基于NLRP3信號通路探究天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療脊髓損傷的可能機(jī)制

王超， 段浩， 畢航川， 王志華

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心，云南昆明 650031）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指在外傷等因素作用下，脊髓出現(xiàn)受壓、缺血及壞死，通常伴隨脊柱損傷的發(fā)生[1-2]。SCI一旦發(fā)生，往往會遺留不同程度的運動與感覺功能障礙、膀胱功能障礙以及自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重者甚至終身殘疾，給患者個人、家庭及社會帶來極大的負(fù)擔(dān)[3-4]。神經(jīng)節(jié)苷脂目前已廣泛應(yīng)用于SCI 治療中，可有效改善神經(jīng)功能，但單純應(yīng)用具有一定局限性，臨床多聯(lián)合其他藥物應(yīng)用[5-6]。近年來的研究表明，中成藥治療SCI具有標(biāo)本兼治的優(yōu)勢，已逐漸受到臨床醫(yī)師的重視。另有基礎(chǔ)研究[7]顯示，天麻素注射液可發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，以抑制脊髓神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷，同時還可影響雪旺細(xì)胞代謝，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長，從而達(dá)到治療SCI的目的。研究指出，神經(jīng)炎癥是SCI后繼發(fā)損傷的關(guān)鍵所在，而NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）的激活又反饋性引發(fā)神經(jīng)炎癥[8-9]。相關(guān)基礎(chǔ)研究[10]證實，NLRP3 信號通路在SCI模型大鼠中呈過度激活狀態(tài)，但關(guān)于其是否參與天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療SCI的作用過程，仍有待驗證。基于此，本研究嘗試基于NLRP3 信號通路探究天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療SCI的可能機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組選取2021 年6 月～2023 年3 月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心收治的108 例SCI 患者為研究對象，根據(jù)就診先后順序，采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組各54 例。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并通過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：2021011。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①均符合美國脊柱損傷協(xié)會（American Spinal Injury Association，ASIA）的SCI診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，并經(jīng)影像學(xué)檢查確診；②均接受椎管減壓、植骨融合術(shù)治療；③本人或其家屬對本研究內(nèi)容知情，并簽署了相關(guān)知情同意書的患者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并血液、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)疾病的患者；②伴有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者；③受傷前有脊柱疾病或其他嚴(yán)重創(chuàng)傷的患者；④合并有心腦血管疾病的患者；⑤存在精神或認(rèn)知障礙，不能配合本研究的患者；⑥妊娠期或哺乳期女性；⑦對神經(jīng)節(jié)苷脂、天麻素注射液存在過敏反應(yīng)的患者；⑧治療期間因嚴(yán)重不良反應(yīng)終止治療或私自增減藥物的患者。

1.4 治療方法

1.4.1 常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練 2 組患者均給予常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練干預(yù)，包括關(guān)節(jié)、運動和日常生活康復(fù)訓(xùn)練以及肛門和膀胱括約肌訓(xùn)練。

1.4.2 對照組 給予神經(jīng)節(jié)苷脂治療。用法：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液（西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20093712）60 mg + 生理鹽水100 mL，靜脈滴注，每天1 次。連續(xù)治療20 d，停藥10 d。30 d 為1 個療程，連續(xù)治療2個療程。

1.4.3 觀察組 在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合天麻素注射液治療。用法：天麻素注射液（海南惠普森醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20058309）600 mg+生理鹽水250 mL，靜脈滴注，每天1 次。連續(xù)治療20 d，停藥10 d。30 d 為1 個療程，連續(xù)治療2個療程。

