化肥有機(jī)肥配施比例對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物的影響

關(guān)鍵詞： 化肥有機(jī)肥施用比例； 13C-標(biāo)記； 光合同化碳； PLFA 含量； 微生物多樣性

油菜是我國重要的油料作物，同時也是一種對氮肥需求高和對氮素缺乏敏感的作物[1]，適合的土壤氮素供應(yīng)對油菜生長發(fā)育和穩(wěn)產(chǎn)豐產(chǎn)起著不可忽視的作用[2]。然而，在長江流域油菜主產(chǎn)區(qū)不合理施肥現(xiàn)象較為普遍[3]，為了追求更高產(chǎn)量過量施用化肥[4?5]，而有機(jī)肥施用量急劇下降，我國2010 年有機(jī)肥施用量僅占總施肥量的10%[6]。長期過量施用化肥會導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)惡化、土壤退化[7]、土壤整體微生物群落多樣性降低[8]。施用有機(jī)肥能夠提高土壤養(yǎng)分含量，改善土壤理化性質(zhì)，提升土壤微生物活性[9]。在農(nóng)藥化肥雙減背景下，化肥有機(jī)肥配施對于保障糧油安全和環(huán)境友好具有重要意義。前人研究發(fā)現(xiàn)，化肥有機(jī)肥配施能夠改善土壤結(jié)構(gòu)[10]，增加土壤肥力[11]，有利于土壤培肥和作物增產(chǎn)[9]。土壤微生物的變化能夠敏感反映土壤質(zhì)量變化[12]，微生物群落對作物生長和土壤養(yǎng)分平衡起著調(diào)節(jié)作用[13]。王逗等[14]發(fā)現(xiàn)，長期施用有機(jī)肥能夠增加細(xì)菌與真菌種群豐度和多樣性，改變土壤養(yǎng)分循環(huán)特征。王偉華等[15]采用磷脂脂肪酸法PLFA 對微生物群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥+化肥配施的土壤真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的PLFA 值最高，長期化肥配施有機(jī)肥能顯著增加土壤養(yǎng)分含量和土壤微生物量，改善微生物群落結(jié)構(gòu)和活性，最終培肥地力，優(yōu)化土壤微生物結(jié)構(gòu)。

根際是微生物數(shù)量和活性最高的區(qū)域，是土壤環(huán)境最復(fù)雜的區(qū)域，同時也是微生物與植物的相互作用最強(qiáng)烈的區(qū)域[16?17]。宋以玲等[18]發(fā)現(xiàn)，在化肥減量10%～30% 下，配施等量有機(jī)肥增加了根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，顯著降低了真菌數(shù)量，同時提高了根際土壤中有效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量。根系分泌物是根系釋放到根際環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)和一些無機(jī)離子的總稱，能夠?yàn)楦H微生物提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和能源，驅(qū)動著根際的微生物過程[19]。植物光合同化碳以根際沉積物的形式進(jìn)入土壤，是根際微生物的主要碳源和能量來源，自然條件下，通過根系分泌物向地下輸送有機(jī)化合物的量約占凈光合同化碳的17%[20]。根際微生物對光合同化碳的利用能夠顯著影響土壤碳固定過程，研究化肥有機(jī)肥不同配比對根際微生物利用光合同化碳的影響，對于進(jìn)一步了解根際土壤碳循環(huán)和碳固定過程具有重要意義。

研究表明，合理的有機(jī)肥配比會促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的積累和根際微生物的活動，進(jìn)一步影響其對光合同化碳的利用能力，從而提高土壤的碳固定能力[17]。一些微生物可能利用有機(jī)肥中的氮素來代謝光合同化碳，從而影響土壤中的氮素循環(huán)和生物固氮過程。這對于推動農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和土壤健康的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。近期發(fā)展起來的穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)SIP，能夠定量研究參與光合同化碳轉(zhuǎn)化的微生物群落，13C-PLFA 以其操作簡單、能快速處理大量樣品、靈敏度高等特點(diǎn)，被廣泛用于利用光合同化碳微生物的研究[21]。

