《中醫方劑大辭典》含柴胡防疫組方規律分析及核心藥對治療新型冠狀病毒肺炎作用機制研究*

汪 彬，李偉霞，，王曉艷，吳婭麗，張 輝，賈金浩，韓 冰，紀秋如，陳小菲，唐進法，△

（1.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院·河南省中藥臨床應用、評價與轉化工程研究中心·河南省中藥臨床藥學中醫藥重點實驗室·河南省中藥安全評價與風險防控工程研究中心，河南 鄭州 450046；3.河南中醫藥大學呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）已成為全球關注的公共衛生事件［1-2］。我國發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》提出，COVID-19 屬中醫“疫病”范疇［3］。柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，始載于《神農本草經》，有和解表里、退熱截瘧功效，能有效治療COVID-19 初期發熱、干咳、乏力的癥狀，具有解熱、鎮痛、抗炎等作用［4-5］。《中醫方劑大辭典》是一部納入國家中醫藥管理局科研課題的方劑學大型工具書，具有全面、準確、易檢、實用等特點［6］。本研究中以《中醫方劑大辭典》為數據來源，運用關聯規則分析、聚類分析等數據挖掘技術［7］，深度挖掘其相關藥物配伍規律，結合網絡藥理學構建成分-靶標-通路網絡，預測柴胡-黃芩治療COVID-19 的潛在作用靶點及作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據挖掘

1.1.1 納入與排除標準

納入標準：明確含柴胡治療與疫病相關的方劑（不計臨證加減藥物）；所載方藥有明確的藥物組成，劑量清楚，且療效明確。

排除標準：藥物組成相同而方名不同的方劑按重復方劑計，藥物組成不同而方名相同的方劑按不同方劑累計；主治病證不明確，《中醫方劑大辭典：第十一冊》病證索引中無法檢索。

1.1.2 數據規范化

錄入中藥以2015 年版《中國藥典（一部）》為標準，并參考全國高等中醫藥院校“十三五”規劃教材《中藥學》《中藥大辭典》《中華本草》進行藥名規范。同種藥物不以地域、炮制方法、別稱區分，均記錄為同種藥物，如將北柴胡、銀柴胡規范為柴胡，炒白術規范為白術，官桂、桂心、桂皮規范為肉桂。

1.1.3 數據統計與分析

采用SPSS Modeler 18.0 軟件對符合納入標準的中藥進行用藥頻率、性味歸經等描述性分析，通過Apriori建模進行關聯規則分析［8］。采用SPSS Statistics 25.0 軟件，利用組間聯接的方法進行系統聚類分析［9-11］。

1.2 網絡藥理學分析

1.2.1 核心藥對柴胡-黃芩與COVID-19 靶點篩選

共篩選到含柴胡的方劑442 首。選用核心藥對柴胡-黃芩進行網絡藥理學分析。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：// tcmsp-e.com/）收集柴胡、黃芩有關成分，采用Swiss TargetPrediction 在線靶點篩選平臺（http：// swisstargetprediction.ch/）篩選靶標，整合數據并去重。在MalaCards 數據庫（https：//www.malacards.org/ ）、TTD 數據庫（https：// db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）中，分別以“COVID-19”為關鍵詞搜索相關靶標，去重后獲得共有靶標。

1.2.2 數據統計與分析

將共有靶標輸入String數據庫（https：//string-db.org/），去除游離蛋白，獲得蛋白質交互作用（PPI）網絡圖，導入Cytoscape 3.9.0 軟件進行網絡構建與分析，并計算Hub 基因。將共有靶標導入Omishare 平臺（https：//www.omicshare.com/ tools/）中的基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集高級分析工具模塊進行可視化分析，采用Cytoscape 3.9.0 軟件對關鍵通路進行成分-靶標-通路網絡構建［12］。

2 結果

2.1 含柴胡防疫方劑高頻用藥的頻次

442 首含柴胡防疫方劑涉及334 味中藥，用藥頻次共4 877次。其中，高頻藥物（頻次≥60次）20味，累計用藥頻次2 658 次，詳見圖1。在20 味高頻藥物中，與柴胡配伍使用最多的為甘草，其次為黃芩和半夏。

