傳統發酵牦牛乳制品中微生物群落及其與代謝產物相關性

梁曉琳，張哲川，王宇豪，丁 波，劉紅娜,*

（1.西北民族大學生物醫學研究中心，生物工程與技術國家民委重點實驗室，中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

微生物發酵是青藏高原牧民延長鮮牦牛乳貨架期和豐富乳品風味的有效途徑。由于牧區缺乏新鮮蔬菜水果，以牦牛乳為原料的自然發酵乳制品便成為藏區牧民日常飲食的主要構成部分。這類乳制品能提供足夠的營養，是牧民抵御高寒高海拔環境的能量來源，同時也是牧民重要的經濟來源[1]。牦牛酥油、曲拉、牦牛酸奶是我國特色傳統發酵乳制品，其中酥油是以牦牛乳脂肪為原料發酵數小時至3 d的高脂乳制品，曲拉是由脫脂牦牛乳制成的天然發酵干制奶酪，牦牛酸奶是一種添加發酵劑發酵8～24 h的發酵乳[2]。開放的生產方式使這些手工制作的乳制品微生物結構復雜，形成一系列與風味相關的代謝物。通過比較傳統發酵牦牛乳制品的微生物群落結構，明確其與代謝產物的關系，為調控發酵牦牛乳制品的品質提供理論基礎。

穩定的微生物群落結構是保證發酵乳制品品質與安全的基礎[3]。高通量測序常被用于分析發酵食品中微生物群落，包括微生物動力學、食品安全和功能健康等方面[4]。對發酵牦牛乳制品而言，目前研究主要集中在簡單的微生物區系分析和乳酸菌種類鑒定[5-7]。據報道，乳制品的發酵初期品質主要與細菌（如乳酸菌）和酵母（如酵母菌）有關[8]。有學者證實了各種細菌是建立成熟奶酪風味特性的關鍵[9]。此外，廣闊的青藏高原是豐富的微生物資源庫[10]。為此，除了研究發酵牦牛乳制品個別特征菌屬的相對豐度和作用，還需要進一步分析整體的微生物群落構成。

食品中的微生物豐度與代謝物有關，例如有機酸和脂質[11-12]。Li Yandie等[13]利用非靶向代謝組學技術檢測發酵干酪中特定代謝物和風味前體化合物，如有機酸、脂質、氨基酸等。Unno等[14]通過分析成熟奶酪中的代謝物鑒定重要的風味化合物，并間接揭示可能存在的細菌。使用代謝組學還可篩選與切達干酪質量相關的生物標志物[15]。盡管如此，發酵牦牛乳制品中微生物群和代謝物及其影響品質的相互關系仍然知之甚少，青藏高原的微生物資源更是未知。因此，深入研究不同類型發酵乳制品的微生物組成，明確各菌屬對代謝產物的貢獻，對穩定發酵牦牛乳制品的品質具有重要指導意義。

本研究以傳統發酵牦牛乳制品為對象，采用Illumina MiSeq第二代測序技術研究不同類型發酵牦牛乳制品的微生物多樣性；同時，基于氣相色譜-飛行時間質譜（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GCTOF-MS）非靶向代謝組學技術通過多元統計分析篩選差異代謝物。結合微生物和代謝組學結果，對傳統發酵牦牛乳制品優勢微生物的多樣性與代謝組分進行關聯分析，旨在為更好地提高不同類型傳統發酵乳制品的品質和實現工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從牦牛奶主要產區中國甘肅甘南牧區合作市當周草原（東經102°、北緯34°）采集酥油、曲拉、牦牛酸奶各3 份（共9 份）。在采樣過程中，牦牛酸奶（YY1、YY2、YY3）收集100～300 mL，酥油（YG1、YG2、YG3）、曲拉（QL1、QL2、QL3）各100 g，一式3 份，將所有樣品置于無菌瓶中編號，并放于冰盒內保存。取樣完畢后，24 h內將樣品轉移到實驗室以備實驗。

所有分離用有機溶劑均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機 美國賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DYCZ-21電泳槽、DYY-6D電泳儀 北京六一生物科技有限公司；ETC 811聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京東勝創新生物科技有限公司；GL-88B旋渦儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；7890 GC-TOF-MS儀（配有DB-5MS毛細管柱）美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物基因組的提取及測序

取適量樣品放入2 mL 樣品管，在組織破碎儀中破碎提取。參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA提取試劑盒提取樣品DNA。利用含有Barcode引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）擴增細菌16 SrRNA V3～V4 區域；利用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）擴增真菌ITS1～ITS2區域，在Illumina MiSeq?/HiSeqTM平臺進行測序。

