鹽酸布比卡因注射液中基因毒性雜質含量測定與來源分析*

周冰捷，王非夢，2，李 超，羅立駿，徐 登，馮 琴，梁 靜△

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監督管理局麻醉精神藥品質量監測重點實驗室，重慶 401121；2.西南大學藥學院，重慶 400716）

鹽酸布比卡因注射液是一種長效酰胺類局部麻醉藥，用于局部浸潤麻醉、外周神經阻滯和椎管內阻滯，麻醉和鎮痛作用強烈，藥效持續時間較長，能有效改善患者的預后，可避免阿片類藥物造成的過度鎮靜及呼吸抑制等不良反應［1-3］，臨床應用范圍較廣［4］。但制備過程中部分雜質的引入會影響制劑的安全性，其中2，6-二甲基苯胺（雜質F）是制備布比卡因等酰苯胺類局部麻醉藥的關鍵起始物料［5-6］。雜質F 是一種基因毒性雜質，可直接或間接損傷細胞DNA，具有基因毒性和致癌作用，已被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為2B 類致癌物，必須嚴格控制含量［7-13］。鹽酸布比卡因注射液現行質量標準中均未對雜質F 進行有效控制［14］。藥品標準能否準確控制有關物質直接關系到藥品的質量可控性與安全性［15-16］，其中基因毒性雜質的研究至關重要［7］。本研究中建立了測定鹽酸布比卡因注射液中基因毒性雜質F含量的高效液相色譜法，并從原料藥合成工藝、輔料、制劑生產工藝、制劑所用原料藥4 個方面對5 家生產企業提供的樣品進行雜質F 的檢測和分析，以更好地控制和評價藥品質量，并為后續藥品標準的修訂提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XSE204 型電子天平（精度為0.1 mg），Quintix 224-1CN型電子天平（精度為0.01 mg），均購自瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DT型新芝超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為600 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸布比卡因原料藥（生產企業A-C，共9批）；鹽酸布比卡因注射液（生產企業B，D-G，共94 批）；鹽酸布比卡因對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為101034-202103，含量為94.6%）；雜質F 對照品（美國Sinco Pharmachem，批號為18-10-1501，含量為99.48%）；乙腈為色譜純，水為二次純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Xbridge Shield RP18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A 為0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀6.8 g 與氫氧化鈉1.87 g，加水至1 000 mL，調pH 至8.0）-乙腈（65∶35，V/V），B 為乙腈，梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下，系統適用性溶液色譜圖中，出峰順序依次為雜質F 和布比卡因，且兩峰間的分離度符合要求；對照品溶液色譜圖中，理論板數按布比卡因峰計大于3 000，且雜質F 峰高的信噪比（S/N）大于10。色譜圖見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1.雜質F 2.布比卡因A.系統適用性溶液 B.對照品溶液 C.供試品溶液Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test1.Impurity F 2.BupivacaineA.System suitability solution B.Reference solution C.Test solution

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品，即得。

對照品溶液：取雜質F對照品適量，精密稱定，用流動相A稀釋成每1 mL約含雜質F 1.5μg的溶液，搖勻，即得。

系統適用性溶液：取鹽酸布比卡因和雜質F對照品各適量，精密稱定，用流動相A 稀釋成每1 mL 約含鹽酸布比卡因5 mg和雜質F 1.5μg的混合溶液，搖勻，即得。

空白輔料溶液：取除主藥的輔料2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加70%容量瓶體積的流動相A，振搖至完全崩散，超聲并不時強烈振搖，冷卻至室溫，用流動相A稀釋并定容，搖勻，離心，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下空白輔料溶劑，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結果表明空白輔料溶液無干擾。

線性關系考察：取雜質F對照品適量，精密稱定，用流動相A 定量稀釋成每1 mL 分別含雜質F 0.15，0.75，1.5，2.25，3.00μg 的溶液，搖勻，精密量取上述溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以雜質F 的質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=25 224C-343.45（r=1.000 0，n=5）。結果表明，雜質F 的質量濃度在0.15～3μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品6 瓶，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果的RSD為9.27%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取雜質F對照品適量，精密稱定，共9 份，用供試品溶液稀釋成每1 mL 含雜質F 0.75，1.5，2.25 μg 的溶液，各3 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果平均回收率為99.41%，RSD為2.06%（n=9），表明方法準確度良好。

2.4 雜質F 含量測定

取生產企業B，D，E，F，G 的94 批樣品，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果生產企業B，D，F，G 的85 批樣品中均未檢出雜質F；企業E的9批樣品中均檢出雜質F，含量分別為0.000 4%，0.000 4%，0.000 4%，0.000 6%，0.000 5%，0.000 5%，0.000 4%，0.000 4%，0.000 3%。

