蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 對心肌梗死的保護作用及機制研究*

張 瑤，付賀青，劉 晶，聶慧娟，董 玉，4，劉天龍△

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心血管疾病臨床和基礎(chǔ)研究重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010130；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

心肌梗死（MI）是導(dǎo)致我國人口非正常死亡的主要原因［1］。在缺血條件下，心肌細胞發(fā)生死亡，心臟功能出現(xiàn)進行性降低，最終形成心力衰竭（簡稱心衰）［2］。雖然介入治療能恢復(fù)缺血部位的血供，減少梗死面積和恢復(fù)心臟功能，但由于心肌細胞的不可再生性，介入治療后的短期和長期不良預(yù)后風(fēng)險顯著增加［3］。心肌成纖維細胞在缺血條件下向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的成纖維細胞的增殖屬性顯著增加，且表達大量的細胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、膠原等，這些細胞因子在心肌纖維化的形成過程中發(fā)揮了重要作用［4-5］。在正常生理條件下，心肌細胞主要通過脂肪酸在線粒體中的氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（ATP）以維持心臟的能量消耗；在缺血條件下，心臟的能量代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，心肌細胞線粒體對脂肪酸的氧化磷酸化能力下降，而胞質(zhì)中利用葡萄糖的糖酵解水平增加［6］。因此，調(diào)整心肌細胞病理條件下的代謝模式被視為治療心肌疾病的有效方式［7］。蒙藥在治療心血管疾病方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，廣泛用于缺血性心肌病的治療，且療效顯著。肉豆蔻-5 作為蒙醫(yī)治療心赫依?。ㄈ毖孕募〔。┑慕?jīng)典名方，源于《蒙醫(yī)藥方匯編》，蒙語名“匝迪-5”，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準（蒙藥分冊）》。由于中草藥化學(xué)成分和作用靶點復(fù)雜，肉豆蔻-5保護心肌缺血的分子機制尚不清楚。本研究中利用大鼠心肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 保護MI 的作用機制，進一步開發(fā)該經(jīng)典方劑的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：D6 LAB型小動物超聲系統(tǒng)（飛依諾科技股份有限公司），配有小動物呼吸機；Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermos 公司）；LV100NPOL/Ci-POL 型顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：肉豆蔻（批號為18112702），木香（批號為18090403），土木香（批號為170801），廣棗（批號為190112），蓽茇（批號為180901），均購于內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號為A020-2），肌酸激酶腦型同工酶（CK-MB）檢測試劑盒（批號為E006），均購自南京建成生物工程研究所；改良Masson三色染色液（上海源葉生物科技有限公司，批號為R20381）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，298-96-4），三溴乙醇（批號為T484020），均購自美國Sigma-Aldrich公司。

動物：SPF 級Wistar 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量220～250 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，在溫度22～26 ℃、相對濕度40%～60%環(huán)境喂養(yǎng)。動物實驗經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，所有操作均遵守《實驗動物使用規(guī)范》。

1.2 方法

樣品制備與給藥劑量設(shè)置：按10∶8∶8∶5∶1（m/m/m/m/m）稱取肉豆蔻、木香、土木香、廣棗、蓽茇，共20 kg，加95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮，蒸干，得95%有效部位；藥渣再用50%乙醇回流提取2 次，每次2 h，趁熱用棉花粗濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味，用蒸餾水定容；采用大孔吸附樹脂柱洗脫，先用蒸餾水洗脫，再用50%乙醇洗脫，蒸干洗脫液，得50%有效部位。按有效部位提取率將供試品與0.5%羧甲基纖維素鈉混合，制備混懸液。肉豆蔻-5 的臨床用量為每70 kg體質(zhì)量6 g，根據(jù)人和大鼠的體表面積計算用量，且大鼠的用量為人的6.3 倍，計算得大鼠的干預(yù)劑量為0.54 g/kg。故設(shè)置肉豆蔻-5 高、中、低干預(yù)劑量分別為0.27，0.54，1.08 g/kg。