圖1 含柴胡防疫方劑用藥頻次分布（頻次≥60）Fig.1 Distribution of medication frequency of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix（frequency ≥60 times）

2.2 含柴胡防疫方劑高頻用藥的四氣五味

高頻用藥的藥性包括溫、平、寒3 種，占比最高的為溫性藥物，有白術、半夏、桂枝、人參等；其次為寒性藥物和平性藥物。高頻用藥藥味包括苦、甘、辛、酸、咸5 種，占比最高的為苦味藥物，有柴胡、白術、檳榔、黃芩等；其次為甘味藥物和辛味藥物。詳見表1和圖2。

表1 含柴胡防疫方劑高頻用藥（頻次≥60次）性味分布Tab.1 Distribution of medicinal natures and flavors of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

圖2 含柴胡防疫方劑高頻藥物（頻次≥60次）性味頻次分布雷達圖A.藥性 B.藥味Fig.2 Radar chart of frequency distribution of natures and flavours of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）A.Medicinal natures B.Medicinal flavors

2.3 含柴胡防疫方劑高頻用藥功效頻次

補氣藥和理氣藥占比最高，其次為清熱瀉火藥、補血藥和發散風寒藥。補氣藥包括甘草、人參等，理氣藥包括青皮、檳榔等，清熱瀉火藥包括黃芩、知母等；發散風寒藥包括桂枝、柴胡等；補血藥包括當歸、川芎等。詳見表2。

表2 含柴胡防疫方劑高頻用藥（頻次≥60次）功效分布（n=20）Tab.2 Distribution of efficacy of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times，n=20）

2.4 基于關聯規則Apriori 算法組方規律分析

采用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件對高頻藥物采用Apriori 算法，設置最低支持度（C）為30%，最小規則置信度（S）為80%，最大前項數為3，提升度≥1.0，共得到135 條關聯規則。關聯規則網絡中，藥物連線越粗，二者間的關聯度越大；反之，關聯度越小。柴胡與補益藥、清熱藥、燥濕化痰藥合用時，配伍使用頻率最高的有甘草、黃芩、半夏、人參、茯苓、陳皮。詳見表3和圖3。

表3 含柴胡防疫方劑高頻藥物（頻次≥60次）關聯規則表Tab.3 Association rules of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

圖3 含柴胡防疫方劑高頻藥物（頻次≥60次）關聯規則網絡Fig.3 Association rule network of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

2.5 含柴胡防疫方劑高頻用藥聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件對前20 味高頻用藥進行系統聚類分析，設置類型為水平譜系圖，聚類方法為瓦爾德法，區間選擇平方歐氏距離，共得到5 組多味藥物組合和2 組藥對。詳見圖4。其中，C1（藥對）：柴胡、甘草；C2（多味藥物組合）：黃芩、陳皮、半夏；C3（多味藥物組合）：茯苓、白術、人參；C4（藥對）：當歸、白芍；C5（多味藥物組合）：鱉甲、桂枝、知母；C6（多味藥物組合）：川芎、地黃、枳殼；C7（多味藥物組合）：常山、檳榔、青皮、厚樸。C1-C3 為治療COVID-19 的“三藥三方”清肺排毒湯主要藥物；C4 為常用養血藥對，養血調肝、健脾利濕；C5為知母鱉甲湯主要藥物，養陰清熱，化痰截瘧；C6 為血府逐瘀丸組方藥物，疏肝理氣、活血散結；C7為達原飲主要組方藥物，可用于瘟疫初期和瘧疾的治療。可見，7組聚類總體為扶正祛邪組合。扶正以活血化瘀、調理氣血為主，祛邪以清肺排毒、清熱利濕、化痰截瘧為主，體現了中醫基于濕、熱、毒、瘀病機治療疫病。

圖4 含柴胡防疫方劑高頻藥物（頻次≥60次）聚類分析譜系圖Fig.4 Cluster analysis of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

