辛麻顆粒對慢性哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能的影響

宮靜， 呂子怡， 吳淼萍， 鐘鄧萍

（1.廣東省第二中醫院，廣東廣州 510095；2.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東廣州 510095）

辛麻顆粒為廣東省第二中醫院院內制劑，由經典名方小青龍湯合射干麻黃湯化裁而成，主要功效為止咳平喘、健脾化痰，臨床應用可有效治療哮喘[1]。課題組前期研究[2]表明，辛麻顆粒可以通過抑制輔助性T 細胞2（Th2）優勢的免疫作用，改善哮喘小鼠的氣道炎癥；但其作用機制尚不完全明確。氣道上皮屏障功能異常是2 型炎癥發生發展的關鍵步驟[3]。因此，本研究擬觀察辛麻顆粒對哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能的影響，探討其干預機制，以期為辛麻顆粒臨床應用提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50 只SPF 級雌性BALB/C 小鼠，鼠齡6 ～8 周，體質量17 ～21 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0002。于廣東省第二中醫院實驗動物中心飼養，室溫22～26 ℃，相對濕度45%～65%，標準飼料喂養，自由進食、飲水。本研究通過廣東省第二中醫院實驗動物倫理委員會審查，審批號：049147。

1.2 藥物、試劑與儀器辛麻顆粒（5 g/包），廣東省第二中醫院院內制劑（批準文號：粵藥制字Z20090021），藥物組成：炙麻黃、細辛、法半夏、蘇子、射干、陳皮、山藥、丹參、五味子、補骨脂。地塞米松注射液（天津金耀集團湖北天藥藥業股份有限公司生產，批號：國藥準字H42020019）。卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma 公司）；小鼠分泌型免疫球蛋白A（sIgA）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、小鼠免疫球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒（美國RD 公司）；E 鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（美國Cell signalling technology 公司）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（英國Abcam 公司）。403H空氣式壓縮霧化器（中國魚躍醫療公司）；2550 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；Spectra MAX190 型酶標儀（美國MD 公司）；PowerPac 基礎電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；YD62型石臘包埋機、YD-AB 型烤片機（均為浙江金華益迪公司產品）；DP2-BSW 型病理圖像采集系統（日本Olympus公司）。

1.3 分組、造模與給藥將50只小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為5 組，分別為正常組、模型組，辛麻顆粒低、高劑量組，地塞米松組，每組10只。模型的建立與給藥處理：正常組，第1、14 天每只小鼠腹腔注射0.2 mL 生理鹽水，以第21 天起霧化吸入生理鹽水30 min，3 次/周，持續8 周。模型組，參照文獻研究[4]建立慢性哮喘模型，分致敏和激發兩步，第1、14 天每只小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液（OVA 10 μg，氫氧化鋁凝膠100 μg），第21 天起霧化吸入OVA 溶液（25 g/L，Ⅱ級）30 min，3 次/周，持續8 周。造模過程觀察小鼠精神狀態、皮毛、活動、呼吸、大小便以及進食狀態，判斷模型成功建立與否主要是從小鼠癥狀、體征及病理學改變來評估。辛麻顆粒低劑量組，在構建哮喘模型的基礎上，從第21 天開始每日2 次灌胃辛麻顆粒水溶液至造模結束，1.3 g/kg（按動物體表面積比率換算等效劑量法）。辛麻顆粒高劑量組處理同辛麻顆粒低劑量組，劑量為2.6 g/kg；地塞米松組，在構建哮喘模型的基礎上，第21 天起每次霧化前30 min 腹腔注射10 mg/kg 地塞米松注射液[5]，3次/周，持續8周。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 ELISA 法檢測sIgA、IgE 水平 各組小鼠末次激發24 h 后行支氣管灌洗。離斷頸椎處死小鼠，醫用膠布固定小鼠四肢，分離頸部皮膚、肌肉組織，分離氣管，結扎右肺，左側支氣管置靜脈穿刺套管針，0.9%冰浴生理鹽水1 mL 行支氣管灌洗，每次氣道內注入、回抽3 次，回收液體量＞80%。雙抗體夾心ELISA 法檢測支氣管灌洗液中sIgA、IgE 濃度。按ELISA 試劑盒說明書進行操作。應用酶標儀于450 nm 波長處測定吸光度值，計算后得出sIgA、IgE的實際濃度。

