苦參堿調節IL-6/STAT3信號通路對炎癥性腸病大鼠腸黏膜損傷的影響

孔冰慧， 白龍洲， 楊麗

[1.河南中醫藥大學第五臨床醫學院（鄭州人民醫院），河南鄭州 450046；2.鄭州人民醫院消化內科，河南鄭州 450053]

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是臨床常見的以潰瘍性結腸炎和克羅恩病為主的炎癥性腸道疾病，作為一種免疫介導的非特異性、進行性慢性疾病，可發生于各年齡層，但在兒童中多發，可造成腹瀉、腹痛、黏液性膿血便、腸黏膜潰瘍等癥狀，極大危害了患者身心健康，特別是對兒童身心發育造成很大負面影響[1-2]。目前臨床治療以減輕癥狀與防治并發癥為主，但部分患者療效不佳[3-4]。而中醫藥因療效獨特、毒副作用小，被廣泛應用于防治IBD 中，成為研究熱點。IBD 歸屬中醫“腸僻”“泄瀉”“痢疾”等范疇，邪毒損及脾胃、濕熱下迫大腸是其主要病機，主要以清熱、祛毒、燥濕法進行治療[5]。苦參，為豆科植物苦參Sophora flavescensAit. 的干燥根，性寒、味苦，具有燥濕清熱、殺菌涼血等功效，對濕熱導致的腹瀉、痢疾、黃疸等有一定療效。苦參堿是苦參的主要活性成分，既往研究表明，其可抑制結直腸推進運動、調節胃腸道功能、保護胃腸黏膜，能用于防治結腸炎、胃炎、腹瀉等胃腸道疾病[6-9]；但其對IBD 的具體治療作用及機制尚不清楚。

現代醫學研究[10-11]表明，炎癥因子與氧自由基等介質的過度釋放引發的炎性級聯反應及氧化應激在IBD 發病過程中起到重要作用。白細胞介素6（IL-6）/信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）是調控過氧化及炎性級聯反應的關鍵信號，與各種腸道疾病的發生發展關系密切。有研究表明，抑制IL-6/STAT3 信號通路可降低炎性細胞因子水平，進而減輕5-氟脲嘧啶化療誘導的腸黏膜炎[12]，并可緩解右旋糖酐硫酸鈉誘導IBD 小鼠的結腸炎癥狀[13]。由此可知IL-6/STAT3 是治療IBD 的潛在靶點。因此，本研究以IBD大鼠模型為研究對象，探討苦參堿調節IL-6/STAT3 信號通路對其腸黏膜損傷的影響，以期為苦參堿在IBD臨床治療中的開發應用提供新的理論資料，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物53只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量200 ～240 g，鼠齡為7 周，購自廈門萬泰滄海生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（閩）2018-0002。所有大鼠在河南中醫藥大學動物房中飼養，動物使用許可證號：SYXK（豫）2022-0004。動物房內維持屏障環境，濕度為55%～65%、溫度為23 ～26 ℃、光照為12 h/12 h 明暗循環。本動物實驗獲得河南中醫藥大學倫理委員會審批通過，批號：22-073623。

1.2 藥物、試劑與儀器苦參堿（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110805-201709，純度：98.7%），分子式：C15H24N2O，分子量：248.37，分子結構：摩爾折射率為71.12、摩爾體積為213.3（cm3/moL）、等張比容為562.5（90.2 K）、表面張力為48.3（dyne/cm）、極化率為28.19（10-24cm3），將其溶于生理鹽水中制成3、6 mg/mL 的苦參堿溶液備用。三硝基苯磺酸（TNBS）（大連美侖生物技術有限公司，批號：MB5547-1）；colivelin（美國TargetMol公司，批號：143955，純度：96.56%）；大鼠IL-6、C-反應蛋白（CRP）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，兔源抗大鼠IL-6、p-STAT3、STAT3 及β-actin 等一抗，標記辣根過氧化物酶（HRP）的驢抗兔二抗（均美國Abcam 公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。HistoCore MULTICUT 半自動輪轉式切片機、Aperio VERSA 數字病理顯微鏡[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司]；UM10超薄切片機（江蘇雷博科學儀器有限公司）；ZC1099 透射電鏡（上海茁彩生物科技有限公司）；LD-96A全自動酶標儀（山東萊恩德智能科技有限公司）；PowerPac Basic 1645050 電泳儀、UVTransilluminator 化學發光凝膠成像儀、Mini PROTEAN 蛋白電泳與轉膜儀（美國伯樂公司）。