分組與建模［8-9］：將50 只Wistar 雄性大鼠分為空白對照組（A 組），模型對照組（B 組），肉豆蔻-5高、中、低劑量干預(yù)組（C1組、C2組、C3組），各10 只。在復(fù)制MI模型前，C1組、C2組、C3組大鼠按預(yù)定劑量灌胃相應(yīng)藥物，預(yù)處理1周，A組和B組大鼠灌胃等量羧甲基纖維素鈉。預(yù)處理結(jié)束后，B組、C1組、C2組、C3組大鼠行冠脈左前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)，實驗周期為4周。使用2.5%三溴乙醇麻醉大鼠，每100 g 體質(zhì)量給藥2 mL，麻醉后固定在自制的固定板上，行經(jīng)口氣管插管并連接小動物呼吸機，呼吸機潮氣量設(shè)置為20 mL，呼吸頻率設(shè)置為100 次/ 分，剃毛消毒后，在距離中位線1 cm 處縱向剪開大鼠左胸部皮膚，開口2 cm，在第二肋間行開胸手術(shù)，手術(shù)開口1.0 cm，使用自制開口器撐開切口，剪開心包膜暴露心臟，使用6-0 號尼龍線將冠脈LAD 進行永久性結(jié)扎，結(jié)扎完成后，逐層關(guān)胸，并滯留連接注射器直徑1 mm 的無菌塑料管，縫合后，通過輸液器將胸腔抽為負壓，拔出滯留管。A 組大鼠與B 組、C1組、C2組、C3組大鼠行相同手術(shù)，但不結(jié)扎冠脈LAD。待大鼠蘇醒并恢復(fù)自主呼吸后，拔除氣管插管，放回飼養(yǎng)籠。

樣本處理：實驗結(jié)束后，麻醉大鼠，使用含抗凝劑的采血管行腹主動脈取血后處死大鼠，開胸，取出心臟，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈心臟表面和心腔內(nèi)的血液，剪掉心耳及其連帶的主動脈。將心肌組織由上到下平均分為3 份，上、下端凍存于-80 ℃冰箱用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，中段心肌組織使用4%多聚甲醛固定用于病理學(xué)檢測。收集血液，離心（1 000g）10 min，分離血漿，用于心肌損傷標志物檢測。

外周血心肌損傷標志物水平檢測：利用LDH 試劑盒和CK-MB試劑盒檢測大鼠外周血中LDH和CK-MB水平，評價大鼠心肌損傷水平。

心臟功能檢測：MI 模型建模成功4 周后，通過體外超聲測定左室射血分數(shù)（LVEF），評價心臟功能。

心肌組織TTC染色：實驗結(jié)束后，處死大鼠，并分離心臟。將心臟置-80 ℃冰箱迅速冷凍15 min，取出，用手術(shù)刀將結(jié)扎位置以下部位切成厚度為0.5～1.0 mm的薄片，將薄片置1% TTC 染液中于37 ℃孵育30 min，4%（m/V）多聚甲醛溶液進行固定并拍照。采用Image J V2.3.0軟件統(tǒng)計大鼠心肌梗死面積。

心肌組織Masson 染色：用4%多聚甲醛溶液對心肌組織進行固定，固定48 h 后將組織轉(zhuǎn)移至包埋盒，流水沖洗2 h，依次置入70%乙醇25 min、80%乙醇25 min、90%乙醇30 min、95%乙醇Ⅰ30 min、95%乙醇Ⅱ20 min、100%乙醇Ⅰ10 min、100%乙醇Ⅱ10 min、二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、石蠟Ⅰ10 min、石蠟Ⅱ10 min、石蠟Ⅲ10 min，得可供切片的蠟塊。石蠟切片厚度6μm，于乳頭肌水平橫切，經(jīng)脫蠟、去除內(nèi)源性過氧化物酶后，行Masson染色，評價大鼠心肌纖維化程度。

心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)檢測：基于高劑量肉豆蒄-5治療MI 的效果最佳，本研究中選取了A 組、B 組、C1組各5個樣本進行大鼠心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。由上海中科新生命生物科技有限公司負責(zé)完成，對蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，由本課題組自行完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0軟件V9.1.2分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對心臟功能與心肌損傷的保護作用

與A組比較，B組大鼠的LVEF顯著降低（P＜0.001）；與B 組比較，C1組大鼠的LVEF 顯著升高（P＜0.05）。詳見圖1 A'。與A 組比較，B 組大鼠外周血心肌損傷標志物L(fēng)DH 和CK-MB 水平均顯著升高（P＜0.001）；與B組比較，C1組、C2組大鼠外周血中LDH 和CK-MB 水平均顯著降低（P＜0.05）。可見，肉豆蒄-5 對LDA 結(jié)扎誘導(dǎo)MI 模型大鼠的LDH 和CK-MB 水平升高有抑制作用。詳見圖1 B'和圖1 C'。

圖1 肉豆蔻-5對MI模型大鼠心臟功能與心肌損傷的保護作用（n=5）注：與A組比較，###P ＜0.001；與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。圖2和圖3同。A'.左室射血分數(shù) B'.LDH水平 C'.CK-MB水平Fig.1 Protective effect of Nutmeg-5 on cardiac function and myocardial injury in MI model rats（n=5）Note：Compared with those in group A，###P ＜0.001；Compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1-3）.A'.LVEF B'.LDH level C'.CK-MB level

