華蟾素通過調控MYH9/USP7/c-MYC通路抑制急性髓系白血病細胞免疫逃逸

黃蓉， 劉凱， 郝敬全， 王理槐， 甘卓

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院血液腫瘤科，湖南長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，湖南長沙 410007；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院核醫學科，湖南長沙 410007）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是起源于骨髓造血干細胞的血液系統惡性腫瘤，具有高度的遺傳異質性和侵襲性[1]。AML 可發生于各年齡階段，最常見的是老年群體，極易復發且預后較差，5 年總生存率不超過21%[2]。越來越多的研究表明，AML 的難治性和易復發性與免疫逃逸有關。免疫逃逸是AML 患者異體造血干細胞移植后復發的主要危險因素[3]。蟾酥，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo melanostictusSchneider 的干燥分泌物，辛、溫，有毒，歸心經，具有解毒、止痛、開竅醒神功效，用于治療癰疽疔瘡、咽喉腫痛等病證，現代藥理研究表明，其具有廣泛抗癌作用[4]。華蟾素是一種從蟾酥中分離的蟾蜍二烯內酯，既往研究表明，其能夠誘導人T 細胞白血病細胞的凋亡[5]；但對AML 的治療作用及機制尚不清楚。肌球蛋白重鏈9（MYH9）基因編碼非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMⅡ-A）的重鏈（MHCⅡ），參與調控細胞黏附、細胞遷移和細胞信號轉導等多種生物學過程[6]。MYH9 也被證實與多種腫瘤的免疫逃逸有關[7-8]。據報道，MYH9 高表達與AML 患者較差的總生存期相關[9]。此外，有關于肺癌的研究表明，抑制MYH9 能夠減少去泛素化酶泛素特異性蛋白酶7（USP7）對骨髓細胞瘤病毒癌基因（c-MYC）的募集、促進c-MYC 的泛素化降解進而參與腫瘤進展[10]。本研究旨在探討華蟾素調控MYH9/USP7/c-MYC 通路對AML 細胞免疫逃逸的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物10 只SPF 級雌性BALB/c 裸鼠，4～6 周齡，體質量（20 ± 2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，湖南中醫藥大學第一附屬醫院飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2022-0003。本研究中所有的動物實驗程序均經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準，批準號：zyh-202103046，并按照實驗動物護理和使用指南進行。

1.2 細胞人AML 細胞株HL-60，由中國科學院上海細胞庫提供。

1.3 藥物、試劑與儀器華蟾素，分子量458.54，分子式C26H34O7，分子結構見圖1，購自美國MedChemExpress 公司，批號：1108-68-5，純度99.87%。RPMI-1640 培養基，胎牛血清（FBS），抗人CD3/CD28磁珠，Lipofectamine 3000試劑，Pierce免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；人淋巴細胞分離液Lymphoprep（加拿大Stemcell 公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8）溶液（日本Dojindo公司）；vector和MYH9過表達質粒（廣州RiboBio 生物公司）； GolgiStop 試劑盒（美國BD Biosciences 公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）檢測試劑盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、增強化學發光試劑（ECL）（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore 公司）；AIM-V 培養基（美國Gibco 公司）；MYH9、USP7、c-MYC、CD8 等抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，辣根過氧化物酶（HRP）-IgG 二抗、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的熒光二抗、泛素結合酶抗體、干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、白細胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒（英國Abcam 公司）；佛波酯、離子霉素（美國Sigma-Aldrich 公司）；CytoTox96 非放射性細胞毒性測定試劑盒（美國Promega 公司）。酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；Transwell 小室（美國Coring 公司）；流式細胞儀（美國Beckman 公司）；熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

圖1 華蟾素分子結構Figure 1 Molecular structure of cinobufacini

1.4 分子對接MYH9 的蛋白質3D 結構分別從Uniport（https://www.uniprot.org/）和Alpha fold（https://alphafold.ebi.ac.uk）數據庫獲取。使用PyMOL 2.3.0 軟件將蛋白質結構中的水分子、無關蛋白鏈和原配體刪除以備對接所用。小分子化合物為華蟾素，其3D 結構文件從PubChem 數據庫下載并使用Chem3D 對小分子結構進行分子力場優化，最終獲得能量最低狀態的最優分子結構。使用AutoDock Tools 1.5.6 對蛋白質進行加氫處理，對小分子進行加氫和判定可扭轉鍵的處理，保存為pdbqt 文件。使用Grid 板塊設置分子對接范圍參數，設定對接方式為半柔性對接，對接算法為拉馬克遺傳算法。運行Auto Dock Vina 1.2.0進行分子對接，得到對接結合自由能以及對接結果文件。

