芪龍活絡顆粒質量標準研究*

魏 玲，丁小凡，張賀廷，陳 浩，劉 暢，席永寬

（1.安徽省阜陽市中醫醫院，安徽 阜陽 236025；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031）

芪龍活絡顆粒（注冊批號Z20210053000）為安徽省阜陽市中醫醫院開發的院內制劑，由丹參、紅花、黃芪、膽南星、川牛膝、雞血藤、石菖蒲、地龍組方，具有益氣、活血、通絡功效。臨床用于治療中風病、眩暈等氣虛血瘀證。方中，黃芪、丹參為君藥，具有補氣固表、利尿脫毒等功效［1］；丹參活血祛瘀，紅花活血通經，共為臣藥；川牛膝逐瘀通經、引藥下行，雞血藤活血補血，膽南星息風定驚，共為佐使藥［2-3］。諸藥合用，共奏補氣、活血、通絡之效。臨床研究發現，黃芪治療腦卒中的療效較好［1］。藥理學研究發現，丹參有保護心血管、降血壓的作用，紅花中的羥基紅花素A 被廣泛用于治療腦血管疾病［4］，黃芪-丹參是中藥治療缺血性腦卒中的主要藥對，臨床療效較好［5］。為更好地控制制劑質量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對黃芪、川牛膝、雞血藤進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定丹參中丹酚酸B的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有二極管陣列檢測器（DAD）；梅特勒ME55 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；JK-DY300 型超聲波清洗器（合肥金克尼機械制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

丹酚酸B 對照品（批號為111562-201916，純度為96.6%），雞血藤對照藥材（批號為121173-201805），川牛膝對照藥材（批號為121065-201707），黃芪對照藥材（批號為21462-201705），均購于中國食品藥品檢定研究院；芪龍活絡顆粒（醫院制劑，批號分別為220501，220502，220701，220702，220801）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司，批號為20220406）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

川牛膝［6-7］：取樣品3 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯振蕩提取2 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取川牛膝對照藥材1 g，加甲醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按處方工藝取不含川牛膝的處方藥材，制備陰性對照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述3 種溶液各4μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮-甲酸（8∶4∶1∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.陰性對照品溶液 2.對照藥材溶液 3-5.供試品溶液A.川牛膝 B.黃芪 C.雞血藤Fig.1 TLC chromatograms1.Negative reference solution 2.Reference medicinal materials 3-5.Test solutionA.Cyathulae Radix B.Astragali Radix C.Spatholobi Caulis

黃芪［8-10］：取樣品10 g，研細，加甲醇50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振蕩提取2 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨液，用正丁醇液回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對照藥材1 g，加甲醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按處方工藝取不含黃芪的處方藥材，制備陰性對照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏蒸后置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

雞血藤［11-12］：取樣品5 g，研細，加水30 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，離心（轉速為4 000 r/min）5 min，取上清液，用乙酸乙酯振蕩提取2 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，用乙酸乙酯液回收溶劑至干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振蕩提取2 次，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按處方工藝取不含雞血藤的處方藥材，制備陰性對照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲酸乙酯-冰醋酸-甲酸-異丙醇（5∶5∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 HPLC 法測定丹酚酸B 含量

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。理論板數按丹酚酸B峰計不低于4 000［13-14］。

2.2.2 溶液制備

取丹酚酸B 對照品12.92 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，制成質量濃度為62.4μg/mL的對照品溶液。取樣品（批號為220801）2 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按處方工藝取不含丹參的處方藥材，制備不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗［15］：分別吸取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在丹酚酸B對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.丹酚酸BA.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液Fig.2 HPLC chromatograms1.Salvianolic acid BA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solution

線性關系考察：設置自動進樣程序，分別吸取2.2.2項下丹酚酸B對照品溶液（質量濃度為62.4μg/mL）1，2，5，10，20 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=815.52X+0.27（r=1.000，n=5）。結果表明，丹酚酸B 進樣量在0.062 4～1.248 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為220801）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.85%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為220801）樣品適量，精密稱定，平行6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果丹酚酸B 的平均含量為1.26 mg/ g，RSD為1.92%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為220801）2.0 g，精密稱定，平行6 份，加丹酚酸B 對照品溶液（質量濃度為62.4 μg/ mL）25 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取5批（批號分別為220501，220502，220701，220702，220801）樣品各適量，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果樣品中丹酚酸B 的含量分別為1.09，1.24，1.27，1.19，1.32 mg/ g。綜合考慮，擬訂芪龍活絡顆粒中丹酚酸B的含量應不低于1.0 mg/g。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

考察藥材選擇：在前期小試試驗中均能鑒別出紅花、石菖蒲藥材，且陰性對照無干擾，但中試試驗后的檢驗中均未檢出。查閱文獻發現，紅花中主要活性物質羥基紅花黃色素A 為水溶性物質［16］，長時間在高溫環境中會隨時間的延長而有所降解［17-18］。石菖蒲主要活性物質有苯丙素類、酚類及揮發油類［19］。我院制劑室的提取設備相對陳舊，導致提取時間變長，提取溫度過高，無法進行TLC 鑒別。膽南星進行TLC 鑒別時陰性對照干擾較大。故紅花、石菖蒲、膽南星均暫不列入本質量標準。

TLC 鑒別條件選擇：前期研究中，對芪龍活絡顆粒中川牛膝、黃芪、丹參、紅花、膽南星、地龍、膽南星、石菖蒲進行TLC 鑒別，發現川牛膝、黃芪、雞血藤TLC 斑點顯色清晰，且陰性對照無干擾，能較好地鑒別制劑中的川牛膝、黃芪、雞血藤藥材。《中國藥典》中的TLC鑒別方法能較好地鑒別川牛膝和黃芪，但需要過柱［20］，方法煩瑣，故選擇本研究中2.1 項下方法進行鑒別。通過考察不同類型的硅膠板發現，高效硅膠G 板與普通硅膠G 板均能較好分離川牛膝、黃芪、雞血藤，且陰性對照無干擾。2020 年版《中國藥典（一部）》中川牛膝、黃芪、雞血藤點樣量分別為5 μL、5～10 μL、5～10μL［20］。通過考察點樣量發現，芪龍活絡顆粒中川牛膝、雞血藤點樣量在3～4μL 時具有較好的斑點，超過5 μL 后原點處易出現溶劑擴散現象。故點樣量選擇2～5μL。

3.2 色譜條件考察

前期研究中，通過對比2020 年版《中國藥典（一部）》中丹參的色譜條件，并參考文獻［12-13］，最終選擇2020 年版《中國藥典（一部）》中丹參的色譜條件，并調整流動相比例，最終確定2.2.1項下色譜條件。

3.3 含量測定結果分析

芪龍活絡顆粒由8味中藥材組方，藥味中所含活性物質較多。中藥復方煎煮后往往發生較多的化學反應與生物活性轉化，故僅測定單一物質成分含量無法全面評價藥品的質量。為更好地控制產品質量，制備過程中對顆粒的烘干溫度、時間、輔料加入量進行考察，優化了提取工藝與顆粒劑制備工藝。由5批樣品含量測定結果可知，樣品中丹酚酸B 含量為1.09～1.32 mg/ g，兩者相差0.23 mg/g，通過查看批生產記錄，發現樣品出膏率也存在一定差異，其含量差異變化有待進一步驗證。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法專屬性好、結果準確，可用于芪龍活絡顆粒的質量控制。