1.3 IBD 大鼠模型制備與分組處理參考文獻研究[14]，采用TNBS 結腸灌注法制備IBD 大鼠模型。具體操作：以生理鹽水配制質量分數為50%的TNBS 溶液，取43 只SD 大鼠進行結腸灌注（灌胃針經大鼠肛門插入8 cm），TNBS 劑量為100 mg/kg，倒提大鼠30 s，繼續常規飼養，3 d 后觀察大鼠。若其發生進食明顯減少，腹部腫大，大便稀軟、帶血并附著肛門，即視為IBD大鼠造模成功。結果因操作不當死亡1 只，另有2 只未出現IBD 典型癥狀，造模失敗，共成功造模40 只。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、苦參堿低劑量組、苦參堿高劑量組、苦參堿高劑量+colivelin 組，每組10只，再選10 只正常大鼠結腸灌注等體積生理鹽水作為正常組。

分組處理：苦參堿低、高劑量組大鼠灌胃30、60 mg/kg 苦參堿（3、6 mg/mL 的苦參堿生理鹽水溶液分別灌胃10 mL/kg）[15]，同時腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠灌胃60 mg/kg苦參堿（6 mg/mL的苦參堿生理鹽水溶液分別灌胃10 mL/kg），同時腹腔注射1 mg/kg 的colivelin（0.1 mg/mL 的colivelin 生理鹽水溶液注射10 mL/kg）[16]；模型組、正常組大鼠分別灌胃及腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水。各組大鼠均處理7 d，每日1次。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 大鼠體質量和疾病活動指數（DAI） 造模成功后開始測量各組大鼠體質量，此時記為第0 天，2 d 測一次體質量，直至末次處理后24 h，此時記為第8天。測量結束后觀察大鼠便血、腹瀉情況并進行DAI 評分[14]：體質量不降低且無便血、腹瀉情況，計0 分；體質量降低1% ～5%，無腹瀉、便血情況或不明顯，計1 分；體質量降低6% ～10%，呈隱血便且形狀松散、半成形、不粘附肛門，計2 分；體質量降低11%～15%，呈稀便且不粘附于肛門，計3 分；體質量降低15%以上，呈稀水樣便且粘附于肛門，腹瀉明顯、肉眼可見便血，計4分。

1.4.2 HE 染色、透射電鏡分別觀察大鼠結腸黏膜組織病理學、超微結構變化并采集標本 DAI評分結束后在充滿乙醚的玻璃瓶內麻醉各組大鼠，開腹取腹主動脈血離心（1 000 r/min、離心半徑20 cm、4 ℃、10 min），分別收集各組血清存于-20 ℃備用；取出結腸組織，漂洗后剪下約0.5 g黏膜組織存在液氮備用。

HE 染色：剩余結腸黏膜組織取1.5 cm ×1.5cm × 0.2 cm 的大小，以80% ～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明、熱石蠟包埋、切片，所得約5 μm厚的切片進行二甲苯脫蠟、100%～75%梯度水化處理，按HE 染色試劑盒說明書中方法行HE 染色。蒸餾水漂洗后以數字病理顯微鏡觀察大鼠結腸黏膜組織形態并采集其任意視野圖像。參考文獻研究[17]中標準進行結腸黏膜組織病理評分：固有層很少有炎癥細胞，無潰瘍灶，計0分；固有層有少量炎癥細胞浸潤，有1 ～2 個潰瘍灶，病變深入黏膜層，計1分；炎癥細胞進入黏膜下層，有3 ～4 個潰瘍灶，病變深入黏膜下層，計2 分；炎癥細胞廣泛浸潤結腸黏膜組織，有廣泛且連續的潰瘍灶，病變深入肌肉層，計3分；潰瘍病變深入漿膜且有大量炎癥細胞浸潤，計4分。