2.6 篩選柴胡-黃芩核心藥對

柴胡-甘草關聯度最高，甘草多作為使藥，發揮調和諸藥、緩解藥物毒性等協同作用。黃芩多作為臣藥，苦能燥濕、泄熱下氣，寒能清熱解毒；入膽則清少陽邪熱，入脾、大腸則燥腸胃濕熱，為清熱燥濕、瀉火解毒常用之品。柴胡-黃芩的關聯度僅次于柴胡-甘草，故選用柴胡-黃芩藥對進行網絡藥理學進行深度分析。柴胡-黃芩是臨床常用方劑小柴胡湯的主要成分，也是仲景柴胡系列方劑中最具代表性的基本配伍。“三藥三方”中清肺排毒方的組成也是小柴胡湯［13-14］，但治療COVID-19的作用機制尚不明確。

2.7 柴胡-黃芩藥對網絡藥理學分析

COVID-19 疾病靶點篩選：通過GeneCards，Disgenet，TTD 數據庫檢索COVID-19，并通過相關度大于中位數規則進行篩選，共得到疾病靶點473 個。疾病靶點與成分靶點相交，得共有靶標80個。詳見圖5。

圖5 柴胡-黃芩核心藥對成分與COVID-19共有靶標維恩圖Fig.5 Venn diagram of the intersection targets of core components of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix drug pair and the COVID-19

柴胡-黃芩藥對活性成分篩選：通過TCMSP 數據庫檢索柴胡-黃芩有效成分及基因靶點，通過Swiss Target Prediction數據庫進行預測，最終篩選出主要活性成分柴胡12個，黃芩31個，柴胡-黃芩的共同有效成分為豆甾醇（stigmasterol），去除重復靶點，共得到553 個靶點。主要活性成分信息見表4。

表4 柴胡-黃芩的共同活性成分Tab.4 Common active ingredients of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix

柴胡-黃芩藥對PPI 網絡圖構建：在完整的PPI 網絡中，度值（degree）越大的靶標，可連接的節點越多，提示該靶在生物信號通路中可能為上游基因，在信號通路的傳導過程中起到關鍵樞紐作用，詳見圖6。采用Cytoscape 3.9.0 軟件內CytoHubba 插件中度值算法篩選得到交互作用，提示評分在前10的基因可能是柴胡-黃芩在治療COVID-19 中發揮重要作用［15］。其中，較重要的靶標主要有表皮生長因子受體（EGFR）、信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細胞介素2（IL-2）等。詳見圖7。

圖6 柴胡-黃芩治療COVID-19的PPI網絡Fig.6 PPI network of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

圖7 柴胡-黃芩治療COVID-19的Hub基因Fig.7 Hub gene of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

2.8 GO 分析與KEGG 富集分析

通過Omishare平臺（https：//www.omicshare.com/）中GO 及KEGG 富集工具進行富集分析發現GO 分析3 736個相關條目。結果顯示，在生物調節、細胞代謝、免疫調節、生物附黏等生物功能，抗氧化活性、調節細胞活性、炎性反應等分子功能有廣泛的調節作用，詳見圖8。KEGG 富集分析共獲得230 條信號通路，通過中國知網（https：// www.cnki.net/）、PubMed（https：// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）文獻數據庫檢索剔出P值較小排名靠前的假陽性通路，篩選出與COVID-19 疾病強相關的20 條核心通路，并繪制KEGG 富集分析氣泡圖，詳見圖9。結果顯示，主要涉及的信號通路有EGFR信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、輔助性T 細胞17（TH17）信號通路、Janus 蛋白酪氨酸激酶（Jak）-STAT 信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-AKT（PI3K-AKT）信號通路、核因子-κB（NF-κB）信號通路等。

圖8 柴胡-黃芩治療COVID-19的GO分析條形圖Fig.8 GO analysis bar chart of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

圖9 柴胡-黃芩治療COVID-19的KEGG富集分析氣泡圖Fig.9 KEGG enrichment analysis bubble chart of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

2.9 成分-靶標-通路網絡構建

將所得到的化合物、作用靶標和KEGG通路信息導入Cytoscape 3.9.0 軟件，構建成分-靶標-通路網絡，包括95 個節點、445 條邊，詳見圖10。活性成分山柰酚（CH005）、黃芩素（HQ021）、小檗堿（HQ019）、漢黃芩素（HQ030）、刺槐素（HQ022）等度值靠前，可連接多個靶標，提示在網絡中的貢獻度很高，可能在治療COVID-19疾病中起到了關鍵作用；主要共有靶標有37 個，其中EGFR，STAT3，AKT1，IL-2 等度值靠前，可連接多個活性成分，提示該靶標可被多個成分共同調節。

