血清LRG1表達水平在乳腺癌診斷中的應用

孫平 高可欣 包鴻蓉 孫成 張靜 王大治

【摘要】 目的：檢測乳腺癌患者血清和癌組織內富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-richalpha-2glycoprotein1，LRG1）的表達并分析其臨床意義。方法：選取2021年6月—2022年3月就診于牡丹江市腫瘤醫院的86例女性乳腺癌患者，86例乳腺小葉增生或纖維瘤患者作為良性病變組，21例健康志愿者作為對照組。比較三組血清LRG1的表達差異，分析其與患者年齡、臨床分期及淋巴結轉移等臨床因素的關系。免疫組化染色檢測癌組織和癌旁組織內LRG1表達的平均灰度值。結果：乳腺癌組和良性病變組血清內LRG1的表達均明顯高于對照組，乳腺癌組LRG1表達明顯高于良性病變組，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同年齡組乳腺癌患者血清內LRG1的表達，差異有統計學意義（P<0.05）。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清內LRG1的表達低于Ⅲ+IV期，差異有統計學意義（P<0.05）。淋巴結轉移組血清內LRG1表達明顯高于未發生淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P<0.05）。乳腺癌組織內LRG1平均灰度值明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：LRG1在乳腺癌患者血清和癌組織內明顯升高，并與臨床因素緊密相關，可作為乳腺癌診斷的潛在生物標志物。

【關鍵詞】 富亮氨酸α2糖蛋白1 乳腺癌 臨床分期 淋巴結轉移

Application of Serum LRG1 Expression Level in Diagnosis of Breast Cancer/SUN Ping， GAO Kexin， BAO Hongrong， SUN Cheng， ZHANG Jing， WANG Dazhi. //Medical Innovation of China， 2024， 21（12）： 0-043

[Abstract] Objective： To detect leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 （LRG1） of breast cancer patients in serum and in cancer tissues， respectively， and to analyze their clinical significance. Method： A total of 86 female patients with breast cancer treated in Mudanjiang Tumor Hospital from June 2021 to March 2022 were selected， 86 patients with lobular hyperplasia or fibroma of the breast were selected as the benign group， and 21 healthy volunteers were selected as the control group. Difference of serum LRG1 expression among the three groups were compared， and then their relationship with clinical factors such as patients' age， clinical stage and lymph node metastasis were analyzed. Mean gray value of LRG1 expression was detected by immunohistochemical staining in breast cancer tissues and the adjacent tissues， respectively. Result： Level of serum LRG1 in breast cancer group and benign group was much higher than that in control group， and LRG1 expression in breast cancer group was significantly higher than that in benign group， the differences were significant difference （P<0.05）. There was significant difference in serum LRG1 expression in patients with different age （P<0.05）. Serum LRG1 expression in patients with stage Ⅰ+Ⅱ was significantly lower than that of patients with stage Ⅲ+Ⅳ， the difference was statistically significant （P<0.05）. Serum LRG1 expression in lymph node metastasis group statistically was higher than that of no lymph node metastasis group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Mean gray value in breast cancer tissues was significantly lower than that in the adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Serum LRG1 is significantly elevated in serum and cancer tissues of breast cancer patients， and closely related to clinical factors， which can be used as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer.

[Key words] Leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 Breast cancer Clinical stages Lymph node metastasis

First-author's address： Department of Anatomy， Basic Medicine School of Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.12.010

乳腺癌是全球女性罹患的各種癌癥中發病率最高，導致女性死亡的第二大癌癥[1-2]。據美國癌癥協會（American cancer society，ACS）最新數據統計顯示，2022年美國新發乳腺癌病例34萬，有4萬女性死于乳腺癌，其中浸潤性乳腺癌占80%以上[3]。在我國，乳腺癌每年新發病例也呈逐年上升趨勢，據國家癌癥中心報告，2020年中國新發乳腺癌患者33萬，預計2025年將持續增加到36萬。乳腺癌不同于肝癌、肺癌等其他癌癥，乳腺位于體表臟器較淺位置，形成腫塊易被患者早期察覺。早發現、早診斷、早治療可將早期乳腺癌患者的生存率提高到90%以上[4]。目前臨床乳腺癌的確診主要依靠穿刺活檢或腫瘤切除后病理檢查，費用高、創傷大，患者不易接受。此外，臨床確診的乳腺癌患者中，仍有接近30%的乳腺癌患者死于遠處器官腦、肺、骨的多發轉移[5-6]。因此，尋找新的乳腺癌腫瘤標志物，探索乳腺癌侵襲轉移機制，既有助于乳腺癌的早期篩查，也利于制訂新的治療方案預防乳腺癌發生轉移。

