，5 μmol/L 338F和806R各1 μL，雙蒸水（ddH2O）7.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，28個循環；72 ℃延伸7 min。擴增完成后，以3 μL PCR產物點樣1.0%瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產物質量，以500 bp左右處出現清晰的條帶為準。最后將PCR產物送至北京奧維森基因科技有限公司Illumina MiSeq平臺測序，使用軟件UPARSE進行質量控制，以97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并提交到奧維森云分析平臺進行多樣性分析（http：//cloud.allwegene.com）。

1.3.3 功能預測分析[19]

使用PICRUSt軟件進行微生物群落的代謝功能預測，參照京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫進行功能注釋。采用Excel 2010軟件進行數據整理和相關圖表制作。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果和Alpha多樣性分析

通過Illumina MiSeq高通量測序，9份老面樣本共獲得538 981條優化序列，平均長度為429 bp，各樣本抽平OTU數和Alpha多樣性指數見表1。由表1可知，所有序列均按97%相似度歸為OTU，9個樣品共聚合了495個OTU。經OTU分析，這些序列歸屬于6個門、14個綱、20個目、28個科、39個屬、15個種。隨著傳代次數的增加，總OTUs、Phylum（門）、Class（綱）、Order（目）、Family（科）、Genus（屬）、Species（種）的OTU數量，呈先減少后增加趨勢。老面傳代發酵過程中，四代（SD3）的總OTU數、屬水平的OTU數量高于一代（SD1）和二代（SD2）。

表1 老面樣品微生物菌群的操作分類單元數和Alpha多樣性指數分析Table 1 Operational taxonomic units number and alpha diversity index analysis of microbial community in sourdough samples

Shannon指數、Chao1指數是基于97%相似度水平下的OTU信息以評估樣品微生物多樣性和豐富度。Coverage指數表示測序深度，本研究中樣品的Coverage指數均為1.00，表明測序深度良好，能夠真實反映樣品的微生物信息。Shannon指數和Coverage指數反映群落的多樣性，Chao 1指數反映群落的豐富度。Shannon指數越大，說明群落多樣性越高，Chao 1指數逐漸降低，說明微生物的豐富度逐漸降低[20]。由表1可知，Chao 1指數和Shannon指數變化趨勢相同，均呈先降低后增加趨勢，SD2樣品的Chao 1指數和Shannon指數均明顯低于SD1和SD3樣品，說明老面傳代發酵至第二代時，物種豐富度和群落多樣性最低。

2.2 老面微生物群落結構分析

2.2.1 基于門水平細菌群落多樣性分析

基于門水平不同老面樣品的細菌群落結構見圖1。由圖1可知，在門分類水平上，主要優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes），平均相對豐度呈先增加后減少趨勢，SD1、SD2和SD3的平均相對豐度依次為93.62%、95.58%和92.38%，其次為藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），變化趨勢與厚壁菌門相反，呈先減少后增加趨勢，平均相對豐度分別為SD3（4.43%）＞SD1（3.48%）＞SD2（1.98%）、SD3（3.17%）＞SD1（2.90%）＞SD2（2.43%），擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度極低（0.04%）。研究表明，厚壁菌門廣泛存在于發酵食品中[21]；高靜等[14]采集河北、山西、山東、云南、青海、甘肅和河南酸面團地區的傳統酸面團樣品的高通量測序結果表明，厚壁菌門在所有樣品中都占有絕對優勢。因此，在門水平上，各地老面酵頭的優勢菌群有高度的一致性，厚壁菌門是最普遍、最豐富的存在。

圖1 基于門水平不同老面樣品的細菌群落結構Fig. 1 Bacterial community structure of sourdough samples based on the phylum level

2.2.2 基于屬水平、種水平細菌群落多樣性分析

基于屬、種水平不同老面樣品的細菌群落結構見圖2。

圖2 基于屬（a）、種（b）水平不同老面樣品的細菌群落結構Fig. 2 Bacterial community structure of sourdough samples based on the genus (a) and species (b) level

由圖2a可知，老面傳代樣品發酵過程中，主要菌屬（平均相對豐度＞4%）為乳桿菌屬（Lactobacillus），其屬于厚壁菌門（Firmicutes）。乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度呈先增加后減少趨勢，其在SD1、SD2和SD3樣品中的平均相對豐度依次為93.59%、95.54%和92.33%。

由圖2b可知，除了未能鑒定的種屬外，老面傳代發酵中的優勢種（平均相對豐度＞4%）為舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）、干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri），它們均屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。其中舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）和干酪乳桿菌（L.sakei）的平均相對豐度變化為先減少后增加，平均相對豐度分別為SD1（20.02%）＞SD3（19.73%）＞SD2（19.68%）和SD3（7.27%）＞SD1（7.00%）＞SD2（6.93%）。短乳桿菌（L.brevis）的平均相對豐度變化為一直減少，即SD1（6.35%）＞SD2（6.33%）＞SD3（6.11%），加氏乳桿菌（L.gasseri）的平均相對豐度無變化，均為4.01%。