3 討論

3.1 雜質F 來源

3.1.1 原料藥合成工藝

鹽酸布比卡因原料藥的國內生產企業有3家，分別為生產企業A、生產企業B和生產企業C。本次國家藥品抽驗樣品所用原料藥上述3家生產企業均有涉及，調研發現，原料藥的合成路線基本一致，起始物均由N-（2'，6'-二甲苯基）-2-哌啶甲酰胺（雜質B）和溴代正丁烷通過縮合反應生成布比卡因堿基，再經脫堿基生成鹽酸布比卡因。

通過分析原料藥的合成工藝認為，在原料藥合成過程中有2個風險點可能會引入雜質F。風險點1，雜質F為起始反應物料鹽酸布比卡因雜質B的副產物，有可能由雜質B 引入；風險點2，根據強降解試驗結果，在強酸條件下，布比卡因會降解產生雜質F，在合成路線中，布比卡因堿基酸化得到布比卡因，鹽酸與布比卡因會結合成鹽酸鹽的形式，從而引入雜質F。本研究中按2.1項下色譜條件測定原料藥生產企業A，B，C的9批樣品，結果均未檢出雜質F，表明各原料藥生產企業對該基因毒性雜質的風險控制良好。

3.1.2 輔料

鹽酸布比卡因注射液的輔料單一，抽檢的5家生產企業均僅以0.9%氯化鈉溶液作為等滲調節劑。按2.1項下有關物質檢查方法，對生產企業B，D，E，G 提供的樣品進行雜質F 檢查（企業F 未能提供原輔料），結果均未檢出雜質F。

3.1.3 制劑生產工藝

制劑生產工藝：根據影響因素試驗和強降解試驗結果，在強酸條件下，布比卡因會降解產生雜質F，而在強堿、光照、高溫和氧化的強破壞條件下均未產生雜質F。對比各制劑生產企業的生產工藝發現，其生產工藝步驟基本一致，且整個生產過程不會用到強酸和濃酸，均以氫氧化鈉溶液調節pH。可見，制劑的生產及儲存過程中均不會降解產生雜質F。

模擬活性炭生產工藝：在鹽酸布比卡因注射液的生產過程中，生產企業B，E，F 均以活性炭作吸附劑進行熱源吸附、除雜、脫色。其中，生產企業B 和E 在濃配步驟中加入0.1%活性炭，煮沸，保溫攪拌20 min。通過模擬生產企業B 和E 的實際工藝條件，按各處方的用量，分別配制原料藥溶液、原料藥+氯化鈉溶液、原料藥+氯化鈉+活性炭溶液，煮沸，保溫攪拌30 min，考察活性炭的引入對雜質譜的影響。結果生產企業B 和E的樣品中均未檢出雜質F，表明活性炭的使用并不會引入雜質F。但生產企業B 和E 的產品在生產過程中引入活性炭后，雜質譜的數量和含量均出現增長。對比不同企業的雜質檢測結果可知，未使用活性炭的生產企業D和G的樣品雜質譜的數量和含量均較低，而使用了活性炭的生產企業B，E，F 的樣品雜質譜的數量和含量均較高，表明活性炭的使用存在引入其他未知雜質的風險。

模擬高壓滅菌試驗：生產企業E 的滅菌溫度為100 ℃，滅菌時間為30 min。通過模擬滅菌工藝條件，考察滅菌工藝對生產企業E 和F 的樣品中雜質F 含量的影響。結果表明，滅菌工藝并未引起生產企業E 和F 的樣品中雜質F的含量變化，表明滅菌工藝不會使鹽酸布比卡因降解產生雜質F。

3.1.4 制劑所用原料藥

經調研和追溯發現，在抽檢的生產企業E 的產品中，有部分批次產品的原料藥供貨商及批號與生產企業F的部分批次產品所用原料藥一致。生產企業A 提供了2批（批號分別為C053-210402，C053-211002）原料藥的留樣，2批原料藥中均未檢出雜質F；采用相同批次原料藥的生產企業F的注射劑產品中也均未檢出雜質F。

3.2 結語

所建立的方法專屬性強、重復性好、精密度高，可為雜質F 的定量檢測和制劑的質量控制提供參考。此外，從原料藥及合成工藝、輔料、制劑生產工藝、制劑所用原料藥4 個方面探討了雜質F 的來源，認為雜質F 不會在鹽酸布比卡因注射液的生產過程中降解產生，但通過原料藥引入的可能性較大。因此，建議制劑生產企業重視對基因毒性雜質F的控制，加強原料藥的入庫質控，從源頭控制引入風險。