南極磷蝦活性肽對(duì)非酒精性脂肪肝病模型的保護(hù)作用研究

駱鑫鑫，胡渝東，王 斌，趙玉勤

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022)

南極磷蝦Euphausia superba 是一類(lèi)屬甲殼綱磷蝦目的多年生海洋浮游甲殼動(dòng)物，是地球上生物量最大、繁衍最成功的多細(xì)胞生物之一，因其資源豐富的特點(diǎn)而成為南極食物鏈和海洋生態(tài)系統(tǒng)中極為重要的組成部分[1]。南極磷蝦生活方式以群居為主，這種特性使其在資源儲(chǔ)藏量上顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)[2]。南極磷蝦具有高蛋白、低脂肪和礦物質(zhì)含量豐富等特點(diǎn)，并且其龐大的生物量為其應(yīng)用價(jià)值提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，成為天然的蛋白質(zhì)資源，對(duì)人體具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-4]。在保健品、食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，南極磷蝦在其中有著極大的應(yīng)用潛力[5]。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種常見(jiàn)的慢性肝病[6]。它與人體代謝活動(dòng)密切相關(guān)[7]，指人體在沒(méi)有飲酒過(guò)量的情況下，肝臟組織中的脂肪含量占肝臟重量5%以上的病理狀況。NAFLD 又被認(rèn)為是代謝綜合征在人體肝臟中的表現(xiàn)[8-9]，它與肥胖[10]、胰島素抵抗(IR)[11]、糖尿病、血脂異常[12]以及體內(nèi)氧化應(yīng)激[13]和炎癥[14]等疾病密切相關(guān)。目前認(rèn)為，過(guò)量的游離脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)在肝臟中蓄積會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)失衡，進(jìn)而增加了肝臟的氧化應(yīng)激水平以及炎癥反應(yīng)，使得肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器出現(xiàn)損傷和功能障礙。因此，減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和緩解炎癥反應(yīng)對(duì)于預(yù)防和治療NAFLD 而言具有重要意義。

海洋生物活性肽是一類(lèi)從海洋生物中提取出來(lái)由2～20 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)片段。海洋生物活性肽具有多樣的生物活性，主要原因是活性肽的氨基酸組成及序列的不同[15]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)海洋生物活性肽具有抗氧化[16]、抗腫瘤[17]、降血壓[18]、降血脂[19]等多種活性，且具有高度專(zhuān)一性、毒性小和生物活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，該研究采用南極磷蝦活性肽為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)建立體外NAFLD 細(xì)胞模型來(lái)探究南極磷蝦活性肽保肝護(hù)肝活性及其作用機(jī)制，為南極磷蝦活性肽資源的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

人肝癌細(xì)胞HepG2 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

南極磷蝦活性肽F1-F13，其氨基酸序列為Val-Asp-Lys(F1)，Val-Glu-Ala-Asp(F2)，Val-Ala-Lys-Arg-Ser(F3)，Val-Gly-Lys(F4)，Val-Gly-Lys-Trp(F5)，Ile-Asn-Lys(F6)，Ala-Ser-Gln(F7)，Ile-Asn-Lys-Trp-Trp(F8)，Ile-Met-Pro(F9)，Ile-Met-Pro-Lys-Asn(F10)，Phe-Leu-Ala(F11)，Lys-Ile-Thr(F12)，Val-Glu(F13)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)試劑見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑Tab.1 The experimental reagents

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器Tab.2 The experimental instruments

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外NAFLD 細(xì)胞模型的建立

(1)細(xì)胞分組

取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HepG2 細(xì)胞接種于不同孔板中，細(xì)胞分組如下：A：空白組：無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基；B：樣品組：無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基+不同濃度OA。實(shí)驗(yàn)中，96 孔板中為200 μL/孔，12 孔板中為1 mL/孔。

(2)OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞(HepG2)接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中孵育。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸棄，每孔加入180 μL 無(wú)血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓12 h。之后分為空白組和樣品組，空白組加入20 μL 無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，樣品組加入不同濃度的OA(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1)20 μL，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加MTT 溶液培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)液體倒棄，孔內(nèi)加入DMSO 避光震蕩，之后在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值。MTT 法測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，計(jì)算公式為：

(3) OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響

取HepG2 細(xì)胞接種于12 孔板中。細(xì)胞貼壁后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸棄，每孔加入0.9 mL 無(wú)血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓12 h。之后空白組加入100 μL 無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，樣品組加入不同濃度OA(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1)100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