前人對化肥有機(jī)肥配施對土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響已經(jīng)做了大量研究，本研究利用13C 標(biāo)記磷脂脂肪酸法（13C-PLFA），探究不同化肥有機(jī)肥配施對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物多樣性的影響，解析影響利用光合沉積碳土壤微生物群落分布的主要環(huán)境因素，這對指導(dǎo)科學(xué)施肥，調(diào)控土壤微生物群落健康，保證油菜種植的可持續(xù)發(fā)展和地力提升具有重要的經(jīng)濟(jì)意義與研究意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤于2017 年從中國科學(xué)院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站（111°26′E，28°55′N，海拔92.2 m） 旱地采集，為亞熱帶第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育的典型紅壤，其0—20 cm 土層基本理化性質(zhì)為：pH 4.55、有機(jī)質(zhì)13.8 g/kg、全氮0.84 g/kg、全磷0.38 g/kg、全鉀12.3 g/kg、堿解氮77.8 mg/kg、有效磷6.05 mg/kg、速效鉀103 mg/kg[14]。

盆栽試驗(yàn)于2017 年11 月24 日 至2018 年1月2 1 日，在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所（118°05′E，28°12′N） 溫室進(jìn)行，供試作物為油菜（ Brassica napus L.），品種為湘雜油6 號。

1.2 化肥有機(jī)肥配比試驗(yàn)

共設(shè)置化肥與有機(jī)肥5 個配比處理，各處理按照等氮、磷、鉀量原則，以純氮量折算有機(jī)肥用量，再計(jì)算有機(jī)肥中帶入的磷和鉀量，不足部分由化肥補(bǔ)齊。依據(jù)有機(jī)肥在總氮投入中的占比 0%、25%、50%、75%、100%，依次記為CK、OF25、OF50、OF75、OF100，每個處理4 次重復(fù)。供試化肥包括尿素、過磷酸鈣（P2O5） 和氯化鉀（K2O ），有機(jī)肥采用經(jīng)過發(fā)酵處理后自然風(fēng)干的牛糞，其養(yǎng)分含量為N 1.09 g/kg、P2O5 4.39 g/kg、K2O 18.46 g/kg。

1.2.1 植株栽培 盆栽試驗(yàn)采用高20 cm、直徑16 cm 的PVC 管制作而成的根箱裝置[14]，將田間采集的土壤去除植物殘留和雜質(zhì)后過2 mm 篩，風(fēng)干后與不同配比的化肥有機(jī)肥混合均勻，使土壤中肥料含量最終達(dá)到N 200 mg/kg、P2O5 130 mg/kg、K2O200 mg/kg；將混勻土壤裝入種植盆中，每盆土樣3.5 kg。調(diào)節(jié)土壤含水量至土壤田間含水量的75%，然后移栽3 株長勢一致的2 周齡油菜幼苗。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 同位素標(biāo)記 13CO2 脈沖標(biāo)記工作于油菜移栽40 天后蕾苔期進(jìn)行，將直徑15 cm、高60 cm 的有機(jī)玻璃罩置于盆栽上，每天11：00—16：00 用注射器向盆中注射高純13CO2，每1 h 充1 次，每次充0.1 L，每天充5 次，連續(xù)標(biāo)記20 天。油菜施肥、移栽60天后破壞性采集根際土壤，經(jīng)液氮速凍后于?80℃ 冷凍保存，研磨過2 mm 篩，于Teflon 管中保存。