研究表明，老面面團在連續發酵過程中，在發酵初期的優勢菌主要是腸球菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬；經過一段時間發酵后，面團中的乳酸桿菌屬、片球菌屬和魏氏菌屬逐漸增多[22]；發酵完成后，老面面團中以適應性專性異型發酵乳酸菌為主導，如舊金山乳桿菌、發酵乳桿菌、植物乳桿菌等乳酸桿菌屬，而腸桿菌科、假單胞菌和霉菌等會在發酵過程中逐漸減少至無法檢測[23-24]。產生這種變化的原因就在于老面面團中的乳酸菌能夠發酵碳水化合物產生乳酸和乙酸，進而使面團的pH值不斷降低，而乳酸菌對面團中的酸性環境適應性較強，逐漸成為其中的優勢菌群，同時較低的pH抑制了腸桿菌科的生長[25]。同時老面發酵屬于傳統的自然發酵，以連續傳代、連續發酵的方式生產，不需要額外添加菌種，發酵溫度低（30 ℃以下），所以發酵完成后主要以短乳桿菌、植物乳桿菌、舊金山乳桿菌等適應低溫發酵的乳酸桿菌為主導[1]。

本研究老面傳代發酵過程中，主要是以厚壁菌門的乳桿菌屬為主，在連續傳代過程中，老面傳代發酵中的優勢種為乳桿菌屬（Lactobacillus）的舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis）、干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri）。在傳代過程中，微生物多樣性雖有變化，但相對含量變化不顯著（P＞0.05）。這也再次驗證了前人的研究結論，說明老面發酵最終會形成一個趨于穩定、成熟的微生物區系，能夠適應外界環境的變化[16，25]。

2.3 β多樣性分析

2.3.1 聚類分析

為研究老面傳代發酵過程中不同發酵階段群落結構的相似性或差異關系，基于unifrac樣本距離對3個發酵階段樣品細菌菌群的β多樣性指數進行聚類分析，結果見圖3。

圖3 基于屬水平老面樣品細菌菌群的β多樣性指數聚類分析熱圖Fig. 3 Heat map for β-diversity index cluster analysis of sourdough samples based on the genus level

由圖3可知，3個發酵階段可聚為3類，SD1-3、SD1-2、SD3-1聚為一類，SD2-1、SD2-2、SD2-3聚為一類，SD1-1、SD3-2、SD3-3聚為一類。由屬水平細菌群落結構（圖2a）可知，其中一代（SD1）、二代（SD2）、四代（SD3）的優勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus），平均相對豐度依次為93.59%、95.54%、92.33%?？傮w而言，老面傳代發酵過程中在細菌群落結構較為相似，豐度變化不顯著（P＞0.05），這與細菌群落在屬水平上相對豐度分析結果一致。

2.3.2 主坐標分析

主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），是通過分析不同樣本OTU（97%相似性）組成可以反映樣本間的差異和距離來研究多個樣品間數據的多樣性、差異性或相似性的一種方法，通過PCoA圖可以分析老面傳代發酵過程中樣品細菌群落的差異。

由圖4可知，PC1的方差貢獻率為94.59%，PC2的方差貢獻率為4.36%，累計方差貢獻率為98.95%，能很好地區分樣品的細菌群落分布差異情況。在PCA中，各個點之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[26]。反之，樣本點越接近，表明兩樣本物種組成則越相似[27]。在三個平行樣本中，SD1相較于SD2和SD3其樣本之間距離較遠，表明1代老面樣品組內的差異較大，可能是老面剛接入新鮮面粉中發酵，菌屬分布不均勻所致。從整體來看，SD1-1、SD2-2、SD2-3、SD3-2分布于第一象限，SD1-2、SD3-1、SD3-3分布于第二象限，分布于同一象限的兩兩之間距離最近且聚集度較高，說明其細菌群落結構較為相似。而SD1、SD2和SD3在一、二象限均有分布且距離較近，因此，SD1、SD2和SD3在微生物群落組成和結構上也存在相似之處，這與樣本聚類分析結果相同。

圖4 老面樣品在屬水平上細菌菌群的主坐標分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of sourdough samples at the genus level