(4) OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞甘油三酯(TG)含量的影響

細(xì)胞給藥及處理同1.2.1-(3)。根據(jù)TG 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，在96 孔板上設(shè)空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組、樣品組，后每孔加入工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min。在510 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，計(jì)算出樣本中甘油三酯的含量。

1.2.2 篩選對(duì)體外NAFLD 模型具有保護(hù)作用的南極磷蝦活性肽

(1) 南極磷蝦活性肽對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響

實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1-(2)，南極磷蝦活性肽F1-F13 濃度為300 μmol·L-1，作用時(shí)間為48 h。

(2) 細(xì)胞分組及給藥

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HepG2 細(xì)胞接種于不同孔板中，細(xì)胞分組如下：

空白組：無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(饑餓)36 h；

模型組：饑餓培養(yǎng)12 h 后，加入OA(0.4 mmol·L-1)培養(yǎng)24 h；

陽(yáng)性藥組：饑餓培養(yǎng)時(shí)加入NAC(2 mmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培養(yǎng)24 h；

南極磷蝦活性肽組：饑餓培養(yǎng)時(shí)加入F1-F13(300 μmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培養(yǎng)24 h。

(3) 南極磷蝦活性肽對(duì)NAFLD 細(xì)胞模型TG 含量的影響

實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1-(4)。

1.2.3 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型降脂活性研究

(1) 細(xì)胞分組及給藥

細(xì)胞分組中空白組、模型組、陽(yáng)性藥組同1.2.2-(2)；南極磷蝦活性肽組：饑餓培養(yǎng)時(shí)加入F13(100、200、300 μmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培養(yǎng)24 h。

(2) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型脂質(zhì)堆積的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1-(3)。

(3) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型TG 的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.1-(4)。

(4) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型膽固醇(TC)含量的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，根據(jù)T-CHO 測(cè)定試劑盒說(shuō)明，在96 孔板中設(shè)空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組、樣品組，后每孔加入工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min。在510 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，計(jì)算出樣本中膽固醇的含量。

式中：OD樣本為樣本吸光度；OD空白為空白組吸光度值；C校準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mmol·mL-1。

1.2.4 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型抗氧化活性研究

(1) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型活性氧(ROS)含量的影響

取HepG2 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板。置于細(xì)胞孵育恒溫箱中孵育24 h。細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，后棄去培養(yǎng)液用PBS 洗滌2 次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA 熒光探針溶液，孵育1 h 后，用PBS 洗滌2 次，放置于暗室中，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察、拍攝細(xì)胞熒光情況。使用酶標(biāo)儀測(cè)定光強(qiáng)(激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm/發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm)。

(2) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟參照表3。

表3 CAT 活力測(cè)定操作表Tab.3 CAT vitality measurement operation table

上述試劑混勻，在紫外波長(zhǎng)405 nm 處，測(cè)定吸光度。計(jì)算公式如下所示：

(3) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)表4。

表4 SOD 活力測(cè)定操作表Tab.4 SOD vitality measurement operation table

計(jì)算公式：

(4) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型丙二醛(MDA)含量的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)表5。

表5 MDA 含量試劑盒測(cè)定操作表Tab.5 Operation table for determining MDA content kit

離心管蓋上后，刺出小孔，振蕩混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，離心取上清，在532 nm 處測(cè)定吸光度。

(5) 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力的影響

細(xì)胞分組及給藥同1.2.3-(1)，實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)表6、7。

表6 GSH-Px 活力測(cè)定操作表(一)Tab.6 GSH-Px activity test operation table (1)

表7 GSH-Px 活力測(cè)定操作表(二)Tab.7 GSH-Px activity test operation table (2)

混勻后，靜置15 min，在紫外波長(zhǎng)412 nm 處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如下：

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 體外NAFLD 細(xì)胞模型的建立

2.1.1 OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響

以不添加OA 的細(xì)胞(空白組)活性為100%，將0.2～0.8 mmol·L-1OA 處理預(yù)先饑餓12 h 的HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞活性見(jiàn)圖1。

圖1 OA 濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of OA concentrationon the activity in HepG2 cells

由圖1 可知，HepG2 細(xì)胞的活性隨著OA 濃度增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通常細(xì)胞存活率大于90%被認(rèn)為細(xì)胞生長(zhǎng)未受到明顯影響。0.4 mmol·L-1OA 處理的HepG2 細(xì)胞的活性為102.25%±1.88%，與空白組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。而0.6～0.8 mmol·L-1OA 處理的HepG2 細(xì)胞的活性降至86.55%±3.14%和23.88%±1.44%，且與空白組之間存在極顯著差異(P＜0.001)。因此，OA 濃度在0.4 mmol·L-1以?xún)?nèi)時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。