1.5 體內實驗

1.5.1 造模、分組與給藥 裸鼠成瘤造模方法：用無血清培養基重懸HL-60 細胞，調整細胞密度，將5 × 106個細胞注射至每只裸鼠的腋窩處皮下。待瘤體可觸及時，將裸鼠隨機分為華蟾素組與對照組，每組5只。按人與裸鼠體表面積等效劑量換算法計算華蟾素組祼鼠用藥量。華蟾素組給予華蟾素生理鹽水溶液（10 mg/mL）4 mg/kg 腹腔注射，每3 d 1 次，對照組同時給予等體積生理鹽水10 mg/mL 腹腔注射。連續給藥4 周。實驗結束后，通過吸入過量CO2對祼鼠實施安樂死。

1.5.2 移植瘤體積測量 給藥期間使用游標卡尺測量移植瘤的大小，計算腫瘤體積，腫瘤體積=（長×寬2）/2。

1.5.3 免疫熒光染色法檢測CD8 表達 將腫瘤組織常規石蠟包埋切成5μm 切片，石蠟切片脫蠟再水化。切片抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，使用5%羊血清封閉液室溫孵育2 h，加入CD8 抗體4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后，將切片與FITC標記的二抗室溫孵育1 h。4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下進行觀察，CD8陽性細胞被標記為綠色。

1.5.4 IL-2 和IFN-γ 檢測 取腫瘤組織，剪碎后勻漿、離心，收集上清液進行IL-2 和IFN-γ 指標的ELISA檢測。

1.6 體外實驗

1.6.1 細胞培養 HL-60 細胞以添加10% FBS、100 U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5%CO2加濕的培養箱中培養。

1.6.2 人CD8+T 細胞的分離與培養 于健康供體的外周血中分離CD8+T 細胞。使用人淋巴細胞分離液Lymphoprep 分離外周血單核細胞（PBMCs），然后通過CD8 磁珠對PBMCs 進行CD8+T 細胞陽性純化。純化CD8+T 細胞用人CD3/CD28單抗偶聯磁珠刺激48 h，將純化的CD8+T 細胞在含有IL-2（10 ng/mL）的AIM-V 培養基中培養48 h。對于T 細胞腫瘤殺傷實驗，將活化的T細胞與HL-60細胞以3∶1 的效靶比在存在或不存在華蟾素的條件下共培養48 h。

1.6.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將HL-60 細胞接種于96 孔板中，2 × 103個/孔，加入不同濃度（0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μmol/L）華蟾素培養48 h。棄去培養基上清液，向每孔中加入10μL CCK-8 溶液孵育2 h。最后應用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.6.4 Transwell 實驗測定細胞侵襲能力 華蟾素處理完畢后，用無血清的RPMI-1640 培養基將HL-60 細胞制備成單細胞懸液，調整密度為2 ×105個/mL。將Transwell 小室（孔徑8μm）放入24 孔板中，上室用50 μL 稀釋后的Matrigel 預包埋。上室中加入200μL 細胞懸液，下室中加入600μL 含有10% FBS 的培養基。培養48 h 后，取出小室用棉簽擦去未侵入的細胞，侵入Transwell 膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，自來水沖洗，顯微鏡下觀察并計數。

1.6.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡 將HL-60細胞接種于6孔板中，使用華蟾素（0.25、0.5、0.75μmol/L）處理。PBS洗滌后，細胞4%多聚甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100 透化10 min。PBS 再次洗滌，加入TdT 和dUTP 混合溶液37 ℃避光孵育60 min，然后用DAPI 染核。使用抗熒光猝滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6. 6 細胞轉染 將1 × 106個HL-60 細胞接種于6 孔板中孵育過夜，使用Lipofectamine 3000試劑將vector、MYH9 過表達質粒（濃度50 ng/mL）轉染至HL-60細胞，轉染48 h收獲細胞。