1.3.2 GC-TOF-MS代謝物測定

代謝物提取：根據Nie Xin等[16]的研究稍作修改。取樣本（25±1）mg于2 mL EP管中，加入500 μL預冷提取液，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min，將混合物均質。然后以4 ℃、12 000 r/min離心15 min。移取100 μL上清液于1.5 mL EP管中，真空干燥提取物。

代謝物衍生化：向干燥后的代謝物加入40 μL甲氧胺鹽試劑，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min，隨后向每個樣品中加入60 μL衍生試劑N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含有體積分數1%三甲基氯硅烷），將混合物70 ℃孵育1.5 h，冷卻至室溫后隨機上機檢測。

GC-TOF-MS具體分析條件如表1所示。

表1 GC-TOF-MS分析條件Table 1 Analytical conditions for GC-TOF-MS

1.4 數據處理與分析

以相似性97%對各樣本有效數據進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，選取代表性的OTU序列與Silva數據庫（http://www.arb-silva.de）進行比對注釋，確定各OTU的分類學信息，進而計算各樣品在門和屬水平的相對含量。基于OTU聚類分析結果，進行α多樣性分析。

將獲得的GC-TOF-MS原始數據進行偏離值過濾、缺失值過濾、填補及數據標準化處理。根據人類代謝組數據庫（Human Metabolome Database，HMDB）和有機小分子生物活性數據庫（PubChem (nih.gov)）進行鑒定。數據導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。并利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進行代謝通路分析。使用GraphPad Prism 9.0軟件統計分析和繪圖，采用ANOVA進行組間差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同傳統發酵牦牛乳制品中微生物群落結構分析

Shannon指數可用于估算樣品中微生物多樣性；Chao1 指數反映群落中OTU 數目即群落豐富度；Shannoneven指數反映物種個體數目在群落中分配的均勻程度。在細菌的測序結果中，YG1具有最高的Chao1指數（表2），說明此酥油樣品中細菌群落豐富度較高。QL2具有最高的Shannon指數、Shannoneven指數，說明QL2細菌群落多樣性最高，且細菌群落分布均勻；而YY組細菌群落的多樣性和豐富度最低。真菌的測序結果顯示，QL2樣品具有最高的Shannon指數和Shannoneven指數（表3），表明QL2樣品的真菌群落多樣性最高且數目分配狀況均勻，與細菌微生物群落特征相似。此外，YY組的Shannon指數整體較高，表明酸奶樣品真菌群落較為復雜。所有樣本覆蓋率高（＞99.8%），本測序結果能反映不同傳統乳制品樣本中微生物群落真實狀況。

表2 Illumina測序細菌統計信息Table 2 Statistics of Illumina sequencing data of bacterial community

表3 Illumina測序真菌統計信息Table 3 Statistics of Illumina sequencing data of fungal community

發酵乳制品的微生物種類和數量直接影響產品的品質和安全性[9]。為了更好地了解不同傳統發酵牦牛乳制品的微生物群落，對OTU標簽進行了門和屬水平的分類。3 種傳統牦牛乳制品樣品共鑒定出4 個細菌門（圖1A），包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），共占樣品中細菌菌落總數的99%以上。此外，在真菌門水平的相對豐度中發現，子囊菌門（Ascomycota）是發酵牦牛乳制品的優勢真菌門，其次是擔子菌門（Basidiomycota）（圖1B）。結果表明，在門水平上這些傳統乳制品間的微生物菌群具有相似性。

圖1 基于門水平3 種乳制品樣品中細菌（A）、真菌（B）菌群結構分析結果Fig.1 Structural analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities at the phylum level in three fermented yak milk products