圖10 柴胡-黃芩治療COVID-19的成分-靶標-通路網絡Fig.10 Component-target-pathway network of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

3 討論

防疫方劑中用藥頻次最高的前20味中藥包括柴胡、甘草、黃芩、桂枝、半夏、茯苓、白術等，與防疫“三藥三方”中的清肺排毒方主要成分基本一致，適用于COVID-19初期輕癥患者［16］。配伍知母、鱉甲等滋陰清熱藥，人參、川芎、當歸補氣血藥，甘草發揮調、補、緩作用，能有效緩解COVID-19患者的陰液耗竭、肺火上炎、氣血虧虛癥狀。從中藥性味分析，溫性藥與寒性藥分別占43.55%和38.73%，表明方劑多以溫陽助陽、寒以清熱、寒溫并用之法治療疫病，符合中醫藥“正氣存內，邪不可干”的思想；苦、甘、辛分別占41.78%，26.36%，23.73%，苦能清熱燥濕、瀉火解毒，甘能緩急和中、調和諸藥，辛可發散解表、化痰散結。從中藥功效分類來看，柴胡與補氣藥、理氣藥、清熱瀉火藥、補血藥、發散風寒藥等配伍，解表散邪外兼補氣，傷邪固正。

在關聯規則分析中，柴胡-甘草、柴胡-黃芩和柴胡-甘草-黃芩均具有較高的支持度。柴胡-黃芩是中醫臨床的常見藥對，具有消減郁熱、清熱燥濕、調和表里、和解少陽的功效；柴胡-甘草可疏肝理氣，健脾和中。三者為柴胡黃芩甘草湯主要組成部分，是治療少陽本證的經典方劑。與核心藥對柴胡-黃芩、甘草組合的大棗、生姜、半夏也是小柴胡湯的主要成分。小柴胡湯是和解劑，具有和解少陽的功效，臨床主要用于治療傷寒少陽病證［17］。針對不同病證，柴胡有不同配伍，常配伍甘草、黃芩、人參、半夏，反映柴胡治療不同疾病時的用藥規律和配伍特點，符合中醫在診療中“異病同治”的基本思想及“扶正祛邪”的指導原則。

聚類分析共得到7類，其中C1-C3為治療COVID-19的“三藥三方”小柴胡湯加減，化濕理氣、調暢氣機，可改善肺氣壅滯、胸悶急促、氣機不暢、痰飲內聚等癥［18］。少陽乃是太陽、陽明升降的樞紐，可調節三陽經氣升降［18-19］。COVID-19 之寒濕疫毒郁于膜原，致少陽樞機不利。小柴胡湯具有兩解少陽、太陽之邪的作用，配以白術、茯苓、陳皮，理氣健脾、燥濕化痰。C4 為常用養血藥對，養血調肝，健脾利濕，可明顯改善氣血虧虛、痰飲內停之癥。C5-C7 為知母鱉甲湯、血府逐瘀丸、達原飲主要組方藥物，可養陰清熱、化痰截瘧、疏肝理氣，活血散結，對COVID-19、瘟疫初期和瘧疾具有良好效果［20］。