1.6. 7 流式細胞術檢測CD25 陽性細胞表達 使用50 ng/mL 佛波酯和500 ng/mL 離子霉素刺激CD8+T 細胞3.5 h 使其活化，然后加入GolgiStop 抑制細胞內細胞因子向外分泌。收集細胞，使用熒光染料標記的CD25 抗體進行細胞表面染色，應用流式細胞儀分析染色細胞。

1.6.8 IL-2 和IFN-γ 檢測 將HL-60 細胞與活化的CD8+T 細胞在6 孔板中培養48 h，收集共培養基，4 ℃、2 000×g離心5 min，獲得上清液，使用ELISA試劑盒檢測IFN-γ 和IL-2 的水平。

1.6.9 細胞毒性檢測 將HL-60 細胞和CD8+T細胞（效靶比為10∶1）加入對應培養孔，37 ℃孵育4 h，加入細胞裂解液后以250×g離心4 min。然后加入CytoTox96 試劑，依據試劑盒說明書配制底物并且進行后續操作。在室溫避光孵育30 min，加入終止液，使用酶標儀檢測490 nm 處吸光度值來測定細胞培養上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的水平。細胞毒性（%）=（實驗孔吸光度值-效應細胞自發吸光度值-靶細胞自發吸光度值）/（靶細胞最大吸光度值-靶細胞自發吸光度值）×100%。

1.6.10 放線菌酮（CHX）和蛋白酶體抑制劑MG132 處理 將HL-60 細胞以1 × 106個/孔接種于6 孔板中，使用50μg/mL 的CHX 處理0、4、8、12 h。在收獲細胞前使用蛋白酶體抑制劑MG132（20 μmol/L）處理6 h。最后通過Western Blot 法檢測c-MYC蛋白表達。

1.6.11 Western Blot和Co-IP 使用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，應用BCA 試劑盒測定蛋白質的濃度并煮沸變性。將蛋白質進行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后，轉移至PVDF 膜上。使用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，加入稀釋的抗體包括抗MYH9（1∶1 000）、抗USP7（1∶1 000）、抗c-MYC（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜，加入HRP-IgG 二抗室溫孵育1 h。TBST 再次洗膜，ECL 對蛋白條帶顯影，使用ImageJ 軟件分析各目的蛋白條帶的相對灰度值，GAPDH作為內參。

對于Co-IP，使用Pierce Co-IP 試劑盒提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度后將蛋白質與抗體[抗MYH9（1∶1 000）、抗USP7（1∶1 000）、抗c-MYC（1∶1 000）或IgG（陰性對照）]一起孵育過夜，加入泛素結合酶抗體并且用蛋白A/G瓊脂糖行免疫沉淀，洗滌混合物后進行Western Blot 分析，確定c-MYC 的表達，同時通過泛素結合酶表達確定分子間的作用情況。

1.7 統計方法采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差 （±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。所有實驗均獨立重復3次。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 華蟾素抑制異種移植瘤的生長并增強CD8+T細胞抗腫瘤能力構建異種移植瘤模型，使用華蟾素（4 mg/kg）治療。結果顯示，與對照組比較，華蟾素組肉眼可見腫瘤縮小（圖2-A），測量腫瘤體積顯著減小（P＜0.05）（圖2-B），腫瘤組織中CD8的熒光強度增強（圖2-C）及IL-2 和IFN-γ 水平升高（P＜0.05）（圖2-D）。以上結果表明，華蟾素可抑制HL-60 細胞在體內生長，增強CD8+T 細胞抗腫瘤能力。

圖2 華蟾素抑制異種移植瘤的生長并增強CD8+T細胞抗腫瘤能力Figure 2 Cinobufotalin inhibits the growth of allograft tumors and enhances the anti-tumor ability of CD8+T cells

2.2 華蟾素抑制AML細胞活力、侵襲，促進細胞凋亡使用華蟾素（0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μmol/L）處理HL-60 細胞，CCK-8 法檢測細胞活力，結果表明華蟾素以濃度依賴性的方式抑制細胞活力，IC50值為0.47，見圖3-A。使用華蟾素（0.25、0.5、0.75 μmol/L）處理HL-60 細胞，Transwell 檢測細胞侵襲能力，結果顯示，與對照組比較，華蟾素各濃度組AML 細胞侵襲數目呈濃度依賴性降低（P＜0.05），見圖3-B。TUNEL 檢測結果顯示，華蟾素能夠以濃度依賴性促進AML 細胞凋亡，見圖3-C。以上結果表明，華蟾素可顯著抑制AML細胞活力、侵襲，促進細胞凋亡。

