一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定半枝蓮配方顆粒中5 種黃酮類(lèi)成分含量*

鐘華青，宋 輝，張 盛，胡云飛

（1.皖南醫(yī)學(xué)院附屬銅陵醫(yī)院·安徽省銅陵市立醫(yī)院，安徽 銅陵 244000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；3.亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301600）

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don 的干燥全草［1］，味辛、苦，性寒，主要?dú)w肺經(jīng)，具有清熱解毒、化瘀、利尿功效［2-3］，含有黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、多糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，半枝蓮具有多種藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗阿爾茨海默病等，主要活性物質(zhì)為黃酮類(lèi)成分［4-8］。半枝蓮配方顆粒為在飲片基礎(chǔ)上制備的中藥配方顆粒，質(zhì)量控制包括野黃芩苷的含量［9］，限制了半枝蓮整體質(zhì)量評(píng)價(jià)的規(guī)范化，且半枝蓮藥材品質(zhì)易受產(chǎn)地、采收期、種植方式等多種因素影響［10］。單一成分難以全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的優(yōu)劣，通過(guò)多指標(biāo)同步質(zhì)量控制反映中藥質(zhì)量已成為當(dāng)前中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域的共識(shí)。一測(cè)多評(píng)（QAMS）法是通過(guò)測(cè)定一種成分，達(dá)到多成分同步定量的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式［11］，可解決外標(biāo)法對(duì)照品難以得到或不穩(wěn)定、使用量大、檢驗(yàn)成本高的不足，實(shí)現(xiàn)了多種成分同時(shí)定量測(cè)定，適合中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)檢測(cè)特點(diǎn)。本研究中以野黃芩苷為內(nèi)參物，建立了同時(shí)測(cè)定半枝蓮配方顆粒中黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素含量的QAMS法，為進(jìn)一步提高半枝蓮配方顆粒整體質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 型液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；BT25S 型電子天平（精度為0.01 mg），BSA224S-CW 型電子天平（精度為0.1 mg），均購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Elma S120H 型超聲儀（德國(guó)Elma 公司，功率為200 W，頻率為37 kHz）；UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

野黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110842-202010，含量為91.5%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202223，含量為97.2%），芹菜素對(duì)照品（批號(hào)為111901-202205，含量為98.4%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；野黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為20021501，純度大于98.0%），柚皮素對(duì)照品（批號(hào)為20022406，純度大于98.0%），均購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司；甲醇和甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水；半枝蓮配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，規(guī)格為每包3.75 g，相當(dāng)于常規(guī)飲片15 g，批號(hào)分別為20092183，21082273，19072343，21052233，19031893，21007283，21010543，21010301，20070993，編號(hào)為S1-S9）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲酸水溶液（pH 2.5）-甲醇（65∶35，V/V）；流速：0.8 mL/ min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

分別取野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、柚皮素、芹菜素對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇溶解，制備成上述5 種成分質(zhì)量濃度分別為3.602，0.405，0.810，0.201，0.093 mg/ mL 的混合對(duì)照品貯備液；取各對(duì)照品貯備液125 μL，加80% 甲醇稀釋至4 mL，作為混合對(duì)照品溶液。取野黃芩苷對(duì)照品5.00 mg，精密稱(chēng)定，置5 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容，搖勻，作為野黃芩苷對(duì)照品溶液。取樣品1.5 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，加80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按半枝蓮配方顆粒處方比例稱(chēng)取輔料，按生產(chǎn)工藝制備無(wú)半枝蓮的陰性配方顆粒，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。黃芩苷、野黃芩素、柚皮素、芹菜素和野黃芩苷色譜峰均達(dá)到基線分離，各相鄰化合物的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000，分離度良好，且陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.野黃芩苷 2.黃芩苷 3.野黃芩素 4.柚皮素 5.芹菜素A.供試品溶液 B.混合對(duì)照品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液Fig.1 HPLC chromatograms1.Scutellarin 2.Baicalin 3.Scutellarein 4.Naringin 5.ApigeninA.Test solution B.Mixed reference solution C.Negative reference solution

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，等倍稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以各化合物的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素峰面積的RSD分別為1.14%，1.58%，0.91%，1.25%，2.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20092183）1.5 g，精密稱(chēng)定，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素峰面積的RSD分別為0.89%，1.03%，0.75%，0.81%，1.57%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，18，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素峰面積的RSD分別為1.25%，1.29%，1.50%，2.08%，1.46%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20092183）0.75 g，精密稱(chēng)定，共6 份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素的平均加樣回收率分別為95.33%，97.44%，96.78%，100.59%，96.01%，RSD分別為1.35%，1.79%，1.67%，2.86%，1.79%（n=6）。

2.4 色譜峰定位確定

色譜峰定位：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5，10，15 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素的相對(duì)保留時(shí)間（RRT），取平均值。結(jié)果上述4 種黃酮類(lèi)化合物相對(duì)于野黃芩苷的RRT 分別為1.369，1.423，1.526，1.773，RSD分別為0.90%，0.68%，0.72%，0.48%（n=9），均小于2.00%，表明各化合物的RRT相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素（以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)）的相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of baicalin，scutellarein，naringin，and apigenin（with scutellarin as the internal standard）