本研究中基于網絡藥理學研究《中醫方劑大辭典》含柴胡防疫方中核心藥對柴胡-黃芩治療COVID-19的作用機制，得到柴胡-黃芩治療COVID-19 的潛在活性成分為山柰酚、黃芩素、小檗堿、漢黃芩素、刺槐素、蘇薺苧黃酮、黃芩苷、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮、紅花素、谷甾醇等。其中，山柰酚、黃芩素、小檗堿等均為黃酮類成分，具于抗炎、抗病毒、抗感染、免疫調節作用［21-22］。SUN 等［23］的研究發現，山柰酚減少了脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞對炎性因子的分泌，體外抑制MAPK/NF-κB 信號傳導，調節巨噬細胞極化為M2型，抑制內毒素誘導的細胞因子風暴，提高小鼠的存活率；嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）蛋白酶（3CLpro）在冠狀病毒中表現出高度保存性，是治療COVID-19的關鍵靶標。研究表明，黃芩素對3CLpro具有較強的活性抑制作用［24］；漢黃芩素可通過增加免疫細胞的浸潤、調節免疫細胞的表型來增強免疫功能［25］，保護肺功能；小檗堿可抑制血清γ 干擾素（IFN-γ）及肺部IFN-γ，IL-10，CCL25 過度產生，對流感病毒感染導致的小鼠肺損傷起保護作用［26］。張英睿等［27］通過網絡藥理學與分子對接技術發現，刺槐素等可通過作用于胱天蛋白酶3（CASP3）、胱天蛋白酶8（CASP8）、人細胞凋亡因子配體（FASLG）等靶點調節細胞凋亡通路及TNF 通路，從而實現對COVID-19 的潛在治療作用。

結合交集靶標繪制的PPI網絡及評分，得到度值排前10 的Hub 基因，分別為EGFR，STAT1，STAT3，JAK1，JAK2，MAPK1，IL-2，AKT1 及熱休克蛋白90a 型1（HSP90AA1）、非受體型蛋白酷氨酸磷酸酶11（PTPN11）。其中，STAT1和STAT3參與冠狀病毒感染期間炎性反應的誘導，通過影響Th17 和B 細胞介導的功能來抑制抗病毒干擾素反應，并誘導不平衡的抗病毒適應性免疫應答［28］；JAK1 和JAK2 是參與免疫的細胞因子，抑制二者可減少COVID-19 相關的細胞因子風暴；MAPK 和AKT1 主要參與細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程［29］；HSP90AA1 和IL-2 可發揮抗炎作用，指導COVID-19患者的病情進展、治療及預后的評估等過程［30］。基于網絡藥理學和中醫理論分析柴胡-黃芩通過上述靶點調節炎性反應過程和人體免疫功能，可達到扶正祛邪的目的。

GO 分析表明，生物過程占比最大，主要為細胞代謝過程的調節、刺激反應的正向調節、多細胞生物過程、生物黏附、細胞死亡等；分子功能主要為轉錄因子活性、蛋白質結合、抗氧化活性。KEGG 富集分析主要包括EGFR 信號通路、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等。COVID-19 通過促進肺上皮細胞EGFR 表達的增加，觸發炎性反應［31］。通過抑制EGFR，阻斷與IL-6 的聯系，降低炎性反應即靜脈血栓形成，降低COVID-19重癥病死率［32］。TNF-α是急性和慢性全身炎性反應的主要多效性介質，可同時調節細胞的凋亡和增殖，促進其他趨化因子和細胞因子的產生［33-34］。SARS-CoV-2感染期間，侵襲性炎性反應和細胞因子風暴會導致嚴重的全身組織損傷和死亡，而TNF 信號通路在細胞因子釋放綜合征（CRS）中起至關重要的作用［35］。NF-κB信號通路在COVID-19的自然進展和轉化為嚴重表型中發揮了重要作用，抑制NF-κB 信號通路可能是目前有效抗冠狀病毒藥物的作用機制［36］，激活NF-κB、抑制TNF-α 可能會導致細胞因子風暴的減少，緩解COVID-19的嚴重程度。

本研究中通過對《中醫方劑大辭典》中含柴胡防疫方劑進行關聯規則、聚類分析，深度挖掘柴胡治療疫病的用藥組方規律，明確了相關藥物的用藥頻率及配伍規律。運用網絡藥理學的方法深度挖掘核心藥對柴胡-黃芩治療COVID-19 的潛在活性靶點及作用機制。柴胡-黃芩同一活性成分可調控不同靶點，而同一靶點可作用于不同的生物學過程及信號通路，體現多通路、多靶點聯合作用的特點，為發掘柴胡的潛在作用機制和臨床治療思路提供了新方向。但本研究未對柴胡相關數據挖掘的藥效成分、作用靶點及作用機制進行驗證，有待后續深入研究。