2.1.2 OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響

采用油紅O 染色法評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變性程度。如圖2 所示，不添加OA 的HepG2 細(xì)胞內(nèi)未觀察到明顯的紅色脂滴，而加入不同濃度的OA 后，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴數(shù)量增加，與空白組有明顯差異。而隨著OA 濃度(0.4～0.8 mmol·L-1)的增加，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的數(shù)量以濃度依賴(lài)性方式增加，且具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。測(cè)得吸光度與脂滴數(shù)量趨勢(shì)一致。其中，0.4 mmol·L-1OA 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)存在大量紅色脂滴，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積明顯。

圖2 OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響Fig.2 Effect of OA on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells

2.1.3 OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞甘油三酯(TG)含量的影響

通過(guò)TG 含量試劑盒檢測(cè)方法來(lái)定量評(píng)價(jià)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)沉積的程度。如圖3 所示，可以明顯看出隨著OA 濃度的增加，HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量逐漸增加。不添加OA 的HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量?jī)H為(0.017±0.003) mmol·gprot-1，而當(dāng)加入0.4 mmol·L-1OA 時(shí)，HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量與空白組之間存在極顯著差異(P＜0.001)，增加至(0.045±0.002) mmol·gprot-1。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明0.4 mmol·L-1OA 誘導(dǎo)能夠顯著增加HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量，從而造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

圖3 OA 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量的影響Fig.3 Effect of OA on TG content in HepG2 cells

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：0.4 mmol·L-1及以下濃度的OA 培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，而0.4 mmol·L-1以上濃度的OA 對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，細(xì)胞存活率降至90%以下；通過(guò)油紅O 染色實(shí)驗(yàn)，觀察到不同濃度的OA 均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。但0.2 mmol·L-1OA 組細(xì)胞內(nèi)僅有少量脂滴存在；而0.4 mmol·L-1OA 組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴較多并呈環(huán)狀位于胞內(nèi)，且與空白組之間存在極顯著性差異(P＜0.001)；之后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG 含量，結(jié)果表明0.4 mmol·L-1OA 組細(xì)胞內(nèi)TG 含量明顯升高，且與空白組之間存在極顯著性差異(P＜0.001)。因此，選用對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響且脂質(zhì)堆積明顯的0.4 mmol·L-1OA 濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的造模液濃度。

2.2 篩選對(duì)體外NAFLD 模型具有保護(hù)作用的南極磷蝦活性肽

2.2.1 南極磷蝦活性肽對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響

樣品組加入300 μmol·L-1活性肽(F1-F13)作用細(xì)胞48 h，空白組正常培養(yǎng)。以MTT 測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率在90%上被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。結(jié)果見(jiàn)圖4，13 條活性肽均對(duì)HepG2 細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。

圖4 南極磷蝦活性肽(F1-F13)對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effect of F1-F13 on the activity in HepG2 cells

圖5 F1-F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量的影響Fig.5 Effect of F1-F13 on TG content in HepG2 cells

2.2.2 南極磷蝦活性肽對(duì)NAFLD 細(xì)胞模型TG 含量的影響

通過(guò)TG 試劑盒檢測(cè)方法評(píng)價(jià)13 條南極磷蝦肽對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中TG 含量的影響。由圖5 所示，與空白組相比較，0.4 mmol·L-1OA 處理的細(xì)胞中TG 含量顯著增加(P＜0.001)。隨著300 μmol·L-1不同活性肽的加入，F(xiàn)8、F9、F13 組細(xì)胞中TG 均有減少的趨勢(shì)，且與模型組之間存在顯著性差異。其他組細(xì)胞TG 含量則不存在顯著性差異(P＞0.05)。因此，選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果中極顯著降低TG 含量的F13 活性肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(P＜0.001)。

2.3 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型降脂活性研究

2.3.1 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型脂質(zhì)堆積的影響

通過(guò)油紅O 染色實(shí)驗(yàn)觀察F13 100～300 μmol·L-1濃度對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積的影響，并在染色完成后加入異丙醇，在570 nm 下測(cè)定吸光度。如圖6 所示，與模型組相比較，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積并無(wú)明顯減少(P＞0.05)。F13 在濃度為200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積含量極顯著減少(P＜0.001)；當(dāng)F13 濃度為300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積程度極顯著減輕(P＜0.001)。如圖6 所示，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度隨著肽濃度的增加而減輕，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖6 不同濃度F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響Fig.6 Effect of F13 at different concentration intracellular lipid accumulation in HepG2 cells