富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是富含亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）家族的創始成員，早期作為炎癥反應產物從人類血清中發現，被認為是中性粒細胞早期分化標志物，與多種炎癥性疾病活動度密切相關[7-8]。作為急性期反應蛋白，當機體受到微生物感染或炎癥因子刺激時，血清中LRG1水平急劇增加，在獲得性免疫激活之前負責原始免疫反應，與疾病的嚴重程度直接相關[9-11]。目前，臨床乳腺癌常用癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為早期篩查的標志物，但由于特異性較差，還需尋找新的分子標志物。有關LRG1作為乳腺癌早期診斷標志物的相關研究報道較少，有待進一步研究。本研究采用ELISA分別檢測乳腺癌、乳腺良性病變和健康人群血液內LRG1蛋白的表達，并分析其與患者年齡、臨床分期和淋巴轉移等臨床因素的相關性；同時采用免疫組化染色法檢測乳腺癌組織和癌旁組織內LRG1的表達，分析LRG1在乳腺癌組織內的表達，并探討血清LRG1表達在乳腺癌患者診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年6月—2022年3月就診于牡丹江市腫瘤醫院的86例女性乳腺癌患者。納入標準：（1）符合乳腺癌的臨床診斷指標；（2）就診時未接受放療、化療、內分泌的治療；（3）乳腺癌初診；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他腫瘤疾病；（2）乳腺癌復發或乳腺癌術后；（3）合并有心、肝、腎、腦系統疾病；（4）妊娠期或哺乳期；（5）臨床資料不全。患者術后切除癌組織和癌旁組織放入10%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組化染色。術前采集腫瘤患者外周血。86例乳腺小葉增生或纖維瘤患者作為良性病變組。納入標準：（1）均經B超或X線確診的乳腺小葉增生或纖維瘤；（2）年齡>18歲；（3）未接受藥物治療；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）肝、腎功能異常；（2）對研究依從性不佳；（3）合并其他乳腺疾病。21例健康志愿者作為對照組。納入標準：（1）經

B超或X線確診乳腺形態、結構正常；（2）年齡>18歲；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）肝、腎功能異常；（2）對研究依從性不佳；（3）長期應用激素藥物。患者和家屬均簽署知情同意書。本研究經牡丹江市腫瘤醫院醫學倫理委員會批準后實施。

1.2 方法

（1）所有受試對象均于清晨空腹采血5 mL，

2 000 r/min離心10 min后，靜置30 min后收集上層血清，-70 ℃冰箱保存備用。采用ELISA法檢測各組血清內LRG1的表達。ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司，于450 nm處檢測各組樣品的吸光度（OD）值，操作步驟按說明書規范進行。（2）所有腫瘤患者組織標本采用免疫組化染色，經固定、包埋后制成3 μm厚的石蠟組織連續切片，覆于防脫載玻片上；經脫蠟、脫水，枸櫞酸高壓緩沖液修復10 min后室溫冷卻，PBS沖洗3次；3%H2O2抗原修復10 min，PBS沖洗3次；滴加一抗為小鼠抗人LRG1單克隆抗體（1︰100） 于4 ℃過夜，PBS沖洗3次；滴加二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB染色，蘇木素復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標與評價標準

采用ELISA法檢測乳腺癌組、乳腺良性病變組及對照組患者血清內LRG1的表達，比較各組LRG1表達的差異。采用免疫組化DAB染色，檢測86例乳腺癌患者組織切片內LRG1的表達，細胞質內出現棕黃色染色為陽性。利用Image J圖像軟件測量細胞內LRG1表達的平均灰度值，平均灰度值=背景灰度值-實測灰度值，染色越深，平均灰度值越小。

1.4 統計學處理

采用統計軟件SPSS 22.0進行數據分析，計量資料采用（x±s），比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組基線資料比較

乳腺癌組年齡32～75歲，平均（44.32±6.16）歲；良性病變組年齡28～69歲，平均（43.18±5.21）歲；對照組年齡為33～73歲，平均（43.27±5.09）歲。三組年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組血清內LRG1的表達