1.5 觀察指標(biāo)及療效評價標(biāo)準(zhǔn)（1）療效評價標(biāo)準(zhǔn)：參考《臨床脊柱外科學(xué)》[12]擬定療效評價標(biāo)準(zhǔn)，分為臨床治愈、顯效、好轉(zhuǎn)及無效4 級。其中，脊髓損傷癥狀完全消失，感覺功能完全恢復(fù)為臨床治愈；脊髓損傷癥狀明顯改善且病情得到有效控制為顯效；脊髓損傷癥狀較治療前有所減輕為好轉(zhuǎn)；脊髓損傷癥狀未改善甚至加重為無效。總有效率（%）=（臨床治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+好轉(zhuǎn)例數(shù)）/總病例數(shù)× 100%。（2）康復(fù)效果指標(biāo)觀察：統(tǒng)計2組患者的肌力恢復(fù)正常時間、可下地行走時間及留院觀察時間。（3）ASIA 評分：參考ASIA 中關(guān)于SCI 功能恢復(fù)評價標(biāo)準(zhǔn)[11]，具體包含痛覺、運動及觸覺3 個方面。評分越高，表示功能恢復(fù)越好。（4）相關(guān)實驗室指標(biāo)測定：分別于治療前、治療1 個療程和2 個療程后，采集2 組患者的空腹外周靜脈血5 mL，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，半徑為8 cm，時間為10 min）分離血清，采用上海哈靈生物科技有限公司提供的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒測定腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）、中樞神經(jīng)特異性蛋白（S-100β）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 及NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ACS）水平。（5）安全性評價：觀察2組患者治療過程中的不良反應(yīng)發(fā)生情況，評價2組治療方案的安全性。

1.6 統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，不同時間點組間比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者基線資料比較表1 結(jié)果顯示：2 組患者的性別、年齡、病程、受損部位、ASIA 分級等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明2 組患者的基線資料均衡性良好，具有可比性。

表1 2組脊髓損傷（SCI）患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients （± s）

表1 2組脊髓損傷（SCI）患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients （± s）

注：ASIA：美國脊柱損傷協(xié)會

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2.2 2組患者臨床療效比較表2結(jié)果顯示：治療2 個療程后，觀察組的總有效率為83.33%（45/54），對照組為66.67%（36/54）；組間比較（χ2檢驗），觀察組的療效明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2組脊髓損傷（SCI）患者臨床療效比較Table 2 Comparison of clinical efficacy between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients[例（%）]

2.3 2組患者治療后的康復(fù)效果指標(biāo)比較表3結(jié)果顯示：治療后，觀察組的肌力恢復(fù)正常時間、可下地行走時間及留院觀察時間均較對照組明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 2組脊髓損傷（SCI）患者治療后的康復(fù)效果指標(biāo)比較Table 3 Comparison of rehabilitation effect indicators between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients （± s，d）

表3 2組脊髓損傷（SCI）患者治療后的康復(fù)效果指標(biāo)比較Table 3 Comparison of rehabilitation effect indicators between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients （± s，d）

注：①P＜0.01，與對照組比較

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2.4 2 組患者治療前后ASIA評分比較表4 結(jié)果顯示：經(jīng)重復(fù)測量方差分析，2 組患者治療前后ASIA 各項評分均存在組間效應(yīng)、時間效應(yīng)和交互效應(yīng)（P＜0.001）。具體表現(xiàn)為：治療前，2 組患者ASIA 的痛覺、運動、觸覺評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療1 個和2 個療程后，2 組患者ASIA 的痛覺、運動、觸覺評分均較治療前明顯升高（P＜0.05），且治療2 個療程后又均較治療1 個療程后升高（P＜0.05）；組間比較，觀察組在治療1 個和2 個療程后對ASIA 的痛覺、運動、觸覺評分的升高幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后美國脊柱損傷協(xié)會（ASIA）評分比較Table 4 Comparison of American Spinal Injury Association（ASIA）scores between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment （± s，分）

表4 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后美國脊柱損傷協(xié)會（ASIA）評分比較Table 4 Comparison of American Spinal Injury Association（ASIA）scores between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment （± s，分）

注：①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與治療1個療程后比較；③P＜0.05，與對照組同期比較