2.3.2 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型TG的影響

通過(guò)TG 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中甘油三酯含量的影響。由圖7 所示，與模型組相比較，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TG含量明顯減少(P＜0.05)；F13 在濃度為200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TG 含量較顯著降低(P＜0.01)，當(dāng)F13 濃度為300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TG 含量極顯著降低(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量逐漸減少，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖7 不同濃度F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量的影響Fig.7 Effect of F13 at different concentrationson TG content in HepG2 cells

2.3.3 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型TC含量的影響

通過(guò)TC 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中膽固醇含量的影響。由圖8 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TC含量顯著降低(P＜0.05)；F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TC 含量極顯著降低(P＜0.001)。如圖8 所示，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)TC 含量逐漸減少，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖8 不同濃度F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)TC 含量的影響Fig.8 Effect of F13 at different concentrationson TC content in HepG2 cells

2.4 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型抗氧化活性研究

2.4.1 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型活性氧(ROS)含量的影響

通過(guò)DCFH-DA 染色法觀察并計(jì)算F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中活性氧含量變化。如圖9 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量顯著降低(P＜0.05)；F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量極顯著降低(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量逐漸減少，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖9 不同濃度F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響Fig.9 Effect of F13 at different concentrationson ROS content in HepG2 cells

2.4.2 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的影響

通過(guò)CAT 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶活力的影響。由圖10 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CAT 含量顯著升高(P＜0.05)；F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CAT 含量極顯著升高(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)CAT 含量也隨之增加，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖10 不同濃度下F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞中CAT 活力的影響Fig.10 Effect of F13 at different concentrations on CAT activity in HepG2 cells

2.4.3 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

通過(guò)SOD 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力的影響。如圖11 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的SOD 含量明顯增加(P＜0.05)；F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的SOD 含量極顯著增加(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)SOD 含量也隨之增加，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖11 不同濃度下F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞中SOD 活力的影響Fig.11 Effect of F13 at different concentrations on SOD activity in HepG2 cells

2.4.4 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型丙二醛(MDA)含量的影響

通過(guò)MDA 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量的影響。如圖12 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量明顯減少(P＜0.05)；當(dāng)F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量極顯著降低(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量逐漸減少，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

圖12 不同濃度下F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞中MDA 含量的影響Fig.12 Effect of F13 at different concentrations on MDA content in HepG2 cells

2.4.5 南極磷蝦活性肽對(duì)體外NAFLD 模型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力的影響

通過(guò)GSH-Px 試劑盒測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)F13 在100～300 μmol·L-1濃度下對(duì)OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的影響。如圖13 所示，相較于模型組，F(xiàn)13 在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px 含量較顯著升高(P＜0.01)；當(dāng)F13 濃度為200 μmol·L-1和300 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px 含量極顯著升高(P＜0.001)。由圖示可知，隨著肽濃度的增加，樣品組HepG2 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px 含量逐漸升高，且呈濃度依賴(lài)性。

圖13 不同濃度下F13 對(duì)HepG2 細(xì)胞中GSH-Px 活力的影響Fig.13 Effect of F13 at different concentrations onGSH-Px activity in HepG2 cells

3 結(jié)論

該研究利用HepG2 細(xì)胞建立非酒精性脂肪肝體外模型，對(duì)南極磷蝦活性肽進(jìn)行篩選和活性研究，并對(duì)其保肝護(hù)肝作用機(jī)制進(jìn)行探討。利用油紅O 染色實(shí)驗(yàn)和TG 試劑盒檢測(cè)得出0.4 mmol·L-1OA 能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積和TG 含量。因此，選用對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響且誘導(dǎo)脂質(zhì)堆積明顯的0.4 mmol·L-1OA 作為建立體外NAFLD 細(xì)胞模型的最佳濃度。進(jìn)一步利用油紅O 染色實(shí)驗(yàn)以及TG、TC 含量試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)篩選得到的南極磷蝦活性肽Val-Glu (F13)的降脂活性；利用DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平；測(cè)定NAFLD 細(xì)胞模型中MDA 含量、CAT、SOD 及GSH-Px 活力來(lái)評(píng)價(jià)南極磷蝦活性肽Val-Glu 的抗氧化活性；顯示出南極磷蝦活性肽Val-Glu 具有良好的降脂、抗氧化等體外NAFLD 細(xì)胞模型保護(hù)作用，為南極磷蝦的高值化利用、功能性食品和新型保肝護(hù)肝藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。