揉撥法調(diào)節(jié)DHPR/RyR通路對(duì)肌筋膜疼痛綜合征大鼠的改善作用研究

向超， 何生華， 趙欣， 萬(wàn)騏， 馬熾， 胡艷平，2

（1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院推拿科，湖北武漢 430014；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北武漢 430000）

肌筋膜疼痛綜合征（myofascial pain syndromes，MPS）是一種區(qū)域性疼痛疾病，好發(fā)于每個(gè)年齡段的人群，其特征是在肌肉或筋膜內(nèi)存在激痛點(diǎn)。激痛點(diǎn)即為存在于骨骼肌中的結(jié)節(jié)，觸診時(shí)產(chǎn)生疼痛，主要由過(guò)度使用肢體或長(zhǎng)時(shí)間保持同樣姿勢(shì)引起[1-2]。MPS 的治療方法主要是定期物理治療，如針灸、按摩、經(jīng)皮電刺激和干擾電流治療等，幫助恢復(fù)正常的肌肉松弛和關(guān)節(jié)活動(dòng)度，或者在難治性病例中輔以藥物或非藥物進(jìn)行干預(yù)[3-4]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，痛點(diǎn)揉撥法可以治療MPS，緩解疼痛，改善肌痙攣；但其作用機(jī)制尚不清楚。 研究[5-8]發(fā)現(xiàn)， 二氫吡啶受體（dihydropyridine receptor，DHPR）是質(zhì)膜L 型電壓門控鈣離子（Ca2+）通道，利若丁受體（ryanodine receptor，RyR）則是肌質(zhì)網(wǎng)快速Ca2+釋放通道，可機(jī)械化學(xué)偶聯(lián)促進(jìn)肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放并控制肌肉收縮。因此，本研究構(gòu)建MPS 大鼠模型，觀察揉撥法對(duì)MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織DHPR/RyR 信號(hào)通路的影響，探討其治療作用及機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用揉撥法治療MPS 提供循證依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7 ～8周齡，體質(zhì)量（240 ± 20）g，購(gòu)自湖北貝恩特生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2021-0027。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2021-0057。本研究已獲得華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：202207023。

1.2 主要試劑與儀器RyR 抑制劑丹曲林（美國(guó)MedChemExpress 公司，批號(hào)：HY-12542）；4%多聚甲醛（上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；鈣離子（Ca2+）檢測(cè)試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）；甲基百里香酚藍(lán)（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；兔源一抗DHPRα1（美國(guó)Abcam 公司）；兔源一抗RyR（美國(guó)Santa Cruz 公司）；兔源一抗乙酰膽堿酯酶（AChE）、β-actin[愛必信（上海）生物科技有限公司]；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。JZL-Ⅲ軟組織張力測(cè)定儀（天津明通世紀(jì)科技有限公司）；肌電裝置（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；SuPer Max 3100 酶標(biāo)儀（武漢言必行科技股份有限公司）；Talos L120C TEM 透射電鏡（北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.3 MPS大鼠模型的構(gòu)建采用鈍性打擊結(jié)合離心運(yùn)動(dòng)法構(gòu)建MPS 大鼠模型[9]。方法：在每周的第1 天對(duì)大鼠進(jìn)行一次鈍性打擊，即大鼠麻醉滿意后，固定于打擊器低端并對(duì)左側(cè)股內(nèi)側(cè)肌進(jìn)行標(biāo)記，隨后打擊器從20 cm 高處垂直下落且打擊在大鼠標(biāo)記處。第2天，在跑臺(tái)上進(jìn)行離心運(yùn)動(dòng)90 min。剩余5 d正常飼養(yǎng)，不做其他干預(yù)。共重復(fù)8周。然后，再正常飼養(yǎng)、活動(dòng)4周作為恢復(fù)期。當(dāng)進(jìn)行觸診時(shí)出現(xiàn)攣縮結(jié)節(jié)，電極針刺入結(jié)節(jié)時(shí)發(fā)生抽搐反應(yīng)，且肌電圖中出現(xiàn)高頻自發(fā)性電活動(dòng)，說(shuō)明MPS大鼠造模成功。