1.4.2 HE 染色法觀察肺組織病理學改變 切取的小鼠右肺組織用0.9% 生理鹽水清洗血漬，10%多聚甲醛固定48 h，常規脫水，透明，石蠟包埋，制作蠟塊，橫切氣管，切成厚度5 μm 薄片，行HE染色。

1.4.3 Western Blot 法檢測肺組織E-cadherin表達 取左肺組織剪碎，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿機勻漿，置于冰上裂解30 min，取上清液進行蛋白定量。將等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗E-cadherin（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜。加入山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜。增強化學發光（ECL）液顯影，全自動化學發光成像分析系統成像，用ImageJ 軟件對條帶進行灰度分析，計算目的蛋白相對表達量（目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值比值）。

1.5 統計方法采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數± 標準差 （±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；多組樣本均數兩兩比較，方差齊者用Bonferroni 檢驗，方差不齊的多重比較用Dunnett’s T3 法檢驗。 以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀態比較正常組小鼠動作靈活，毛發光亮，未見呼吸異常；模型組小鼠出現呼吸急促，點頭呼吸，煩躁不安，腹肌抽搐，皮毛暗淡粗糙等表現；辛麻顆粒高、低劑量組及地塞米松組小鼠在霧化刺激后出現呼吸急促、腹肌抽搐等表現，但明顯輕于模型組，哮喘樣癥狀有所改善。

2.2 各組小鼠肺組織病理變化比較圖1 結果顯示：正常組小鼠氣管及肺組織結構完整，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠氣道壁、氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下層增寬，皺褶增多，管腔狹窄，氣管、支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，辛麻顆粒高、低劑量組及地塞米松組小鼠肺組織、氣道炎性細胞浸潤減少，氣道壁及氣道平滑肌增厚減輕，其中辛麻顆粒高劑量組、地塞米松組改善更明顯。

圖1 各組小鼠肺組織病理學改變（HE染色，×200）Figure 1 Histopathological changes in the lungs of mice in each group（HE staining，×200）

2.3 各組小鼠支氣管灌洗液sIgA、IgE濃度比較表1結果顯示：模型組小鼠支氣管灌洗液sIgA 濃度低于正常組（P＜0.05）；辛麻顆粒高、低劑量組及地塞米松組sIgA 濃度高于模型組（P＜0.05）；辛麻顆粒高劑量組、地塞米松組支氣管灌洗液sIgA 濃度高于辛麻顆粒低劑量組（P＜0.05），且2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠支氣管灌洗液sIgA、IgE 濃度比較Table 1 Comparison of sIgA and IgE concentrations in bronchial lavage fluid of mice among various groups （± s，μg·mL-1）

表1 各組小鼠支氣管灌洗液sIgA、IgE 濃度比較Table 1 Comparison of sIgA and IgE concentrations in bronchial lavage fluid of mice among various groups （± s，μg·mL-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與地塞米松組比較；④P＜0.05，與辛麻顆粒高劑量組比較

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模型組小鼠支氣管灌洗液IgE 濃度高于正常組（P＜0.05）；辛麻顆粒高、低劑量組及地塞米松組IgE濃度與模型組相比較均有降低（P＜0.05）；地塞米松組IgE 濃度顯著低于辛麻顆粒高、低劑量組（P＜0.05）；辛麻顆粒高、低劑量組IgE 濃度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠肺組織E-cadherin表達比較表2、圖2結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肺組織E-cadherin 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛麻顆粒高、低劑量組及地塞米松組小鼠肺組織中E-cadherin 蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；辛麻顆粒高劑量組和地塞米松組E-cadherin 蛋白相對表達量高于辛麻顆粒低劑量組（P＜0.05），且2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠肺組織E-cadherin蛋白相對表達量的比較Table 2 Comparison of relative expression of E-cadherin protein in lung tissues of mice among various groups （± s）