1.3.2 磷脂脂肪酸PLFA 提取與測定 微生物群落結(jié)構(gòu)用土壤磷脂脂肪酸phospholipid fatty acid（PLFA） 表示，通過確定不同樣品中PLFA 的種類與豐度，推斷出微生物群落組成的變化與差異。PLFA的提取分為三步：提取、純化與衍生化。使用溶劑氯仿―甲醇從土壤樣品中提取PLFA，隨后用固相萃取法去除可能干擾分析的雜質(zhì)和其他脂質(zhì)化合物，將純化的 PLFA 衍生化，將其轉(zhuǎn)化為適合氣相色譜（GC） 分析的揮發(fā)性化合物，隨后采用氣相色譜儀測定，根據(jù)化學(xué)性質(zhì)分離各個脂肪酸甲酯[ 2 2 ]。PLFA的13C 值測定采用氣相色譜?燃燒?同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用儀（系統(tǒng)包括DeltaV 同位素比值質(zhì)譜儀，氣相色譜儀單四級桿質(zhì)譜儀，配備NIST11 譜庫） 測定；在標(biāo)記組和對照組均能測到1 3C 值的PLFA 單體共有15 種，包括12 種細(xì)菌：14：0、16：0、15：0、18：0、19：0、20：0、17：0、a15：0、i17：0、2OH 14：0、3OH14：0、cy17：0，其中a15： 0、i17： 0 為革蘭氏陽性菌（G+），2OH 14：0、3OH 14：0、cy17： 0 為革蘭氏陰性菌（G?），3 種真菌：18：1w9tans、18：2w6c、18：1w9c。根據(jù)脂肪酸分子碳鏈長度、雙鍵位置和官能團(tuán)等信息進(jìn)一步分析15 種微生物群落PLFAs 結(jié)構(gòu)特征，得到5 類脂肪酸，分別是直鏈飽和脂肪酸（SATFA）、支鏈飽和脂肪酸（ B R F A ） 、單鍵不飽和脂肪酸（MUFA）、羥基脂肪酸（OHFA） 和多鍵不飽和脂肪酸（PUFA），分別分析其相對豐度，計(jì)算其絕對數(shù)量。以15 種PLFA 單體的數(shù)量總和表示總微生物生物量。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)測定 土壤有機(jī)碳采用硫酸?重鉻酸鉀外加熱容量法測定；土壤全氮采用濃硫酸和催化劑消解—AA3 流動分析儀測定；土壤全鉀采用硝酸、氫氟酸和高氯酸消解—火焰型原子吸收儀法測定；土壤全磷采用濃硫酸和高氯酸消煮—AA3 流動分析儀測定；土壤堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定。

1.3.4 根系分泌物的提取與測定 根系分泌物收集采用離位溶液培養(yǎng)法，再用氨基酸自動分析儀日立L8900 測定氨基酸總量；通過高效液相色譜法HPLC檢測根際土壤有機(jī)酸的總量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行初步處理和圖表繪制，應(yīng)用SPSS 25.0 進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，通過Canoco5 進(jìn)行主成分分析、冗余分析和方差分解，利用Origin 9 繪制柱狀圖。

微生物多樣性分析采用Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H）、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)（D） 方法[23]。

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H），計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 化肥有機(jī)肥配施對油菜根際土壤理化性狀的影響

由表1 可知，隨著有機(jī)肥配施比例的增加，土壤有機(jī)碳含量顯著增加；其中全施有機(jī)肥（OF100）土壤有機(jī)碳含量顯著高于其他各處理，較CK、OF25、OF50、OF75 分別增加了55.82%、56.90%、27.57%、30.62%；土壤全氮含量隨有機(jī)肥配施比例增加同樣也顯著增加，其中OF100 處理全氮含量顯著高于其他各處理，為1.47 g/kg；根系分泌氨基酸量隨著有機(jī)肥配施比例的增加也顯著增加，其中OF75 處理氨基酸含量顯著高于其他處理，為8294 μg；同時C/N 的值隨著有機(jī)肥配施比例的增加而增加。土壤全鉀和全磷隨有機(jī)肥配施比例增加多未表現(xiàn)出顯著差異，而土壤堿解氮含量隨著有機(jī)肥配施比例增加呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢；其中OF75、OF100 較CK 顯著降低，分別為176 和177 mg/kg，分別下降了36.47% 和36.3%。

2.2 化肥有機(jī)肥配施對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物組成的影響

油菜根際土壤中，利用光合同化碳的微生物特征性PLFA 量平均占微生物特征性PLFA 總量的2.16%，其中13C-細(xì)菌和13C-真菌特征性PLFA 含量分別占根際總細(xì)菌和總真菌特征性P L F A 含量的1.47% 和4.07%；利用光合同化碳的革蘭氏陽性菌（13C-G+） 和革蘭氏陰性菌（13C-G?） 特征性PLFA 含量平均占根際總G +菌和G ?菌特征性P L FA 含量的2.46% 和1.23%。與CK 相比，OF75、OF100 處理13C-真菌占比顯著降低，OF75 顯著降低了13C-細(xì)菌、13C-G+和13C-G?的特征性PLFA 含量占比，四個有機(jī)肥配施處理均顯著降低了13C-G?的特征性PLFA 占比（圖1）。