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2.5 2 組患者治療前后血清BDNF、S-100β 水平比較表5 結(jié)果顯示：經(jīng)重復(fù)測量方差分析，2 組患者治療前后血清BDNF、S-100β 水平均存在組間效應(yīng)、時間效應(yīng)和交互效應(yīng)（P＜0.001）。具體表現(xiàn)為：治療前，2 組患者血清BDNF、S-100β 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療1 個和2 個療程后，2 組患者的血清BDNF 水平均較治療前升高（P＜0.05），S-100β 水平均較治療前下降（P＜0.05），且治療2個療程后血清BDNF水平又均較治療1 個療程后升高（P＜0.05），血清S-100β 水平又均較治療1 個療程后下降（P＜0.05）；組間比較，觀察組在治療1 個和2 個療程后對血清BDNF水平的升高幅度及對血清S-100β 水平的下降幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后血清BDNF、S-100β水平比較Table 5 Comparison of serum BDNF and S-100β levels between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment[± s，（μg·L-1）]

表5 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后血清BDNF、S-100β水平比較Table 5 Comparison of serum BDNF and S-100β levels between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment[± s，（μg·L-1）]

注：BDNF：腦源性神經(jīng)生長因子；S-100β：中樞神經(jīng)特異性蛋白。①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與治療1個療程后比較；③P＜0.05，與對照組同期比較

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2.6 2 組患者治療前后NLRP3 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)及因子水平比較表6結(jié)果顯示：經(jīng)重復(fù)測量方差分析，2組患者治療前后NLRP3信號通路的相關(guān)蛋白表達(dá)及因子水平均存在組間效應(yīng)、時間效應(yīng)和交互效應(yīng)（P＜0.001）。具體表現(xiàn)為：治療前，2 組患者的NLRP3、ACS、Caspase-1 蛋白及血清IL-1β、IL-18 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療1 個和2 個療程后，2 組患者的NLRP3、ACS、Caspase-1蛋白及血清IL-1β、IL-18水平均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療2 個療程后又均較治療1 個療程后下降（P＜0.05）；組間比較，觀察組在治療1 個和2 個療程后對NLRP3、ACS、Caspase-1蛋白及血清IL-1β、IL-18水平的下降幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后NLRP3信號通路相關(guān)蛋白及因子水平比較Table 6 Comparison of the levels of NLRP3 signaling pathway-related proteins and factors between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment （± s）

表6 2組脊髓損傷（SCI）患者治療前后NLRP3信號通路相關(guān)蛋白及因子水平比較Table 6 Comparison of the levels of NLRP3 signaling pathway-related proteins and factors between the two groups of spinal cord injury（SCI）patients before and after treatment （± s）

注：NLRP3：NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3；ACS：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；Caspase-1：半胱氨酸蛋白酶1；IL-1β：白細(xì)胞介素1β；IL-18：白細(xì)胞介素18。①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與治療1 個療程后比較；③P＜0.05，與對照組同期比較

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2.7 安全性評價治療過程中，2 組患者均未出現(xiàn)藥物相關(guān)不良反應(yīng)，具有較高的安全性。

3 討論

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、交通工具的逐漸普及，各類工業(yè)及交通事故發(fā)生率逐年升高，致使脊髓損傷（SCI）患病人數(shù)不斷攀升[13-14]。SCI患者術(shù)后2～6 個月為神經(jīng)功能的最佳恢復(fù)時期，此時進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，可加速神經(jīng)功能重建、重組，促使神經(jīng)功能康復(fù)[15]。隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)對于因炎癥等因素造成的繼發(fā)性脊髓損害，單純系統(tǒng)康復(fù)訓(xùn)練治療具有一定局限性，仍需配合藥物輔助治療[16]。