透射電鏡：取0.5 cm × 1.5 cm × 0.2 cm 大小的結腸黏膜組織，以4%多聚甲醛固定、蒸餾水漂洗、鋨酸固定、80% ～100%梯度乙醇和純丙酮脫水，然后滲透、包埋、切片所得70 nm 厚的切片以醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛進行雙染，干燥后應用透射電鏡觀察結腸黏膜組織超微結構并采集其任意視野圖像。

1.4.3 大鼠血清和結腸黏膜組織IL-6、CRP、SOD、MDA 水平檢測 取結腸黏膜組織，裂解、勻漿，離心（3 000 r/min、離心半徑20 cm、4 ℃、20 min）取上清，比色法檢測SOD、MDA 水平，采用ELISA 法檢測IL-6、CRP 水平。采用上述同樣方法檢測血清CRP、IL-6、SOD、MDA 水平。具體檢測方法按試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 Western Blot 法檢測大鼠腸黏膜組織IL-6/STAT3 通路相關蛋白表達 取結腸黏膜組織，裂解、勻漿，離心取上清，根據其總蛋白濃度測定結果每組取15μg 樣本蛋白進行電泳。等蛋白按分子量大小分散在凝膠中后進行濕轉，使其轉印到PVDF膜上。以3%牛血清白蛋白溶液封閉后剪下內參蛋白β-actin和目的蛋白IL-6、STAT3、p-STAT3條帶，以對應一抗（稀釋比例均為1∶1 000）和二抗（稀釋比例為1∶2 000）進行抗原抗體反應后顯色，拍攝各組蛋白圖像后以ImageJ 軟件進行分析，定量圖中各組蛋白灰度值后量化其相對表達（即檢測目的蛋白與內參蛋白灰度值之比）。

1.5 統計方法采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差 （±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量及DAI評分比較圖1 結果顯示，隨著給藥時間的延長，苦參堿低、高劑量組大鼠體質量逐漸增加，尤其苦參堿高劑量組的體質量增長趨勢似正常組。表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠體質量顯著降低（P＜0.05），DAI 評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠體質量均升高（P＜0.05），DAI 評分均降低（P＜0.05）；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠體質量升高（P＜0.05），DAI 評分降低（P＜0.05）；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠體質量降低（P＜0.05），DAI評分升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量及DAI評分比較Table 1 Comparison of body mass and DAI among various group of rats （± s）

表1 各組大鼠體質量及DAI評分比較Table 1 Comparison of body mass and DAI among various group of rats （± s）

注： ①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與苦參堿低劑量組比較；④P＜0.05，與苦參堿高劑量組比較

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圖1 各組大鼠體質量變化比較Figure 1 Comparison of body mass changes among various groups of rats

2.2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學變化比較圖2、表2結果顯示：正常組大鼠結腸黏膜組織形態正常完好，無損傷；與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織出現嚴重病理損傷，可見結腸上皮細胞部分脫落且排列雜亂，結腸黏膜水腫、壞死明顯并有不同程度的潰瘍，腸絨毛壞死萎縮、稀疏，黏膜組織內有大量炎癥細胞浸潤，結腸黏膜組織病理評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠結腸黏膜組織病理損傷均減輕，病理評分均降低（P＜0.05）；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠結腸黏膜組織病理損傷減輕，病理評分降低（P＜0.05）；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠結腸黏膜組織病理損傷加重，病理評分升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理評分比較Table 2 Comparison of pathological scores of colonic mucosal tissue among various groups of rats （± s）

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理評分比較Table 2 Comparison of pathological scores of colonic mucosal tissue among various groups of rats （± s）