色譜峰定位的重復(fù)性：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別考察不同型號(hào)液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters 2695 型、Thermo Ultimate 3000 型）及色譜柱［Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Waters XBridge C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil GOLD柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）］對(duì)黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素色譜峰定位的影響。結(jié)果上述4種黃酮類(lèi)化合物相對(duì)于野黃芩苷的RRT 分別為1.371，1.424，1.528，1.775，RSD分別為1.02%，0.80%，0.79%，0.93%（n=9），均小于2.00%，表明各化合物的色譜峰定位具有良好的重復(fù)性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同高效液相色譜儀和色譜柱下黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素（以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)）的相對(duì)保留時(shí)間Tab.3 Relative retention time of baicalin，scutellarein，naringin，and apigenin（with scutellarin as internal standard）by different HPLC instruments and chromatographic columns

2.5 相對(duì)校正因子（RCF）確定

RCF 計(jì)算方法：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5，10，15 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素峰面積的RCF，取平均值。校正因子計(jì)算公式為RCF=（Cs×Ak）／（Ck×As）。式中，Cs為參照物野黃芩苷的質(zhì)量濃度，As為參照物的色譜峰峰面積，Ck和Ak分別為黃芩苷、野黃芩素、柚皮素、芹菜素的質(zhì)量濃度和峰面積。結(jié)果黃芩苷、野黃芩素、柚皮素、芹菜素相對(duì)于野黃芩苷的RCF 分別為0.671，0.787，0.826，0.516，RSD分別為2.36%，1.84%，1.33%，2.05%（n=9），均小于2.00%，表明RCF相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素（以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)）的相對(duì)校正因子Tab.4 RCF of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin to（with scutellarin as internal standard）

RCF 的重復(fù)性考察：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別考察不同型號(hào)液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters 2695 型、Thermo Ultimate 3000 型）及色譜柱［Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Waters XBridge C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil GOLD 柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）］對(duì)黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素RCF 的影響。結(jié)果上述4種黃酮化合物相對(duì)于野黃芩苷的RCF 分別為0.672，0.778，0.823，0.518，RSD分別為2.47%，2.58%，1.80%，2.27%（n=9），均小于3.00%，表明各化合物的RCF 在不同高效液相色譜儀與不同色譜柱下重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同高效液相儀和不同色譜柱下黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素（以野黃芩苷為內(nèi)標(biāo)）的相對(duì)校正因子Tab.5 RCF of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin（with scutellarin as internal standard）by different HPLC instruments and chromatographic columns

2.6 樣品測(cè)定與驗(yàn)證

取9 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定樣品中黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素的含量。結(jié)果2 種方法的測(cè)量結(jié)果的相對(duì)偏差均不超過(guò)2.20%，上述4 種黃酮類(lèi)化合物的平均相對(duì)偏差分別為1.48%，1.08%，1.17%，1.19%（n=9），均小于2.00%，表明QAMS 法測(cè)定半枝蓮配方顆粒中上述4 種黃酮類(lèi)化合物的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法可行。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 半枝蓮配方顆粒中黃芩苷、野黃芩素、柚皮素、芹菜素的一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較Tab.6 Results of the content determination of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin in Banzhilian Formula Granules by the QAMS method and the external standard method

3 討論

目前，國(guó)家頒布近200 種中藥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但中藥配方顆粒的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題仍面臨巨大挑戰(zhàn)［12-14］。楊敏娟等［15］建立了半枝蓮藥材的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。王治陽(yáng)等［16］采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同產(chǎn)地半枝蓮藥材中8種黃酮類(lèi)成分的含量。YANG 等［17］通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法測(cè)定半枝蓮藥材中芹菜素、黃芩素、黃芩苷、木犀草素、柚皮素和漢黃芩素6 種黃酮類(lèi)成分的含量。王秀芹等［18］進(jìn)行了半枝蓮配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，建立了HPLC 指紋圖譜，但僅測(cè)定了野黃芩苷的含量。

目前，已分離鑒定出半枝蓮的70 余種黃酮類(lèi)化合物，包括黃酮、黃烷酮、黃酮苷、查爾酮4類(lèi)，其中以黃酮類(lèi)及其苷類(lèi)成分居多［19］。野黃芩苷是半枝蓮中含量最高的黃酮類(lèi)化合物，其次為黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素［20］。因此，本研究中采用QAMS 法測(cè)定半枝蓮配方顆粒中5種黃酮類(lèi)化合物的含量，以期更全面地控制半枝蓮中活性成分的含量。

流動(dòng)相曾考察甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸水溶液，結(jié)果甲醇-甲酸水溶液（pH 2.5）作為流動(dòng)相時(shí)基線比較平穩(wěn)，峰形及分離度較好，故以此溶劑作為流動(dòng)相。采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）于250～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)5 種指標(biāo)性成分進(jìn)行掃描，結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素、柚皮素、芹菜素的最大吸收波長(zhǎng)分別為335，280，276，370，340 nm，故考察了5 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)半枝蓮配方顆粒供試品溶液的紫外吸收情況。結(jié)果顯示，目標(biāo)物于280 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)最好，故選擇280 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，考察不同流速和不同柱溫對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果在流速0.8 mL/min、柱溫30 ℃條件下出峰個(gè)數(shù)較多，色譜峰的分離度和峰形均較好，峰面積較大。故選擇0.8 mL/min和30 ℃作為流速和柱溫。

綜上所述，本研究中建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確、耐用性較好，較外標(biāo)法成本低、操作簡(jiǎn)便，適用于半枝蓮配方顆粒中黃芩苷、野黃芩素、柚皮素和芹菜素的含量測(cè)定。