隨著有機(jī)肥比例從CK 處理增加到OF100 處理，根際利用光合同化碳的細(xì)菌和真菌，革蘭氏陽性菌（G+） 和革蘭氏陰性菌G?以及微生物PLFA 總量均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢（圖2）。與CK 相比，OF75、OF100 處理根際土壤利用光合同化碳G?菌分別增加了36.41% 和62.03%，總微生物1 3C-PLFA量，以及細(xì)菌、真菌和G+菌13C-PLFA 量與CK 沒有顯著差異。隨著有機(jī)肥比例的增加（從OF25 處理到OF100 處理），細(xì)菌/真菌值增加，而G+菌/ G?菌值減少。與CK 相比，OF75 和OF100 細(xì)菌/真菌值分別增加了59.21% 和59.31%，G+菌/G?菌值分別減少了35.07% 和34.45% （表2）。

主成分分析（PCA） 表明，與油菜根際總微生物群落分布一致，化肥有機(jī)肥配施顯著影響油菜根際利用光合同化碳微生物群落結(jié)構(gòu)分布，主成分1和主成分2 中的主要因素分別為i17：0、18：1w9c，和14：00、18：1w9c，它們分別解釋了71.85% 和16.91% 群落分布變異（圖3）。不同施肥處理油菜根際利用光合同化碳的微生物群落的分布出現(xiàn)了明顯的空間距離，OF25 和OF100 處理相距較近，CK、OF50、OF75 相距較近，表明OF25 和OF100 的微生物群落組成接近，CK、OF50、OF75 處理的微生物結(jié)構(gòu)接近，與OF25、OF100 的差異較大。

2.3 不同施肥處理對油菜根際土壤利用光合同化＼碳微生物多樣性的影響

由圖4 可以看出，OF25 處理利用光合同化碳的微生物多樣性高于總微生物多樣性，CK、OF50、OF75 處理相似，OF100 處理二者之間無明顯差異。與對照相比，OF25 處理顯著降低了油菜根際土壤總微生物多樣性與利用光合同化碳微生物多樣性，OF100 處理顯著提高了總微生物多樣性，OF50、OF75 處理對總微生物和利用光合同化碳微生物多樣性無顯著影響。

由圖5 可見，真菌和G+菌是利用光合同化碳的主要群落，與總微生物群落相比，利用光合同化碳真菌和G+菌相對豐度較高。但隨著有機(jī)肥替代化肥比例增加，細(xì)菌相對豐度增加，真菌相對豐度減少；G?菌相對豐度增加，G+菌相對豐度減少。

2.4 影響油菜根際土壤利用光合同化碳微生物群落分布和多樣性的環(huán)境因子

冗余分析（RDA） 表明土壤有機(jī)碳、全氮、氨基酸總量、堿解氮是影響油菜根際土壤總微生物群落和利用光合同化碳微生物群落分布的關(guān)鍵環(huán)境因子（圖6）。總微生物群落RDA1 軸的解釋度為63.72%，RDA2 軸解釋度為14.41%，共同解釋了微生物群落變化的78.13%；利用光合同化碳微生物群落RDA1軸的解釋度為66.95%，RDA2 軸解釋度為15.53%，共同解釋了微生物群落變化的82.48%。

相關(guān)性分析結(jié)果見表3，解釋比例和貢獻(xiàn)率越高，說明該因素與土壤微生物多樣性相關(guān)性越顯著。油菜根際土壤總微生物和利用光合同化碳的微生物多樣性Shannon-Wiener 指數(shù)與全氮和有機(jī)碳均極顯著正相關(guān)，氨基酸總量僅與利用光合同化碳的微生物多樣性顯著正相關(guān)。