注： ①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與苦參堿低劑量組比較；④P＜0.05，與苦參堿高劑量組比較

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圖2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學變化（HE染色，×200）Figure 2 Pathological changes in colonic mucosal tissue in each group of rats（HE staining，×200）

2.3 各組大鼠結腸黏膜組織超微結構比較圖3結果顯示：正常組大鼠結腸黏膜組織超微結構正常，腸絨毛均勻且排列整齊，細胞及其核結構清晰，線粒體整體及嵴結構完整無異常，細胞間連接正常；與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織超微結構明顯受損，可見腸絨毛脫失、斷裂、倒伏、腫脹，細胞間質增寬，線粒體呈空泡樣變性且嵴結構缺損，核質界限不清且染色質固縮嚴重；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠結腸黏膜組織超微結構損傷均減輕；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠結腸黏膜組織超微結構損傷更輕；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠結腸黏膜組織超微結構損傷加重。

圖3 各組大鼠結腸黏膜組織超微結構變化（透射電鏡，×15 000）Figure 3 Ultrastructural changes in colonic mucosal tissue in each group of rats（transmission electron microscopy，×15 000）

2.4 各組大鼠血清炎癥及氧化應激因子水平比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清CRP、IL-6、MDA 水平顯著升高（P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠血清CRP、IL-6、MDA 水平均降低（P＜0.05），SOD 水平均升高（P＜0.05）；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠血清CRP、IL-6、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 水平升高（P＜0.05）；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠血清CRP、IL-6、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清CRP、IL-6、SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum CRP，IL-6，SOD，and MDA levels among various groups of rats （± s）

表3 各組大鼠血清CRP、IL-6、SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum CRP，IL-6，SOD，and MDA levels among various groups of rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與苦參堿低劑量組比較；④P＜0.05，與苦參堿高劑量組比較

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2.5 各組大鼠結腸黏膜組織炎癥及氧化應激因子水平比較表4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、MDA 水平顯著升高（P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、MDA 水平均降低（P＜0.05），SOD水平均升高（P＜0.05）；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、SOD、MDA水平比較Table 4 Comparison of CRP，IL-6，SOD，and MDA levels in colon mucosal tissue among various groups of rats （± s）

表4 各組大鼠結腸黏膜組織CRP、IL-6、SOD、MDA水平比較Table 4 Comparison of CRP，IL-6，SOD，and MDA levels in colon mucosal tissue among various groups of rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與苦參堿低劑量組比較；④P＜0.05，與苦參堿高劑量組比較

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2.6 各組大鼠結腸黏膜組織IL-6/STAT3通路相關蛋白表達比較圖4、表5 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織IL-6 蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿低、高劑量組大鼠結腸黏膜組織IL-6 蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3 比值均降低（P＜0.05）；與苦參堿低劑量組比較，苦參堿高劑量組大鼠結腸黏膜組織IL-6 蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3 比值降低（P＜0.05）；與苦參堿高劑量組比較，苦參堿高劑量+colivelin 組大鼠結腸黏膜組織IL-6 蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3 比值升高（P＜0.05）。

表5 各組大鼠結腸黏膜組織IL-6和p-STAT3/STAT3蛋白相對表達量比較Table 5 Comparison of relative expression levels of IL-6 and p-STAT3/STAT3 proteins in colon mucosal tissues among various groups of rats （± s）

表5 各組大鼠結腸黏膜組織IL-6和p-STAT3/STAT3蛋白相對表達量比較Table 5 Comparison of relative expression levels of IL-6 and p-STAT3/STAT3 proteins in colon mucosal tissues among various groups of rats （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與苦參堿低劑量組比較；④P＜0.05，與苦參堿高劑量組比較

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圖4 各組大鼠結腸黏膜組織IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白的Western Blot條帶Figure 4 Western Blot bands of IL-6，STAT3，and p-STAT3 proteins in colon mucosal tissues in each group of rats