圖3 華蟾素抑制AML細胞活力、侵襲，促進細胞凋亡Figure 3 Cinobufotalin inhibits AML cell viability and invasion and induces cell apoptosis

2.3 華蟾素增強CD8+ T 細胞的抗腫瘤能力將HL-60細胞與CD8+T細胞以1∶3的比例共培養，使用華蟾素（0.25、0.5、0.75 μmol/L）處理。結果顯示，與對照組比較，華蟾素各濃度組細胞表面標志物CD25 表達上調，細胞因子IL-2 和IFN-γ 水平升高，同時華蟾素處理還增強CD8+T 細胞對HL-60細胞的毒性，均呈濃度依賴性。見表1。

表1 華蟾素對CD8+T細胞抗腫瘤能力的影響Table 1 Effects of cinobufotalin on the anti-tumor ability of CD8+T cells （± s）

表1 華蟾素對CD8+T細胞抗腫瘤能力的影響Table 1 Effects of cinobufotalin on the anti-tumor ability of CD8+T cells （± s）

注：①P＜0.05，與對照組比較

?

2.4 華蟾素通過抑制MYH9/USP7 促進c-MYC泛素化和降解分子對接結果顯示華蟾素和MYH9的分子對接結合能為-9.9 kcal·mol-1，結合作用強烈且形成多個作用鍵，見圖4-A。使用華蟾素（0.25、0.5、0.75μmol/L）處理HL-60細胞，Western Blot 法檢測MYH9、USP7 和c-MYC 的表達，結果表明，相比對照組，華蟾素可抑制MYH9、USP7和c-MYC 的表達，見圖4-B。Co-IP 法檢測結果表明，MYH9 通過募集USP7 抑制c-MYC 的泛素化，見圖4-C。圖4-D結果表明，相比對照組，華蟾素能夠抑制c-MYC 的蛋白表達，蛋白酶體抑制劑MG132 能夠促進c-MYC 的蛋白表達，而華蟾素能夠逆轉MG132 對c-MYC 的促進作用，促進c-MYC蛋白降解。

圖4 華蟾素通過抑制MYH9/USP7促進c-MYC泛素化和降解Figure 4 Cinobufotalin promotes c-MYC ubiquitination and degradation by inhibiting MYH9/USP7

2.5 華蟾素通過抑制MYH9/USP7/c-MYC 通路增強CD8+ T 細胞的抗腫瘤活性為了驗證華蟾素在AML 中的作用機制，本研究評估過表達MYH9對CD8+T 細胞功能的影響。結果顯示：與對照組比較，華蟾素組CD25陽性細胞比例，IL-2、IFN-γ水平和細胞毒性增強，而MYH9 組則相反（均P＜0.01）；與華蟾素組比較，華蟾素+MYH9 組的CD25 陽性細胞比例，IL-2、IFN-γ 水平和細胞毒性均被抑制（均P＜0.01）。表明華蟾素對CD8+T 細胞抗腫瘤活性的作用能夠被MYH9 過表達逆轉。見表2。Western Blot檢測結果顯示，與MYH9組比較，華蟾素0.75 μmol/L+MYH9 組MYH9、USP7 和c-MYC的蛋白表達水平均降低（P＜0.01），見表3。

表2 各組HL-60細胞活化后CD25陽性細胞比例，IL-2、IFN-γ水平和細胞毒性比較Table 2 Comparison of proportion of CD25 positive cells，concentration of IL-2，IFN-γ and cytotoxicity among various groups of activated HL-60 cells （± s）

表2 各組HL-60細胞活化后CD25陽性細胞比例，IL-2、IFN-γ水平和細胞毒性比較Table 2 Comparison of proportion of CD25 positive cells，concentration of IL-2，IFN-γ and cytotoxicity among various groups of activated HL-60 cells （± s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與華蟾素0.75μmol/L組比較

?

表3 各組HL-60細胞MYH9、USP7、c-MYC相對蛋白表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expressions of MYH9，USP7 and c-MYC in HL-60 cells among various groups （± s）

表3 各組HL-60細胞MYH9、USP7、c-MYC相對蛋白表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expressions of MYH9，USP7 and c-MYC in HL-60 cells among various groups （± s）

注：①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與華蟾素0.75μmol·L-1組比較

?