1.4 分組與干預(yù)從60 只大鼠中隨機(jī)抽取12 只作為正常組，其余大鼠構(gòu)建MPS 模型。將48 只造模成功的MPS 大鼠隨機(jī)分為模型組、揉撥法組、揉撥法+ 丹曲林組、揉撥法+ 生理鹽水組，每組12 只。揉撥法組：將大鼠麻醉并仰臥固定于動(dòng)物按摩床，備皮，用拇指在結(jié)節(jié)處進(jìn)行揉撥手法推拿，經(jīng)過(guò)壓力傳感器檢測(cè)，保持揉撥時(shí)最大力度在0.7 kg，一共操作3 min。揉撥法+丹曲林組：在進(jìn)行揉撥推拿后腹膜注射10 mg/kg的丹曲林[10]；揉撥法+生理鹽水組進(jìn)行揉撥推拿后腹膜注射等體積生理鹽水。上述干預(yù)每隔1 d 進(jìn)行1 次，每次揉撥治療5 min，總共治療7 次。同期，模型組和正常組大鼠不做干預(yù)處理，正常喂養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 von-Frey 法測(cè)定大鼠機(jī)械性痛閾值 在治療1、4、7次后，分別測(cè)定各組大鼠的機(jī)械性痛閾值。將大鼠置于玻璃體中，并放在金屬網(wǎng)架上，然后用von-Frey 纖維絲刺激針刺激大鼠的左后肢足底正中部位。當(dāng)大鼠出現(xiàn)撤足反射時(shí)，記錄測(cè)痛儀上數(shù)值，重復(fù)刺激5 次，每次間隔5 min，去掉最大值和最小值，計(jì)算機(jī)械性痛閾值。

1.5.2 軟組織張力測(cè)定[11]調(diào)試軟組織張力測(cè)定儀，檢測(cè)頭對(duì)準(zhǔn)MPS 大鼠的激痛點(diǎn)區(qū)域，正常組則取相同位置的股內(nèi)側(cè)肌肌腹，然后垂直均勻地用力按壓持續(xù)3 s，再均勻撤力，同樣需要3 s。最后觀察按壓或撤力時(shí)形成的力量-位移曲線并分析數(shù)據(jù)。根據(jù)儀器的說(shuō)明書以及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將曲線中0.2 kg 及其對(duì)應(yīng)的位移（D0.2kg）作為觀察指標(biāo)，可以更好地反映大鼠的肌肉軟組織張力。

1.5.3 肌電圖檢測(cè) 將各組大鼠的左后肢毛發(fā)剃掉。在正常組大鼠的左后肢股內(nèi)側(cè)肌肌腹插入一支電極，在3 ～5 mm 處再插入一支作為參考電極。其余組大鼠通過(guò)觸診MPS 部位找到攣縮結(jié)節(jié)，然后將電極刺入，此時(shí)大鼠產(chǎn)生抽搐反應(yīng)，同樣在3 ～5 mm處另插一支電極作為參考。應(yīng)用肌電裝置觀察肌電活動(dòng)。

1.5.4 透射電鏡觀察MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織的超微結(jié)構(gòu) 上述檢測(cè)完成后，每組隨機(jī)選出6 只大鼠處死，取出攣縮結(jié)節(jié)區(qū)域（激痛點(diǎn)），正常組則取相同位置的股內(nèi)側(cè)肌肌腹，用生理鹽水洗滌，放入4%多聚甲醛中固定、備用。漂洗、鋨酸固定、脫水，然后包埋再切片處理，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，包括肌原纖維和肌節(jié)排列的規(guī)則程度、肌節(jié)明帶和暗帶的完整情況與位置關(guān)系以及Z線異常率。

1.5. 5 比色法檢測(cè)MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量 將各組剩余的6只大鼠處死，按“1.5.4”項(xiàng)取出各組大鼠相應(yīng)部位的組織，勻漿、低溫離心后取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書，采用甲基百里香酚藍(lán)比色法檢測(cè)Ca2+的含量。

1.5.6 Western Blot法檢測(cè)MPS大鼠激痛點(diǎn)組織中DHPRα1、RyR、AChE 蛋白表達(dá) 將“1.5.5”項(xiàng)中取出的剩余的各組大鼠組織用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液裂解并提取總蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離。再將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h。先后用一抗DHPRα1、RyR、AChE、β-actin（均1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。最后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）溶液可視化蛋白并使用ImageJ 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，以β-actin 為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用Graph Pad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 揉撥法對(duì)MPS大鼠機(jī)械性痛閾值的影響表1結(jié)果顯示：在治療前，與正常組比較，模型組、揉撥法組、揉撥法+丹曲林組、揉撥法+生理鹽水組大鼠機(jī)械性痛閾值顯著減小，表明MPS 大鼠模型構(gòu)建成功（P＜0.05）。治療后，與正常組比較，模型組大鼠機(jī)械性痛閾值仍減小（P＜0.05）；與模型組比較，揉撥法組、揉撥法+生理鹽水組機(jī)械性痛閾值均增加（P＜0.05），且隨著治療次數(shù)的增加，機(jī)械性痛閾值逐漸升高；揉撥法組與揉撥法+生理鹽水組機(jī)械性痛閾值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與揉撥法組比較，揉撥法+丹曲林組機(jī)械性痛閾值下降（P＜0.05）。