ELISA檢測結果顯示，對照組血清LRG1為（38.03±1.22）ng/mL，乳腺癌組和良性病變組血清LRG1分別為（129.58±3.45）ng/mL和（73.93±7.52）ng/mL。與對照組相比，乳腺癌組和良性病變組血清LRG1的表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。乳腺癌組和良性病變組相比，血清LRG1的表達水平也明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 乳腺癌患者血清內LRG1表達的臨床意義

不同年齡組乳腺癌患者血清內LRG1的表達相比，差異有統計學意義（P<0.05）。其中Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲ+Ⅳ期38例；伴有淋巴結轉移者39例。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清內LRG1的表達低于Ⅲ+Ⅳ期患者，差異有統計學意義（P<0.05）。發生淋巴結轉移的乳腺癌患者血清內LRG1的表達高于未發生淋巴結轉移的患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.4 乳腺癌組織和癌旁組織內LRG1的表達

免疫組化染色結果顯示，LRG1在乳腺癌細胞質內呈陽性表達，而癌旁組織內LRG1的表達不明顯。乳腺癌組細胞質內LRG1的平均灰度值為（31.02±6.81），明顯低于癌旁組的（89.54±9.83），差異有統計學意義（t=-45.381，P<0.05）。見圖1。

3 討論

乳腺癌早期篩查和正確診斷對指導患者制訂治療方案，提高患者的生存率，改善患者預后具有重要意義。近年來，血清腫瘤標志物檢測在乳腺癌的診斷和分期中發揮越來越重要的作用。血清腫瘤標志物由腫瘤細胞產生并分泌到血液循環中，以糖類、激素、蛋白質等代謝產物形式存在的一類物質，可在某種程度上反映腫瘤的生長情況。由于其具有快速、無創、費用低廉等特點，常用于腫瘤的早期篩查和治療方案的評估[12]。CEA作為一種廣譜的腫瘤標志物，常用于乳腺癌的輔助診斷和監測患者的病情發展[13]。但CEA作為一種起源于消化系統癌癥的多糖復合物，在乳腺癌的診斷中還存在敏感度不夠，特異度差等缺點，因此，需要尋求新的腫瘤標志物提高對乳腺癌發生發展的預測能力。

LRG1屬于一種血清分泌蛋白，包裹于胞漿的囊泡中，由腫瘤細胞分泌到細胞外發揮生物學功能。已有研究證實，LRG1可作為血清腫瘤標志物應用于腫瘤的早期篩查中[14-15]。如國內學者陳周峰等[16]檢測直腸癌患者血清中LRG1的表達水平明顯高于良性腫瘤組和健康對照組，并隨腫瘤分期增加，LRG1的表達水平明顯升高。國外Yammoto等[17]檢測了184例胃癌患者血清內LRG1的表達，發現LRG1高表達組的總生存率明顯低于LRG1低表達組，總體生存率的Cox多變量分析顯示LRG1表達是一個獨立的預后因素。本研究結果顯示，乳腺癌組LRG1的表達水平明顯高于良性病變組和對照組，可作為乳腺癌的鑒別診斷參考指標。進一步分析發現，LRG1的表達會隨著腫瘤分期增加表達上調，表明LRG1與乳腺癌病程進展、嚴重程度有關。淋巴結轉移是乳腺癌最常見的轉移途徑，臨床患者多因自查發現腋窩淋巴結腫大而就診，淋巴結是否腫大是鑒別乳腺腫塊良、惡性的重要體征之一[18-20]。本研究發現淋巴結轉移組LRG1的表達明顯高于未發生淋巴結轉移組，意味著乳腺癌患者血清內LRG1的升高與癌細胞淋巴轉移相關，可作為早期判斷癌細胞是否發生淋巴結轉移的評估指標。此外，本研究通過免疫組化染色發現，LRG1在乳腺癌組織內呈明顯陽性表達，而癌旁組織基本不表達，表明LRG1在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。可見，作為乳腺癌衍生的血液標志物，LRG1的血清水平可作為乳腺癌診斷的潛在生物標志物，值得今后臨床高度重視。

綜上所述，本研究表明LRG1的血清水平可作為乳腺癌患者潛在的診斷標志物。當然，腫瘤細胞并不是LRG1的唯一來源，在腫瘤微環境（tumor microenviroment，TME）中，包括內皮細胞和髓細胞在內的基質細胞也有助于LRG1的產生。因此，LRG1聯合其他腫瘤分子標志物聯合檢測，或許更有助于提高乳腺癌早期診斷率，這有待后續研究進一步證實。

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（收稿日期：2023-10-20） （本文編輯：白雅茹）