3 討論

本研究以TNBS 結腸灌注法構建炎癥性腸病（IBD）大鼠模型，結果顯示，結腸灌注TNBS 后可引發炎癥因子CRP、IL-6 過度釋放及抗氧化酶活性降低，誘導高水平的炎癥和氧化應激，造成結腸黏膜組織超微結構明顯受損并產生嚴重病理損傷，導致大鼠食欲明顯降低，產生腹部腫大，大便稀軟、帶血并附著肛門的癥狀，提示大鼠IBD造模成功。

已有研究證實，炎癥和過氧化反應造成的腸黏膜損傷是IBD的主要病理基礎，保持氧化還原平衡并防止炎癥進展是一種很有前途的IBD治療選擇，可有效改善腸上皮細胞損傷和腸道功能[10-11，18]。苦參堿作為一種具有抗炎及抗氧化作用的天然生物堿類化合物，研究表明，其可通過失活JAK2/STAT3途徑保護腸上皮細胞免受右旋糖酐硫酸鈉引發的炎性損傷[8]，還能調節腸道菌群失衡并降低促炎細胞因子表達，進而抑制2型豬圓環病毒誘導的腸道炎癥[9]，由此可知苦參堿對于IBD 治療具有一定的潛力。本研究結果顯示，苦參堿可減輕IBD大鼠結腸黏膜組織病理及超微結構受損，降低血清和結腸黏膜組織CRP、IL-6、MDA 水平，升高體質量、血清和結腸黏膜組織SOD 水平，表明苦參堿可減少炎癥因子過度釋放并增強抗氧化酶功能，進而抑制炎癥和氧化應激，從而減輕IBD大鼠腸黏膜損傷，改善大鼠腹瀉、便血等臨床癥狀，進一步證實了苦參堿在IBD臨床治療中具有很大的治療潛力。

IL-6/STAT3 信號通路參與炎癥、氧化應激和免疫紊亂的發生發展，在IBD、潰瘍性結腸炎等腸道疾病中發揮重要調控作用。研究顯示，IL-6/STAT3信號通路異常激活，與IBD 的發生發展關系密切，而阻止該通路的激活可提高丁酸產生菌豐度、減輕炎癥，抑制右旋糖酐硫酸鈉誘導的IBD模型結腸炎進展[19]。抑制IL-6 表達和STAT3 磷酸化亦可減少腸上皮細胞凋亡、增加腸緊密連接蛋白的表達，進而減輕腸黏膜屏障功能損傷[20]。Chen等[8]研究發現，苦參堿體外通過阻斷IL-6/STAT3信號傳導通路減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導的腸上皮細胞炎癥損傷。本研究結果顯示：IBD 大鼠結腸黏膜組織IL-6 蛋白表達及p-STAT3/STAT3 比值較正常大鼠顯著升高，證明IL-6/STAT3 信號激活參與了IBD 的發病過程。施以苦參堿處理可逆轉上述蛋白的變化趨勢，表明IL-6/STAT3 信號參與介導苦參堿減輕IBD大鼠腸黏膜損傷的過程。再以苦參堿和STAT3 激活劑colivelin 聯合處理，發現colivelin 可減弱苦參堿單獨處理對IBD大鼠的抗炎與抗氧化應激作用，拮抗苦參堿對IBD大鼠腸黏膜損傷的減輕作用，逆轉苦參堿對IBD大鼠腹瀉、便血等臨床癥狀的改善作用。提示苦參堿減輕IBD大鼠腸黏膜損傷是通過抑制STAT3信號通路激活實現的。

綜上所述，苦參堿可通過降低IL-6 表達、抑制STAT3 磷酸化，減少炎癥細胞因子過度分泌并提升抗氧化酶活性，進而阻止炎癥和氧化應激反應發生和進展，減輕IBD大鼠腸黏膜損傷，改善其腹瀉、便血等臨床癥狀；阻斷IL-6/STAT3 信號通路激活可能是苦參堿起到上述藥理作用的分子機制。