表2 各組小鼠肺組織E-cadherin蛋白相對表達量的比較Table 2 Comparison of relative expression of E-cadherin protein in lung tissues of mice among various groups （± s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與地塞米松組比較；④P＜0.05，與辛麻顆粒高劑量組比較

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圖2 各組小鼠肺組織中E-cadherin蛋白的Western Blot電泳圖Figure 2 Western Blot electrophoresis of E-cadherin protein in lung tissues of various groups of mice

3 討論

哮喘存在免疫功能紊亂。黏膜免疫系統是獨立于細胞與體液免疫系統之外的一種復雜的免疫系統，就像一道屏障保護機體，是機體抵抗病原的第一道防線。氣道上皮細胞為氣道黏膜的重要構成，在維持機體氣道免疫穩態中發揮重要作用[6]。氣道上皮細胞作為引起哮喘氣道炎癥的靶細胞之一，暴露于環境因素和炎癥后，易造成氣道上皮反復損傷，修復和再生會導致氣道黏膜上皮的組織學改變和功能異常[7]，誘導免疫系統異常信號傳導、氣道重塑以及氣道高反應性，引起哮喘疾病的發生和發展[8]。

sIgA 是機體黏膜防御系統的主要成分，主要由淋巴細胞歸巢到黏膜中的B細胞產生，是黏膜應答過程中的主要效應因子，在呼吸道黏膜免疫反應中發揮關鍵作用[9]。提高sIgA 水平可增強黏膜免疫功能，預防呼吸道疾病發生，遏制相關疾病的進展。體內sIgA 缺乏或降低容易發生支氣管哮喘等疾病[10]。本研究發現，辛麻顆粒能夠提高哮喘小鼠呼吸道的sIgA水平，增強黏膜免疫功能。

IgE 由黏膜下淋巴組織中的效應B 細胞合成。哮喘發病中，IgE 可作用于局部組織中肥大細胞和嗜堿性粒細胞的FcεRⅠ受體，促進炎性介質的釋放，導致支氣管收縮，氣道平滑肌痙攣，同時導致杯狀細胞大量分泌黏液，氣道黏膜水腫，引起氣道高反應性[11]。哮喘患者體內往往存在高水平的IgE 并且與哮喘炎癥的嚴重程度相關。本研究發現，辛麻顆粒可降低哮喘小鼠呼吸道的IgE 水平，改善哮喘小鼠的氣道炎癥。

氣道上皮屏障功能是黏膜免疫的重要組成部分。屏障蛋白E-cadherin對于細胞間的黏附起到重要的作用，是上皮細胞重要的生物標記物。E-cadherin 主要表達于上皮細胞膜上，其表達減少使支氣管上皮結構失去穩定性和上皮細胞喪失極性， 有利于支氣管上皮細胞的移行[12]。研究[13]表明，哮喘發生時E-cadherin的表達明顯降低，在哮喘患者中E-cadherin蛋白表達水平越低，屏障功能缺失就越明顯，而屏障功能缺失又會進一步促進哮喘的發生與發展。此次研究發現，使用辛麻顆粒干預后，哮喘小鼠肺組織E-cadherin蛋白表達增高，可以保護氣道上皮屏障，改善哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能。

綜上所述，辛麻顆粒能夠改善氣道炎癥，降低呼吸道IgE 水平，提高哮喘小鼠呼吸道sIgA 濃度以及氣道E-cadherin蛋白表達，進而增強哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能，且辛麻顆粒高劑量作用效果優于低劑量，與地塞米松作用相當。