小兒麻甘顆粒中農(nóng)藥殘留篩查與風(fēng)險評估*

劉 凱，朱文迪，萬 幸，徐 玲，涂奇軍△

（1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院·湖北省藥品檢測與工程技術(shù)研究中心·國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，湖北 武漢 430075；2.湖北省藥品監(jiān)督管理局審評中心，湖北 武漢 430075）

小兒麻甘顆粒由麻黃、黃芩、紫蘇子、甘草、桑白皮、苦杏仁、地骨皮、石膏8味中藥材組方，具有平喘止咳、利咽祛痰功效。中藥材的種植期較長，防治病蟲害及土壤中的農(nóng)藥會在植物體內(nèi)蓄積，不可避免地產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題［1］。原料藥材中的殘留農(nóng)藥可能會轉(zhuǎn)移到制劑中，增加制劑的安全風(fēng)險。本研究中在2020年版《中國藥典（四部）》中收錄的33種禁用農(nóng)藥的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)檢索及產(chǎn)地調(diào)研，篩選出7種中藥材中易檢出的17種限用農(nóng)藥品種［2-9］。采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法進(jìn)行測定，分析制劑及其原料藥材的農(nóng)藥殘留，并用每日允許攝入量（ADI）評估殘留農(nóng)藥的安全風(fēng)險［10］。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890-QQQ 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；LC 30A-4500 Q-Trap 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB Sciex 公司）；AH-30 型全自動均質(zhì)器（?？萍瘓F(tuán)股份有限公司）；Buchi Syncore型平行濃縮蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；XS204型電子分析天平（瑞士Mettller Toledo 公司，精度為0.1 mg）；ST16R 型離心機（美國Thermo 公司）；Mili-Q 型純水機（德國Merck公司）。

1.2 試藥

樣品來自國家食品藥品監(jiān)督管理局2022年的評價性抽樣，包括8 個生產(chǎn)廠家的19 批小兒麻甘顆粒樣品（信息及檢出農(nóng)藥見表1）；收集到8個生產(chǎn)廠家提供的麻黃、黃芩、紫蘇子、甘草、桑白皮、苦杏仁、地骨皮7味中藥材，共56 個批次，其中藥材對應(yīng)制劑批次均為2022 年（信息及檢出農(nóng)藥見表2）；禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格為每支1.2 mL，批號為610020-202001）；磷酸三苯酯（北京迪科馬科技有限公司，貨號為3241660，批號為47753，含量為99.7%）；乙腈中16種限用農(nóng)藥混合對照品溶液（貨號為A6058），多菌靈對照品溶液（規(guī)格為每支1 mL，質(zhì)量濃度為100μg/mL），均購于天津阿爾塔科技有限公司；乙腈為色譜純，氯化鈉為分析純；HLB 小柱（200 mg/6 mL ＜60μm ＞，納普分析技術(shù)有限公司，貨號為HLB210705）。

表1 小兒麻甘顆粒樣品信息與檢出農(nóng)藥Tab.1 Sample information of Xiao′er Magan Granules and detected pesticides

表2 原料藥材信息與檢出農(nóng)藥Tab.2 Information of raw herbal materials and detected pesticides

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

2.1.1 GC-MS/MS 法

色譜柱：DB-17MS 毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣：高純度氦氣；進(jìn)樣口模式：恒壓模式；柱前壓：146 kPa；程序升溫：初始溫度為60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升至120 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至160 ℃，2 ℃/min的速率升至230 ℃，15 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持6 min；電離方式：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：250 ℃；碰撞氣：氮氣；質(zhì)譜傳輸線溫度：250 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。對照品溶液的總離子流（TIC）圖見圖1。各化合物分析參數(shù)見表3。

圖1 小兒麻甘顆粒制劑基質(zhì)對照品溶液GC-MS/MS總離子流圖Fig.1 GC-MS/ MS total ion current chromatograms of matrix reference solution in Xiao′er Magan Granules preparation