神經(jīng)節(jié)苷脂作為一種細(xì)胞膜構(gòu)成成分，是中樞神經(jīng)組織內(nèi)含量較為豐富的神經(jīng)發(fā)育必要物質(zhì)。研究[17]指出，神經(jīng)節(jié)苷脂可加速神經(jīng)細(xì)胞分化，促進(jìn)軸突再生，保護(hù)細(xì)胞膜，有利于神經(jīng)功能可塑性恢復(fù)。天麻素注射液的主要成分天麻素進(jìn)入人體后，可水解成為天麻苷元，進(jìn)入血腦屏障，可用于治療神經(jīng)衰弱、偏頭痛、坐骨神經(jīng)痛等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[18]證實，天麻素具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性、抗細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)及抗氧化等作用，在神經(jīng)損傷后的病理生理過程中的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮保護(hù)作用，其可改善微環(huán)境，啟動神經(jīng)生長相關(guān)基因表達(dá)，同時還可對神經(jīng)元凋亡發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示：在臨床療效方面，對于觀察組的SCI患者，予以神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合天麻素注射液治療，患者的臨床總有效率為83.33%（45/54），明顯高于對照組的66.67%（36/54），且觀察組的肌力恢復(fù)正常時間、可下地行走時間及留院觀察時間均較對照組明顯縮短，治療1 個和2 個療程后美國脊柱損傷學(xué)會（ASIA）的痛覺、運動、觸覺評分均較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。充分說明天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療SCI可促進(jìn)患者功能恢復(fù)，縮短康復(fù)進(jìn)程，效果更為顯著。

SCI 繼發(fā)性損傷造成的持久、彌漫性損傷，可破壞膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞，并引起進(jìn)行性神經(jīng)變性及遲發(fā)性細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致?lián)p傷部位擴(kuò)大，甚至造成脊髓更高節(jié)段的損傷。炎癥作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天免疫反應(yīng)之一，在組織損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理中發(fā)揮重要作用，在SCI繼發(fā)損傷中扮演重要角色[19]。炎癥反應(yīng)的啟動與炎癥小體NLRP3 信號通路密切相關(guān)[20]。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體作為一種多蛋白活性復(fù)合物，其組成成分中NLRP3 作為細(xì)胞內(nèi)傳感器，半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）作為效應(yīng)體，而凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ACS）則為接頭蛋白，其炎癥小體可經(jīng)活化Caspase-1，致使白細(xì)胞介素（IL）1β、IL-18 前體裂解為成熟的IL-1β、IL-18，進(jìn)而引起一系列炎癥反應(yīng)[21]。已有研究[22-23]證實，炎癥小體NLRP3 信號通路的激活可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，參與SCI后繼發(fā)性損傷。為探究天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂治療SCI的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測SCI患者NLRP3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)及因子水平，結(jié)果顯示：治療1 個及2 個療程后，2組患者的NLRP3、ACS、Caspase-1 蛋白及血清IL-1β、IL-18 水平均較治療前顯著下降，且觀察組的下降幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），充分說明天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療SCI，可顯著減輕患者神經(jīng)炎癥反應(yīng)。此外，在本研究中，觀察組治療1個及2 個療程后的血清腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）水平明顯低于對照組，血清中樞神經(jīng)特異性蛋白（S-100β）水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這亦從血清層面進(jìn)一步證實天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療SCI可促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)。綜合上述結(jié)果，本研究認(rèn)為天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂可通過調(diào)控炎癥小體NLRP3 信號通路，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。其原因分析如下：（1）神經(jīng)節(jié)苷脂可促進(jìn)脊髓神經(jīng)軸突再生，促進(jìn)神經(jīng)元再生，反饋性調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥[24]；（2）天麻素注射液可使損傷區(qū)域外周血管阻力下降，動脈血管順應(yīng)性增加，抑制早期炎性滲出，拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)毒性，從而干預(yù)神經(jīng)損傷的多個環(huán)節(jié)，改善腦微環(huán)境，減少細(xì)胞凋亡，減緩損傷后神經(jīng)元死亡速度，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[25]。

綜上所述，天麻素注射液聯(lián)合神經(jīng)節(jié)苷脂治療SCI患者療效確切，可通過調(diào)控炎癥小體NLRP3信號通路，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，其療效優(yōu)于單純神經(jīng)節(jié)苷脂治療。但由于人力資源及科研經(jīng)費不足等原因，本研究尚未開展相關(guān)基礎(chǔ)研究，因此，確切的結(jié)論有待今后進(jìn)一步的研究證實。