由圖2A可知，屬水平上，不同類型的傳統發酵乳制品的微生物群落結構不同。在YY和QL樣品中發現10 個優勢細菌屬，YG樣品中共鑒定出16 個優勢細菌屬。乳桿菌（Lactobacillus）為YY和QL的優勢細菌，含量顯著高于YG樣品，部分樣品還檢測到鏈球菌屬（Streptococcus）。乳桿菌可產生α-半乳糖苷酶，推測此酶對酸奶和曲拉發酵過程中風味形成相關的碳水化合物代謝起重要作用，進而影響產品的風味。同時，乳桿菌還具有降低人體腸道pH值、代謝乳糖、抑制人體腸道內的病原菌以維持腸道微生態平衡等功效[17]。而YG樣品以乳球菌屬（Lactococcus）為主。乳球菌和乳桿菌作為發酵劑，在發酵乳制品中起到促進凝乳的作用[18]。其次，QL和YG鑒定的優勢細菌還有明串珠菌（Leuconostoc）。乳桿菌、乳球菌、鏈球菌和明串珠菌是乳制品中優勢菌屬，主要是來自厚壁菌門，它們通過消耗乳糖和其他碳水化合物、蛋白質、肽和脂肪產生短肽、游離氨基酸、短鏈脂肪酸和芳香族化合物，有助于乳制品形成風味和產生營養成分[19]。特別的是，醋酸桿菌屬（Acetobacter）主要在QL樣品中被檢測到，而Zhu Yan等[20]對青藏高原曲拉的細菌群落研究中也發現曲拉樣品共有的優勢菌為醋酸桿菌，但不同來源的樣品中微生物群落存在顯著差異，推測該菌對曲拉的品質有獨特影響。然而，部分樣品含有食源性致病菌及與環境污染有關的細菌屬，如不動桿菌（Acinetobacter）、腸桿菌（unclassified_Enterobacteriaceae）、金黃桿菌（Chryseobacterium）、腸球菌（Enterococcus）等。致病菌的存在是由于傳統發酵牦牛乳制品通常是在家庭作坊生產的，采用開放式的自然發酵生產工藝，容易受到擠奶方式、牦牛生理狀況和飼養方式、乳制品生產方法的影響[21]。改善生產過程中的環境衛生條件，有助于減少或避免感染致病菌，穩定牦牛乳制品的質量安全。在真菌屬中，傳統乳制品中共有真菌屬為地霉屬（Geotrichum），其他真菌屬種類及含量均存在一定差異（圖2B）。地霉屬存在于牛乳及乳制品中，如生產卡門培爾干酪、羅奎福特干酪和青紋干酪時需要依靠霉菌[22-23]。畢赤酵母（Pichia）在YY組和QL組中均能檢測到，而克魯維酵母（Kluyveromyces）主要存在于YY組中。克魯維酵母是蒙古發酵乳制品酸馬乳的主要分離物，這是因為馬乳比其他動物乳含有更高的糖濃度和更低的脂肪濃度[24]。YG組使用乳脂肪制作，QL組使用的是脫脂乳（大部分為蛋白質），而YY組使用的是新鮮牦牛乳，各組別的組分有所差異，發酵方式和用于發酵的底物也各不相同。對于YY組，來自牦牛乳中的乳糖作為底物被分解[25]，促進乳糖發酵酵母的生長繁殖。因此，本研究中克魯維酵母為YY組特有的菌屬。此外，3 類發酵牦牛乳制品的制作工藝不同也影響了它們的微生物組成。結果表明，不同類型的發酵牦牛乳樣本中的微生物群在屬水平上表現出較高的生物多樣性。

圖2 基于屬水平3 種乳制品樣品中細菌（A）、真菌（B）菌群結構分析結果Fig.2 Structural analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities at the genus level in three fermented yak milk products

綜上所述，有必要系統探索傳統發酵牦牛乳制品的菌群結構，加快從傳統的生產模式過渡到現代標準化的生產進程，這將有助于穩定發酵牦牛乳制品的品質。

2.2 不同傳統牦牛發酵乳制品多元統計分析

代謝組學技術已被廣泛應用于食品研究中，利用GC-TOF-MS分析可鑒定樣品的發酵代謝物[26]。采用PCA突顯代謝組學數據的總體分布趨勢以及組間樣本的差異程度。由圖3可知，PC1的方差貢獻率為51.2%，PC2的方差貢獻率為20.9%。從主成分軸上可明顯劃分為酥油、曲拉和酸奶3 組，且曲拉和酸奶組與酥油組差異較大，這可能是因為不同的加工制作方法和發酵程度使3 種發酵乳制品逐漸形成復雜的微生物群落，從而導致相應產品中代謝產物的差異[26]。

圖3 不同傳統乳制品中代謝物PCA得分散點圖（A）、PLS-DA得分散點圖（B）、響應排序檢驗圖（C）Fig.3 PCA scatter plot (A),PLS-DA scatter plot (B) and permutation test plot (C) for metabolites in different traditional fermented yak milk products