2.2 對MI 模型的保護作用

與A 組比較，B 組大鼠心臟梗死面積占比顯著增加（P＜0.001）；與B 組比較，C1組、C2組大鼠心臟梗死面積占比均顯著縮?。≒＜0.05）。詳見圖2。

圖2 肉豆蔻-5對MI模型的保護作用（n=5）A'.心肌組織TTC染色結(jié)果 B'.心肌梗死面積占比Fig.2 Protective effect of Nutmeg-5 on the MI model rats（n=5）A'.Results of TTC staining of myocardial tissue B'.Proportion of myocardial infarction area

2.3 對MI 后纖維化的保護作用

心肌組織Masson 染色結(jié)果顯示，LAD 結(jié)扎4 周后，MI 模型大鼠MI 區(qū)域出現(xiàn)嚴重的纖維化，而肉豆蔻-5干預(yù)組大鼠心肌纖維化水平較MI大鼠減輕。詳見圖3 A'。與A 組比較，B 組大鼠的心肌纖維化程度顯著升高（P＜0.001）；與B 組比較，C1組、C2組大鼠的心肌纖維化程度顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3 B'。

圖3 肉豆蔻-5對MI模型大鼠心肌纖維化的保護作用（n=5）A'.心肌組織Masson染色結(jié)果 B'.心肌纖維化程度Fig.3 Protective effect of Nutmeg-5 on myocardial fibrosis in MI model rats（n=5）A'.Results of Masson staining of myocardial tissue B'.Degree of myocardial fibrosis

2.4 大鼠心肌蛋白質(zhì)組學(xué)檢測肉豆蔻-5 保護MI 的機制

為進一步研究肉豆蔻-5 保護MI 的分子機制，本課題組對大鼠心肌組織進行了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。通過4D-Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，得到二級質(zhì)譜986 497 個，其中230 390 個在數(shù)據(jù)庫中被匹配。匹配的質(zhì)譜對應(yīng)總的肽段數(shù)23 589個，唯一肽段總數(shù)21 964個。共3 459種蛋白在心肌組織中被辨識。共鑒定蛋白3 459種，其中3 423種被定量分析。其中，可定量蛋白數(shù)指蛋白在至少1個組別中，有超過1/2的生物學(xué)重復(fù)定量信息。

以組間差異大于1.5 倍（Foldchange ＞1.5 或Foldchange ＜0.67）及組間比較P＜0.05作為篩選組間差異表達蛋白的條件。結(jié)果顯示，與A 組比較，B 組大鼠心肌組織中分別有344 個和362 個蛋白顯著高表達和低表達（P＜0.05）；與B 組比較，C1組大鼠心肌組織中分別有522個和270個蛋白顯著高表達和低表達（P＜0.05）。詳見圖4。

圖4 MI模型大鼠心肌組織蛋白表達水平（n=5）A'.蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)火山圖 B'.差異表達蛋白熱圖Fig.4 Protein expression levels in myocardial tissue of MI model rats（n=5）A'.Volcano plot of proteomic data B'.Heat map of differential-expressed proteins

差異表達蛋白的維恩圖顯示，與A 組比較，B 組有95個顯著低表達的蛋白在C1組大鼠心肌組織中顯著高表達（P＜0.05），而74 個顯著高表達的蛋白在C1組大鼠心肌組織中顯著低表達（P＜0.05），表明肉豆蔻-5對MI 的保護作用與逆轉(zhuǎn)169 個和MI 有關(guān)蛋白的表達有關(guān)。詳見圖5。

圖5 169個與肉豆蔻-5活性相關(guān)的蛋白A'.差異蛋白表達維恩圖 B'.169個蛋白表達熱圖Fig.5 A total of 169 proteins related to Numeg-5 activityA'.Venn diagram of differential-expressed proteins B'.Heat map of 169 proteins

對169 個差異蛋白進行基因集富集分析（GSEA），5 條細胞信號通路被成功富集（P＜0.05），包括代謝通路、氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪性肝病通路、阿爾茨海默病通路、帕金森病通路。詳見圖6。

圖6 與肉豆蔻-5功能相關(guān)蛋白的基因集富集分析結(jié)果Fig.6 GSEA results of proteins related to Nutmeg-5 function