表1 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠機(jī)械性痛閾值的影響Table 1 Effect of pressing and rubbing method on mechanical pain threshold in MPS rats （± s）

表1 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠機(jī)械性痛閾值的影響Table 1 Effect of pressing and rubbing method on mechanical pain threshold in MPS rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與揉撥法組比較

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2.2 揉撥法對(duì)MPS 大鼠激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2kg 的影響表2 結(jié)果顯示，治療前，與正常組比較，模型組、揉撥法組、揉撥法+丹曲林組、揉撥法+生理鹽水組大鼠激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2kg顯著減小（P＜0.05）。在治療后，與正常組比較，模型組大鼠激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2kg減?。≒＜0.05）；與模型組比較，揉撥法組、揉撥法+生理鹽水組D0.2kg升高（P＜0.05）；揉撥法組與揉撥法+生理鹽水組D0.2kg比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與揉撥法組比較，揉撥法+丹曲林組D0.2kg下降（P＜0.05）。

表2 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2 kg的影響Table 2 Effect of pressing and rubbing method on soft tissue tension D0.2 kg of trigger point in MPS rats （± s）

表2 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2 kg的影響Table 2 Effect of pressing and rubbing method on soft tissue tension D0.2 kg of trigger point in MPS rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與揉撥法組比較

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2.3 揉撥法對(duì)MPS大鼠肌電圖的影響圖1 結(jié)果顯示：正常組大鼠肌電圖無(wú)明顯變化，未出現(xiàn)電活動(dòng)現(xiàn)象；模型組大鼠肌電圖發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)振幅較高的峰電位、高頻率低幅度的背景電位；揉撥法組與揉撥法+生理鹽水組肌電圖中的電位變化較模型組明顯減少；揉撥法+丹曲林組肌電圖則出現(xiàn)明顯的電位變化。

圖1 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠肌電圖的影響Figure 1 Effect of pressing and rubbing method on the electromyogram of MPS rats

2.4 揉撥法對(duì)MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織超微結(jié)構(gòu)的影響圖2結(jié)果顯示：正常組肌原纖維排列規(guī)則且整齊，肌節(jié)明帶和暗帶完整且交界明顯、交替規(guī)則，Z 線連續(xù)且清晰；模型組激痛點(diǎn)組織肌原纖維排列混亂、甚至出現(xiàn)斷裂情況，肌節(jié)暗帶不完整、界線雜亂，Z 線出現(xiàn)斷裂；揉撥法組與揉撥法+生理鹽水組激痛點(diǎn)組織肌原纖維排列恢復(fù)整齊趨勢(shì)，肌節(jié)明帶和暗帶交界明顯，Z 線較連續(xù)；揉撥法+丹曲林組激痛點(diǎn)組織肌原纖維排列不規(guī)則、出現(xiàn)少許斷裂，肌節(jié)暗帶不完整、混亂，Z線斷裂。

圖2 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)組織超微結(jié)構(gòu)的影響（透射電鏡，×10 000）Figure 2 Effect of pressing and rubbing method on ultrastructure of pain point tissue in MPS rats（under transmission electron microscope，×10 000）

2.5 揉撥法對(duì)MPS大鼠激痛點(diǎn)組織Ca2+含量的影響表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，揉撥法組、揉撥法+生理鹽水組大鼠激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量減少（P＜0.05）；與揉撥法組比較，揉撥法+丹曲林組大鼠激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量增加（P＜0.05）；而揉撥法組與揉撥法+生理鹽水組Ca2+含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)組織Ca2+含量的影響Table 3 Effect of pressing and rubbing method on Ca2+content in trigger point tissue of MPS rats （± s）

表3 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)組織Ca2+含量的影響Table 3 Effect of pressing and rubbing method on Ca2+content in trigger point tissue of MPS rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與揉撥法組比較

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2.6 揉撥法對(duì)MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織DHPR/RyR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響圖3 和表4 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組DHPRα1、RyR、AChE 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，揉撥法組、揉撥法+生理鹽水組DHPRα1、RyR、AChE 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與揉撥法組比較，揉撥法+丹曲林組DHPRα1、RyR、AChE蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與揉撥法組比較，揉撥法+生理鹽水組以上蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 DHPRα1、RyR、AChE蛋白的Western Blot條帶Figure 3 Western Blot bands of DHPRα1，RyR and AChE proteins