表3 各農(nóng)藥化合物GC-MS/MS分析參數(shù)與檢測限、定量限、線性范圍Tab.3 GC-MS/ MS parameters and limits of determination，limits of quantification，linear ranges of various pesticide compounds

2.1.2 HPLC-MS/MS 法

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅱ柱（75 mm×2 mm，2.2 μm）；流動相：A 為0.1%甲酸溶液（5 mmol/ L 甲酸銨），B 為含5 mmol/L 的甲酸銨（0.1%甲酸溶液）-乙腈（5∶95，V/V），梯度洗脫（0～1 min 時30%B，1～17 min 時30%B →100%B，17～19 min 時30%B）；流速：0.3 mL/ min；柱溫：40 ℃；電離方式：ESI（+）；掃描模式：MRM。對照品溶液的TIC 圖見圖2。各化合物分析參數(shù)見表4。

圖2 小兒麻甘顆粒制劑基質(zhì)對照品溶液HPLC-MS/MS總離子流圖Fig.2 HPLC-MS/ MS total ion current chromatograms of matrix reference solution in Xiao′er Magan Granules preparation

表4 各農(nóng)藥化合物HPLC-MS/MS分析參數(shù)與檢測限、定量限、線性范圍Tab.4 HPLC-MS/ MS parameters and limits of determination，limits of quantification，linear ranges of various pesticide compounds

2.2 溶液制備

農(nóng)藥混合對照品溶液：精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，加乙腈定容，作為禁用農(nóng)藥混合對照品溶液。精密量取限用農(nóng)藥混合對照品溶液、多菌靈對照品溶液各1 mL，置20 mL容量瓶中，加乙腈定容，作為限用農(nóng)藥混合對照品溶液。

GC-MS/MS 法分析用內(nèi)標(biāo)溶液：取磷酸三苯酯對照品10 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加乙腈定容，精密量取500μL，置100 mL容量瓶中，加乙腈定容，即得。

黃芩、甘草空白基質(zhì)溶液：取空白基質(zhì)樣品（過3號篩）10 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖勻，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至5 mL，搖勻，即得。

紫蘇子、小兒麻甘顆粒制劑樣品空白基質(zhì)溶液：取空白基質(zhì)樣品（過3號篩）10 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至5 mL，搖勻，取5 mL，置凈化管中［含300 mg 硫酸鎂、100 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、100 mg 十八烷基鍵合硅膠柱（C18）］振搖10 min，取上清液，即得。

麻黃、苦杏仁、桑白皮、地骨皮空白基質(zhì)溶液：取空白基質(zhì)樣品（過3號篩）10 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至5 mL，搖勻，取5 mL，過HLB 小柱2次，即得。

基質(zhì)混合對照品溶液：分別精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液和限用農(nóng)藥混合對照品溶液各10，20，50，100，150，200 μL，置進(jìn)樣小瓶中，分別精密加入空白基質(zhì)溶液各0.5 mL，加乙腈稀釋至1 mL，即得。

黃芩、甘草供試品溶液：取樣品（過3 號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加入乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，即得。

紫蘇子、小兒麻甘顆粒制劑樣品供試品溶液：取樣品（過3 號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/ min），取上清液，沉淀，再加入乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，取5 mL，置凈化管中（含300 mg 硫酸鎂、100 mg PSA、100 mg C18）振搖10 min，取上清液，即得。

麻黃、苦杏仁、桑白皮、地骨皮供試品溶液：取樣品（過3號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加入乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，取5 mL，過HLB小柱2次，即得。

2.3 測定方法

GC-MS/MS 法：分別精密量取上述基質(zhì)混合對照品溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL，渦旋，混勻，濾過，取續(xù)濾液，精密吸取1μL，注入GCMS/MS儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算。

HPLC-MS/ MS 法：分別精密量取上述基質(zhì)混合對照品溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入水0.3 mL，渦旋，混勻，濾過，取續(xù)濾液，精密吸取1μL，注入HPLCMS/MS儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2項下各濃度基質(zhì)混合對照溶液適量，按2.1 項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果各農(nóng)藥化合物的相關(guān)系數(shù)均在0.990～0.999之間，表明各待測農(nóng)藥化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。詳見表3和表4。