GSEA結(jié)果顯示，代謝通路（EnrichmentScore=0.453 8，P=0.003 7）和氧化磷酸化通路（EnrichmentScore=0.492 8，P=0.044）與心臟功能密切相關(guān)，且肉豆蔻-5干預(yù)能激活代謝通路或氧化磷酸化通路，表明肉豆蔻-5保護MI活性與調(diào)控心肌代謝有關(guān)［10-11］。詳見圖7。

圖7 169個與肉豆蔻-5活性相關(guān)蛋白基因集富集分析結(jié)果A.代謝通路 B.氧化磷酸化通路Fig.7 GSEA results of 169 proteins related to Nutmeng-5 activityA.Metabolic pathways B.Oxidative phosphorylation pathways

3 討論

基于特殊的生存環(huán)境和生活習(xí)慣，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病，蒙醫(yī)稱心赫依?。┦敲晒抛宓貐^(qū)的高發(fā)病。肉豆蔻和廣棗是治療心赫依病的經(jīng)典蒙藥，被應(yīng)用于多種經(jīng)典方劑中。肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻的干燥種仁，作為香料和中藥材被東南亞地區(qū)廣泛使用。研究顯示，肉豆蔻中主要化學(xué)成分為木脂素、新木脂素、二苯烷、苯丙烷、萜類、烷烴、脂肪酸、脂肪酸酯及次要成分，如類固醇、皂苷、三萜類和黃酮類，這些化合物通過抗氧化活性、抗膽固醇血癥、抗動脈粥樣硬化活性而發(fā)揮對心血管疾病的保護作用［12］。廣棗為漆樹科南酸棗屬植物南酸棗，是特色蒙藥資源。中醫(yī)和其他民族醫(yī)學(xué)常以樹皮入藥，功效為解毒、收斂、止痛、止血，用于燒燙傷、外傷出血、牛皮癬；蒙醫(yī)常以干燥的果仁入藥，為心赫依病治療的核心蒙藥。蒙藥廣棗中富含有機酸、酚酸和黃酮類化合物，廣棗提取物在體內(nèi)外對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞增殖的抑制作用顯著，表明對病理性心肌纖維化具有保護作用［13-14］。除肉豆蔻和廣棗外，肉豆蔻-5 中還包括菊科植物木香和土木香、胡椒科胡椒屬植物蓽茇。研究顯示，木香和土木香的主要化學(xué)成分為土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、揮發(fā)油、木香內(nèi)酯、脫氫木香內(nèi)酯等，上述化合物均對心血管疾病有保護作用［15-17］。

在正常生理條件下，心臟所需95%的ATP 來源于脂肪酸、碳水化合物（葡萄糖、乳酸）、酮體（乙酰乙酸、β-羥基丁酸）和氨基酸的氧化磷酸化，5%的ATP 通過糖酵解途徑生成，且心肌能根據(jù)外界刺激靈活地利用底物形成ATP，以維持正常的心臟功能［18］。但在病理條件下，心肌細胞能量代謝利用底物的靈活性喪失，ATP的生成更多依賴糖酵解，線粒體對脂肪酸的氧化磷酸化能力顯著降低［19-20］。心肌代謝的改變歸因于病理條件下的心肌細胞線粒體功能障礙和編碼線粒體脂肪酸氧化磷酸化基因表達水平的降低［21-22］。研究顯示，改善病理條件下心肌細胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有望成為維持心臟功能和治療心力衰竭的手段，且民族醫(yī)學(xué)在此方面表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢。目前，很多民族醫(yī)學(xué)方劑及提取物、中藥提取物被報道能通過改善MI 后心肌細胞線粒體功能障礙和調(diào)節(jié)心肌能量代謝而發(fā)揮保護MI的作用［23-24］。本研究中的心肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，MI模型大鼠的心肌代謝通路被抑制，主要涉及脂肪酸的合成，胰高血糖素信號通路，三羧酸循環(huán)及2-氧代羧酸代謝等，而經(jīng)肉豆蔻-5 干預(yù)的MI 模型大鼠心肌組織中上述代謝涉及蛋白的表達水平顯著升高，表明肉豆蔻-5 能通過改善MI 模型大鼠的心肌代謝而發(fā)揮保護MI的作用。

本研究尚存在一定缺陷，主要表現(xiàn)為肉豆蔻-5 成分復(fù)雜，雖有關(guān)于其提取物化學(xué)成分辨別的研究，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未知，能干預(yù)的蛋白靶點未知。后續(xù)研究中，本課題組將著力于從蒙藥基源、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、安全性、有效性、作用靶點和作用機制方面系統(tǒng)評價蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 對MI 的保護作用，為挖掘其應(yīng)用潛力和現(xiàn)代劑型的研發(fā)提供理論依據(jù)。