表4 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)組織DHPRα1、RyR、AChE蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Table 4 Effect of pressing and rubbing method on the relative protein expressions of DHPRα1，RyR，and AChE in excitatory point tissues of MPS rats （± s）

表4 揉撥法對(duì)肌筋膜疼痛綜合征（MPS）大鼠激痛點(diǎn)組織DHPRα1、RyR、AChE蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Table 4 Effect of pressing and rubbing method on the relative protein expressions of DHPRα1，RyR，and AChE in excitatory point tissues of MPS rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與揉撥法組比較

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3 討論

揉撥法屬漢派經(jīng)穴推拿，是經(jīng)穴疏導(dǎo)痛點(diǎn)揉撥推拿手法中的一種復(fù)合治療手法。本研究中使用的揉撥法是由本院推拿科主任高揚(yáng)教授研讀中醫(yī)著作并師承中醫(yī)名師聞慶漢教授，經(jīng)過(guò)不斷的總結(jié)、提煉、傳承和發(fā)展而形成的特色荊楚推拿療法中的痛點(diǎn)揉撥法。本法融合了荊楚名醫(yī)的學(xué)術(shù)思想及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，將整體和局部相結(jié)合，遵循局部辨證推拿和整體經(jīng)穴疏導(dǎo)的原則。本課題組應(yīng)用痛點(diǎn)揉撥法治療肌筋膜疼痛綜合征（MPS），有明顯療效，闡明其治療作用及機(jī)制對(duì)臨床治療具有重要的研究意義。

本研究采用鈍性打擊和離心運(yùn)動(dòng)方法構(gòu)建大鼠MPS 模型，結(jié)果顯示MPS 大鼠機(jī)械性痛閾值和激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2kg顯著降低，表明大鼠MPS造模成功。MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量增多、肌電圖顯示自發(fā)肌電活動(dòng)增多、激痛點(diǎn)部位組織結(jié)構(gòu)受到破壞，均表明MPS 大鼠正常肌電活動(dòng)異常、激痛點(diǎn)組織受損。揉撥法治療后的MPS 大鼠機(jī)械性痛閾值、激痛點(diǎn)軟組織張力D0.2kg升高，激痛點(diǎn)組織中Ca2+含量減少并趨于正常水平，肌電圖監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)自發(fā)肌電活動(dòng)減少，激痛點(diǎn)組織結(jié)構(gòu)較規(guī)則且排列整齊、界限清晰，表明揉撥法可以改善MPS 引發(fā)的大鼠疼痛以及抽搐反應(yīng)，修復(fù)激痛點(diǎn)組織損傷。

DHPR、RyR 在骨骼肌興奮-收縮耦合中發(fā)揮調(diào)節(jié)Ca2+通道的作用。DHPR 存在于骨骼肌橫小管的特殊內(nèi)陷肌膜中，是電壓門控L 型Ca2+通道，當(dāng)通過(guò)DHPR 內(nèi)流的Ca2+與RyR2 通道的足結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，以Ca2+觸發(fā)Ca2+釋放方式使RyR 開放。RyR與肌漿網(wǎng)Ca2+釋放通道相關(guān)，可以控制Ca2+從肌漿網(wǎng)釋放到肌質(zhì)中，進(jìn)而調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的收縮[12-13]。有研究[14-15]表明，DHPR/RyR 軸對(duì)于細(xì)胞膜活動(dòng)及其與細(xì)胞內(nèi)的連接至關(guān)重要，可以影響胞內(nèi)和胞外的Ca2+平衡，介導(dǎo)肌肉收縮。本研究結(jié)果顯示，MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織中DHPRα1、RyR、AChE 蛋白表達(dá)降低，揉撥法治療后DHPRα1、RyR、AChE 蛋白表達(dá)升高。推測(cè)揉撥法可能通過(guò)促進(jìn)DHPR/RyR 軸DHPRα1、RyR 表達(dá)的增加，減輕MPS 大鼠激痛點(diǎn)組織超微結(jié)構(gòu)損傷。進(jìn)一步應(yīng)用RyR抑制劑丹曲林進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在揉撥法處理后注射丹曲林減弱了揉撥法對(duì)MPS 大鼠的改善作用，再次證明揉撥法可能通過(guò)激活DHPR/RyR軸改善肌肉張力，減輕MPS大鼠癥狀。

綜上所述，揉撥法可有效改善大鼠MPS，其機(jī)制可能與激活DHPR/RyR 軸有關(guān)。但揉撥法與DHPR/RyR 軸更加深入的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。