為進一步體現組別之間的差異，對樣品采用有監督模式的PLS-DA方法。分別為71.9%、70.1%，PLS-DA和PCA的結果均表明這3 組樣本集能明顯分離，說明它們之間的代謝物差異明顯。這說明代謝物差異受傳統發酵乳制品種類的影響。為了防止模型過度擬合，對PLS-DA模型進行排列檢驗，R2＝（0.0，0.493），Q2＝（0.0，-0.154），結果表明本研究中的模型具有良好的可預測性和可重復性，沒有過度擬合，可以進一步篩選3 組樣本聚類的差異代謝物。

2.3 不同傳統發酵牦牛乳制品差異代謝物及代謝途徑分析

基于變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）預測值和P值的選擇能識別差異顯著的代謝物。根據VIP≥1和P＜0.05，共鑒定出51 種顯著差異代謝產物，主要包括脂質和類脂質分子（21 種）、有機酸及其衍生物（17 種）、有機雜環化合物（4 種）等（圖4A）。根據其豐度變化進行層次聚類分析，并以熱圖概述不同發酵乳制品中代謝物類型。如圖4B所示，3 種傳統發酵牦牛乳制品可以明顯分為3 個類別，其中曲拉和牦牛酸奶樣品之間的化學相似性更大，這與PCA和PLS-DA的預測結果一致。51 種代謝產物被分為4 個聚類。

圖4 不同類型乳制品通過PLS-DA建模VIP值（A）、代謝物的層次聚類分析熱圖（B）和差異代謝物KEGG富集圖（C）Fig.4 PLS-DA VIP scores (A),hierarchical cluster heatmap (B) and KEGG enrichment map (C) of differential metabolites

第1聚類由14 種代謝產物組成，包括植烷酸、衣康酸、2-羥基吡啶、乳酸、對異丙基苯甲酸、角鯊烯、辛酸、瓜氨酸、D-赤酮酸內酯、乳糖、硬脂醇、蠟酸、戊二醛、棕櫚油酸甲酯，其中8 種代謝物屬于脂質和類脂質分子，主要為酥油的特征代謝物。乳酸是由丙酮酸通過乳酸脫氫酶產生，給酥油帶來良好的風味和醇厚的口感[27]。乳糖是乳及乳制品中主要的滋味貢獻物質。乳酸菌將乳糖分解為單糖，產生包括乳糖酶在內的多種代謝酶類，代謝產生多種風味物質[28]。同時，研究發現酥油樣品組中存在角鯊烯。據報道，角鯊烯具有抗氧化、抗腫瘤、提高缺氧耐受力、抗心血管疾病、抗菌消炎等作用[29]。這些代謝物對酥油的風味品質和營養起重要作用。

第2～3聚類屬于曲拉樣品的代謝物，主要由10 種有機酸及其衍生物、7 種脂質和類脂質分子、2 種有機雜環化合物等25 種化合物組成。有機酸及其衍生物作為發酵制品中豐富而顯著的差異代謝物，具有呈香、呈味作用，同時也可在發酵過程中抑制雜菌的生長[30-31]。Wang Yujing等[22]對云南酸乳扇的研究發現，有機酸一部分來源于牦牛乳經過發酵乳糖后的轉化，另一部分來源于發酵過程中微生物代謝產生，如酵母菌在發酵過程中能產生琥珀酸，醋酸菌、乳酸菌等產酸菌可以產生乙酸、乳酸、草酸、丙酮酸等各種有機酸[32]。這些有機酸各具獨特的風味，只有當各種有機酸比例相互協調時，才能保證產品的品質。本研究在不同乳制品差異代謝物中檢測到的有機酸及其衍生物有草酸、乳酸、琥珀酸等。琥珀酸能產生鮮味，是三羧酸循環和糖酵解的重要中間產物[33]，各樣品中的琥珀酸含量差異很可能與發酵工藝和貯藏時間有關。發酵時間以及貯存時間過長都會導致琥珀酸含量升高。脯氨酸、天冬氨酸、絲氨酸等可通過氨基酸轉化酶轉化為揮發性氣味化合物，為乳制品提供良好的滋、氣味。造成不同類型發酵乳制品間氨基酸的差異可歸因于微生物中的氨基酸溶出不同[34]。

第4聚類中發現酸奶含有較多的脂質和類脂質分子與有機酸及其衍生物，包括棕櫚酸、硬脂酸等多種脂肪酸，對乳制品風味的形成具有重大作用。這類脂肪酸主要來源于原料乳，由于曲拉的生產原料乳為脫脂牦牛乳，因此在曲拉樣品中較少檢出。4-乙酰氨基丁酸普遍存在于酥油、酸奶組中，其具有降低血壓、改善腦功能、增強記憶力的生理活性[35]。β-丙氨酸的含量在酸奶組中顯著高于其他兩個樣品組。總之，由于生產工藝、發酵微生物的作用和發酵環境等多種因素影響，傳統乳制品的代謝物復雜多樣。