2.4 老面傳代發酵過程中細菌菌群的代謝功能預測分析

老面傳代發酵過程中細菌菌群KEGG代謝功能預測結果見圖5。由圖5可知，KEGG在一級水平上細菌群落功能包括有機系統、細胞進程、人類疾病、基因處理和代謝進程。二級水平上共14種代謝通路，關于代謝途徑序列的相對豐度解釋了90.44%。細菌群落功能大多集中在碳水化合物代謝（41.95%～43.57%）、維生素及輔酶因子代謝（15.25%～15.87%）、分子排序、結構折疊與降解（14.12%～14.67%）、氨基酸代謝（10.91%～11.19%）等功能分類中。碳水化合物代謝、維生素及輔酶因子代謝、能量代謝、萜類及聚酮化合物代謝等能為細菌的生長繁殖提供必需的營養物質；面團發酵過程中，碳水化合物的代謝主要是通過糖酵解途徑和三羧酸循環進行。葡萄糖經糖酵解和三羧酸循環產生的α-酮酸，例如丙酮酸、乙酰輔酶A、α-酮戊二酸等，是參與氨基酸代謝及合成多種風味物質的重要前提物[16，28]。分子排序、結構折疊與降解、翻譯是微生物自身合成遺傳物質的主要代謝通路；氨基酸代謝在微生物演替中的作用主要包括兩個方面，一方面是氨基酸的合成代謝，用于合成自身獨特的蛋白質、多肽和其他含氮物質，以產生相應的氮源為微生物利用；另一方面是氨基酸的分解代謝，通過脫氨基、轉氨基、聯合脫氨基的方式分解為α-酮酸、胺類和二氧化碳，顯著影響發酵食品風味的形成[29]。

圖5 老面傳代發酵過程中細菌菌群KEGG代謝功能預測結果Fig. 5 Prediction results of KEGG metabolic function of bacterial community in sourdough during generation fermentation

一代至四代老面樣品碳水化合物的相對豐度先增加后減少；氨基酸代謝、維生素及輔酶因子代謝、萜類及聚酮化合物代謝、能量代謝、分子排序、結構折疊與降解的相對豐度先減少后增加。但老面酵頭傳代發酵過程中，細菌群落的代謝通路變化不顯著（P＞0.05），最主要代謝通路即碳水化合物代謝等功能成分的變化與乳桿菌屬物種豐度指數變化趨勢基本一致，即從一代到四代過程中，基因數量先減少，然后逐漸恢復，這說明群落結構的變化是其整體代謝功能發生變化的重要原因。

相對豐度排名前20的老面傳代發酵過程中細菌菌群3級KEGG同源功能預測結果見圖6。由圖6可知，3級KEGG同源功能預測結果顯示，在排名前20的代謝途徑中，磷酸戊糖途徑的相對豐度遠遠高于其他代謝途徑。磷酸戊糖途徑是異型乳酸菌發酵的主要代謝途徑，在老面酵頭傳代發酵過程中具有重要作用。磷酸戊糖途徑屬于二級代謝途徑中碳水化合物代謝途徑，這再次驗證了碳水化合物代謝途徑在老面酵頭發酵過程中有重要作用。發酵面制食品重要風味物質主要受乳酸菌影響，大約40%的風味物質如醇類、酯類、酮類、酸類、醛類等都和乳酸菌發酵相關[19]。舊金山乳桿菌的生長代謝的適宜溫度和pH值與酸面團發酵過程中溫度和pH值的變化相匹配，因此更利于它們的生長代謝[30]；同時乳酸菌具有多種應激反應機制來克服酸性環境、高溫或低溫環境、高滲透壓或脫水環境以及缺乏可利用底物環境等劣勢條件[31]。

圖6 老面傳代發酵過程中細菌菌群3級KEGG同源功能預測結果Fig. 6 Prediction results of 3rd grade KEGG homology function of sourdough bacterial community during generation fermentation

3 結論

利用Illumina Miseq高通量測序技術對老面傳代發酵過程中的細菌菌群多樣性進行解析，并對其細菌菌群進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果表明，從一代（SD1）到四代（SD3）老面樣品中的優勢菌門、屬和種的相對豐度無顯著變化（P＞0.05），優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門；優勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）；優勢菌種為舊金山乳桿菌（L.sanfranciscensis），其次為干酪乳桿菌（L.sakei）、短乳桿菌（L.brevis）和加氏乳桿菌（L.gasseri），其相對豐度變化同群落豐度變化相同，不同傳代間的老面樣品樣品的平均相對豐度變化不顯著（P＞0.05）。從SD1到SD3代老面樣品中細菌菌群主要功能為碳水化合物代謝、其次為維生素及輔酶因子代謝、分子排序、結構折疊與降解、氨基酸代謝；磷酸戊糖途徑是最主要的三級代謝功能。老面在發酵過程中，會形成復雜而穩定的微生物生態環境，傳代處理對其群組成和動態變化影響較低，這不僅反映出對面團特定生境的適應潛力，也展示出乳酸菌的種內異質性。本研究可為推動老面發酵劑的工業化生產提供依據。