檢測限與定量限確定：用標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點計算小兒麻甘顆粒基質(zhì)混合對照品溶液中每種農(nóng)藥的2個離子對的S/N，以響應(yīng)信號較小的離子對的S/N為準(zhǔn)，以3倍信噪比（S/N）計算檢測限，以10倍S/N計算定量限。結(jié)果50種農(nóng)藥的檢測限在0.02～65.22μg/kg之間，定量限在0.07～217.39μg/kg之間。詳見表3和表4。

加樣回收試驗：選取麻黃、黃芩、紫蘇子、甘草、桑白皮、苦杏仁、地骨皮藥材和小兒麻甘顆粒樣品，分別加入禁用農(nóng)藥混合對照品溶液和限用農(nóng)藥混合對照品溶液各100 μL，按2.1 項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行加樣回收試驗。結(jié)果大部分農(nóng)藥化合物的回收率在50%～120%之間，回收率滿足篩查要求。詳見表5 和表6。

表5 GC-MS/MS法加樣回收試驗結(jié)果Tab.5 Results of the recovery test by the GC-MS/ MS method

表6 HPLC-MS/MS法加樣回收試驗結(jié)果Tab.6 Results of the recovery test by the HPLC-MS/ MS method

2.5 農(nóng)藥殘留量測定

對8個生產(chǎn)廠家的小兒麻甘顆粒樣品進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出禁用農(nóng)藥，其中3個生產(chǎn)廠家檢出限用農(nóng)藥吡蟲啉殘留（表1），檢出吡蟲啉MRM 圖見圖3。對8 個生產(chǎn)廠家的原料藥材麻黃、黃芩、紫蘇子、甘草、桑白皮、苦杏仁、地骨皮進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出禁用農(nóng)藥，但限用農(nóng)藥品種檢出較多，包括吡蟲啉、氯氰菊酯、毒死蜱、啶蟲脒等；各生產(chǎn)廠家的黃芩藥材中均檢出氯氰菊酯；地骨皮藥材中檢出農(nóng)藥品種較多，包括吡蟲啉、啶蟲脒等。詳見表2。

圖3 小兒麻甘顆粒制劑中檢出農(nóng)藥對照品溶液與供試品溶液多反應(yīng)監(jiān)測圖1.吡蟲啉A-B.對照品溶液（定量離子對、定性離子對）C-D.供試品溶液（定量離子對、定性離子對）Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of reference solution and test solution of the pesticide detected from Xiao′er Magan Granules preparation1.ImidaclopridA-B.Reference solution（quantitative ion pair，qualitative ion pair）C-D.Test solution（quantitative ion pair，qualitative ion pair）

2.6 農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估

以2020 年版《中國藥典（四部）》通則0212 規(guī)定的定量限為33 種禁用農(nóng)藥的安全限量；根據(jù)ADI 設(shè)定17 種限用農(nóng)藥的安全限量及食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2019 食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的ADI，按成年人平均體質(zhì)量60 kg 計算。臨床中藥飲片日服用量參照《中國藥典（一部）》，考慮到臨床用量通常大于相應(yīng)用量，故根據(jù)《中藥臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》中藥飲片最大單劑處方劑量300 g 作為最大處方量計算安全限量。由于小兒麻甘顆?？捎糜? 歲以上兒童，以1 歲兒童體質(zhì)量10 kg 作為標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量，根據(jù)GB2763-2019 中規(guī)定計算ADI，故小兒麻甘顆粒按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的ADI 10 g，計算安全限量。結(jié)果小兒麻甘顆粒制劑中未檢出禁用農(nóng)藥，限用農(nóng)藥檢出吡蟲啉，但均未超過擬訂的安全限量60 mg/ kg，檢出限用農(nóng)藥品種均未超過安全限量。詳見表7。