發酵乳制品的風味和品質受到不同的代謝物質和反應共同調控，除了對代謝物質差異進行分析，還需進一步對其代謝通路進行分析。KEGG代謝途徑用于分析探索差異代謝物可能的代謝途徑，圖4C顏色由藍到黃代表富集因子依次增加；氣泡大小代表富集到該通路的差異代謝物數目。本研究發現傳統發酵牦牛乳制品存在新陳代謝途徑、ABC轉運、碳水化合物代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、中心碳代謝、氨基酸的生物合成、脂肪酸的生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、礦物質吸收、半乳糖代謝、嘌呤合成代謝12 種代謝途徑。這些代謝途徑與氨基酸和脂質分解代謝密切相關，表明牦牛乳制品中的脂肪分解和氨基酸代謝可能是影響產品質量的關鍵。

2.4 微生物屬水平與差異代謝物的相關性分析

發酵乳制品微生物群和代謝產物之間存在密切關系。選取差異代謝物中VIP值前10的代謝物與微生物群落的結果（屬水平）進行Pearson相關性分析，結果如圖5所示。在細菌網絡中，大多數細菌屬彼此之間呈正相關[20]。而本研究從細菌之間的相互作用及細菌與代謝物之間的相關性顯示乳球菌與乳桿菌呈負相關。在微生物-代謝關系中，乳桿菌與除植物醇外的9 種代謝物呈顯著正相關，乳球菌則恰好相反。當乳球菌增加時乳桿菌數量降低，兩者存在競爭抑制關系，它們的相對含量對乳制品風味有顯著影響，進而導致酸奶、曲拉及酥油間風味存在差異。結果表明，發酵乳制品中的微生物并不是孤立存在的，而是形成了復雜的和相互作用的生態網絡。在切達奶酪微生物-代謝關系研究中還發現鏈球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、巨大球菌屬和明串珠菌屬與氨基酸顯著相關[36]。本研究發現脯氨酸（甜味氨基酸）只與乳桿菌和鏈球菌呈正相關，說明乳桿菌和鏈球菌對甜味的產生有間接作用。克魯維酵母和畢赤醇母與有機酸呈顯著正相關（P＜0.05），這是由于酵母分解乳糖同時生成大量的有機酸。細菌屬中，乳桿菌屬、乳球菌屬與代謝物有較高的相關性，真菌屬中克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、地霉屬和短梗霉屬（Aureobasidium）與代謝物有較高的相關性，推測它們對3 種發酵牦牛乳風味品質和營養的形成有重要貢獻。由此可見，各類微生物的作用機制有所差異，進而形成了不同類型發酵牦牛乳制品代謝產物與營養物質的迥異。本研究揭示了3 種發酵牦牛乳制品的微生物結構及代謝的關聯，為進一步基于假設的靶向研究與途徑分析相結合提供了基礎，這將有利于牦牛乳制品行業的產業化和標準化生產。

圖5 所有乳制品樣品中差異代謝物與屬水平細菌（A）、真菌（B）的Pearson相關性分析Fig.5 Pearson correlation analysis of differential metabolites with bacteria (A) and fungi (B) at the genus level in fermented yak milk products

3 結論

本實驗研究3 種傳統牦牛乳制品微生物群落結構及其對代謝產物的貢獻，揭示了屬水平上微生物豐度差異，特別是乳桿菌、乳球菌、畢赤酵母和克魯維酵母。不同類型的發酵牦牛乳制品篩選的51 種差異代謝物中主要包括脂質和類脂質分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物等。使用KEGG富集分析得到12 種代謝途徑，大部分與氨基酸和脂質分解代謝密切相關。傳統發酵牦牛奶樣品的微生物組成與代謝物之間有緊密聯系。乳桿菌和鏈球菌與脯氨酸呈正相關，克魯維酵母和畢赤醇母與有機酸呈顯著正相關，推測這些是影響產品品質的關鍵菌。然而，影響發酵乳制品品質的因素比較復雜，微生物、代謝產物與發酵牦牛乳制品風味的關系有待通過其他組學方法進一步驗證，包括宏基因組學、蛋白質組學和元轉錄組學。