3 討論

目前急性髓系白血病（AML）的治療方法主要包括阿糖胞苷聯合柔紅霉素的標準“7+3 方案”、分子靶向治療、同種異體造血干細胞移植[11]。盡管在過去幾年里批準了一些新的分子靶向療法，但AML 的預后仍不理想[12]。有研究[13]表明，通過靶向激活與自然殺傷細胞和T細胞免疫識別的相關受體可以抑制AML 免疫逃逸。臨床研究[14-15，5]表明，華蟾素在膽囊癌、肺癌、結腸癌中均具有良好的抗癌活性；但其在AML 中的作用和相關分子機制尚不清楚。本研究發現華蟾素通過減弱MYH9介導的c-MYC 去泛素化抑制AML 細胞活力、侵襲，并促進細胞凋亡。同時，華蟾素還能夠增強CD8+T細胞抗腫瘤能力，抑制AML細胞免疫逃逸。

AML 免疫逃逸涉及多種機制，主要包括抗原呈遞分子減少、T 細胞和NK 細胞的細胞毒功能抑制、免疫微環境的改變[16]。腫瘤部位T細胞的存在是啟動免疫識別和殺死AML 細胞的先決條件。據報道，活化的CD4+和CD8+T 細胞可以直接抑制AML 的進展，且腫瘤部位中淋巴細胞和T 細胞的浸潤增多與AML 的預后改善相關[17-18]。白血病細胞衍生的外泌體通過抑制CD8+T 細胞的免疫功能誘導AML 細胞免疫逃逸[19]。本研究結果表明，華蟾素處理可上調CD8+T 細胞表面激活標志物CD25的表達，促進效應細胞因子IL-2 和IFN-γ 的生成增加。此外，華蟾素處理還增強CD8+T 細胞對HL-60 細胞的毒性。提示華蟾素處理可通過增強CD8+T細胞的免疫功能抑制AML細胞免疫逃逸。

MYH9最初被發現其異常突變會導致血小板減少癥，最近的研究表明MYH9 作為致癌基因，在人類多種癌癥（如肝細胞癌、膠質瘤）中過度表達，促進癌細胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥[20-21]。據報道，抑制MYH9 的表達可以增加結直腸癌腫瘤微環境中CD8+T 細胞的浸潤[22]。c-MYC 是一個關鍵的癌基因，靶向c-MYC 核定位區域并通過泛素-蛋白體（UPS）途徑促進c-MYC 蛋白降解可以有效消退包括AML 在內的多種高表達c-MYC 的腫瘤[23]。泛素化是一種蛋白質翻譯后修飾，UPS 定向降解是抑制細胞內c-MYC 表達的主要方式之一[24]。既往已有關于肺癌的研究[10]表明，MYH9 表達的下調抑制USP7（一種去泛素化酶）的募集，進而促進c-MYC 泛素化降解。本研究結果表明，華蟾素抑制MYH9、USP7 和c-MYC 的表達，進一步研究顯示MYH9 可以招募USP7 形成泛素連接酶復合物，并增強c-MYC 的穩定性。華蟾素處理后的MYH9 表達下調，對USP7 的招募減少。MG132 是一種蛋白酶體抑制劑，通過抑制細胞內蛋白酶體活性促進蛋白質的穩定性[25]。本研究使用MG132穩定細胞中c-MYC 的蛋白表達，發現華蟾素具逆轉MG132 穩定c-MYC 蛋白的作用，促進c-MYC的泛素化和降解。

綜上所述，華蟾素可以抑制AML 細胞惡性生物行為，并通過增強CD8+T 細胞的抗腫瘤能力抑制細胞免疫逃逸。華蟾素作為一種潛在的抗癌劑可通過抑制MYH9/USP7通路誘導c-MYC 降解在AML中發揮抑癌作用。然而，本研究也存在一些局限性和不足之處。首先，本研究主要基于體外細胞和裸鼠模型，在臨床研究方面的數據信息并不明確，需要進一步進行臨床前和臨床試驗來驗證華蟾素在治療AML 中的療效和安全性。其次，本研究未對華蟾素與其他常用抗癌藥物的聯合應用進行探索，如華蟾素與化療藥物的協同效應等。未來，有待深入研究華蟾素在AML 治療中的實際應用潛力，并進一步探索其作用機制。