表7 小兒麻甘顆粒制劑中檢出限用農(nóng)藥安全限量Tab.7 Safety limit of prohibited pesticides detected from Xiao′er Magan Granules preparation

3 討論

3.1 凈化方法選擇

本研究中對小兒麻甘顆粒及其原料藥材的農(nóng)藥殘留品種進(jìn)行了篩查，在2020 年版《中國藥典（四部）》中33種禁用農(nóng)藥的基礎(chǔ)上，增加了17種限用農(nóng)藥品種。其中，三唑酮、腐霉利、毒死蜱、氰戊菊酯、氯氰菊酯采用GC-MS/MS 法測定的靈敏度較高；噻菌靈、多菌靈、甲基硫菌靈、阿維菌素、吡唑醚菌酯、吡蟲啉、啶蟲脒、氧樂果、噠螨靈、乙螨唑、縮節(jié)胺、多效唑采用HPLC-MS/MS法測定的靈敏度較高。同時，采用質(zhì)譜法測定農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)會對測定產(chǎn)生干擾，影響定量的準(zhǔn)確性，HPLC-MS/MS 法表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應(yīng)，GC-MS/MS法表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，故應(yīng)選擇適宜的基質(zhì)前處理方法［11-12］。

曾對小兒麻甘顆粒制劑和原料藥材前處理方法［直接提取法、HLB 小柱法、分散固相萃?。╠SPE）法］進(jìn)行優(yōu)化，并考察了回收率。1）直接提取法。取樣品（過3號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心，取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻。2）HLB 小柱法。取樣品（過3 號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心，取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻；取5 mL，過HLB 小柱，即得。3）dSPE法。取樣品（過3號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖散，再加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心，取上清液，合并上清液，減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻；取5 mL，置凈化管中（含150 mg硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18）振搖10 min，取上清液，即得。綜合考慮回收率，最終選擇2.2項下凈化方法分別制備空白基質(zhì)溶液和供試品溶液。

3.2 農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估

對于檢出的限用農(nóng)藥，基于食品中最大殘留限量規(guī)定的ADI 評價小兒麻甘顆粒的農(nóng)藥殘留風(fēng)險，結(jié)果檢出的限用農(nóng)藥品種吡蟲啉均未超過擬訂安全限量，表明農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險較低。但本次篩查的8 家小兒麻甘顆粒生產(chǎn)企業(yè)中，4 家生產(chǎn)企業(yè)均檢出吡蟲啉殘留的狀況，且其中廠家6 在2020 年至2022 年4 個批次制劑樣品中均檢出了蚍蟲啉殘留，表明該品種蚍蟲啉農(nóng)藥殘留較普遍。農(nóng)藥殘留通常來源于其藥材，廠家6對應(yīng)的原料藥材地骨皮中檢出吡蟲啉，表明吡蟲啉可能會由地骨皮藥材轉(zhuǎn)移到小兒麻甘顆粒制劑中。地骨皮為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭降母稍锔?，采收期較長，通常需要3 年以上，枸杞在生長過程中較易受蚜蟲等病蟲害的侵襲，多采用殺蟲劑噴灑。吡蟲啉為常用硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲劑，具有較強的內(nèi)吸性，會進(jìn)入植物體內(nèi)，并富集在根部［13-15］。為保證小兒麻甘顆粒制劑的質(zhì)量，需規(guī)范其原料藥材地骨皮的種植，提倡綠色種植，減少吡蟲啉等農(nóng)藥的使用。原料藥材的農(nóng)藥篩查中發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯和毒死蜱2種殺蟲劑的檢出率較高，但均未轉(zhuǎn)移到小兒麻甘顆粒制劑中，氯氰菊酯和毒死蜱均無內(nèi)吸性，不會蓄積在植物體內(nèi)，且中藥材的清洗、制劑的提取等過程可減少農(nóng)藥殘留，故使用非內(nèi)吸性農(nóng)藥代替內(nèi)吸性農(nóng)藥可能會降低轉(zhuǎn)移到制劑中的風(fēng)險。