3 討論

3.1 根際土壤微生物群落對外來碳源的利用

本研究發(fā)現(xiàn)，真菌和G+菌是油菜根際利用光合沉積碳的主要微生物群落。Treonis 等[24]在野外條件得出了一致的結(jié)論，即植物光合同化物主要是被革蘭氏陽性菌和真菌利用。而Tian 等[25]的研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌和真菌是在非淹水和干濕交替狀態(tài)下利用水稻光合同化碳的主要微生物群落。Johnson等[26]利用13C-CO2 標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)叢枝真菌能在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)化利用草地植物光合同化碳，這可能是因?yàn)檎婢軌蚶镁z吸收到更多的光合碳源。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著有機(jī)肥替代化肥比例的增加，細(xì)菌/真菌值增加，而G+菌/ G?菌值減少，說明細(xì)菌，尤其是G?菌更偏好有機(jī)肥含量高的土壤，這與G?菌更易在富營養(yǎng)的環(huán)境中生長特性相一致[27?28]。與細(xì)菌相比，真菌對環(huán)境的耐受力更強(qiáng)[16]，類似地，G+菌也比G?菌更容易在寡營養(yǎng)的環(huán)境生長，有趣的是，本研究證實(shí)真菌和G+菌是利用光合沉積碳的主要微生物群落。本研究首次發(fā)現(xiàn)與外源直接投入有機(jī)碳相比，寡營養(yǎng)生長策略微生物更偏好利用通過光合沉積碳。

3.2 有機(jī)肥替代化肥對根際微生物群落利用光合同化碳的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著有機(jī)肥替代化肥比例增加，油菜根際土壤總微生物以及利用光合同化碳微生物的特征性PLFA 含量和多樣性呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，當(dāng)化肥有機(jī)肥配施比例達(dá)到1∶3，油菜根際土壤微生物特征性PLFA 含量和多樣性明顯優(yōu)于單施化肥。王逗等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，化肥有機(jī)肥1∶3 配比為油菜生長提供最均衡養(yǎng)分。土壤全氮和有機(jī)碳含量是影響油菜根際土壤微生物多樣性的主要環(huán)境因子，隨著有機(jī)肥配比增加，土壤有機(jī)碳含量增加，一方面是由于有機(jī)肥本身含有大量有機(jī)碳直接外源添加進(jìn)入土壤[29]，另一方面有機(jī)肥促進(jìn)了根際土壤微生物的繁殖生長，有利于外源添加碳轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)碳，最終提高土壤有機(jī)碳含量[30?31]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)化肥有機(jī)肥1∶3 配比能夠?yàn)楦H土壤微生物提供更友好的微生態(tài)環(huán)境，可以作為油菜綠色施肥管理推薦方案。

本研究還發(fā)現(xiàn)，根系分泌氨基酸量顯著影響油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物群落組成，氨基酸量與油菜根際土壤利用光合同化碳微生物多樣性指數(shù)顯著正相關(guān)。Wang 等[ 3 2 ]和Ge 等[ 3 3 ]研究發(fā)現(xiàn)，氮肥施用增加的根部光合碳沉積量是促使PLFA的13C 標(biāo)記量增加的主因[34]。氨基酸作為重要的營養(yǎng)來源，促進(jìn)土壤微生物生長與繁殖[35]，而微生物的代謝產(chǎn)物又反作用于植物根系對氨基酸的分泌[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，除了土壤有機(jī)碳、全氮、堿解氮等理化因子，根系分泌氨基酸量也顯著影響油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物群落組成和多樣性，甚至發(fā)揮更重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)處理的聚集情況并不如我們一開始所想的那樣，隨著有機(jī)肥的增加而有規(guī)律的聚集在一起，而是OF75、CK 與OF50 聚集在一起，OF25 和OF100 分別聚類。雷菲等[ 3 7 ]的研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，部分細(xì)菌的相對豐度隨著有機(jī)肥用量的增加呈先上升后下降的趨勢。我們的研究也發(fā)現(xiàn)隨著有機(jī)肥的增加，部分真菌的相對豐度先上升再下降，這可能與其具有降解土壤中可溶性有機(jī)底物的功能有關(guān)[38?39]，有機(jī)肥用量增加會創(chuàng)造良好的土壤環(huán)境[40?41]，使其更好的進(jìn)行生長與繁殖[42]，但當(dāng)有機(jī)肥施用比例超過80% 時，土壤中堿解氮含量減少，可提供其快速繁殖所需的氮源減少，因此相對豐度有輕微的下降趨勢[ 4 3 ]。這可能也就解釋了為什么OF100 并沒有像我們所預(yù)料的那樣與其他處理有規(guī)律的聚集在一起。

4 結(jié)論

有機(jī)肥替代化肥比例超過75% 后，有機(jī)肥對油菜根際土壤中利用光合同化碳的微生物PLFA 量的影響顯著不同于低有機(jī)肥替代比例，高有機(jī)肥替代比例顯著增加了利用光合碳微生物PLFA 量，但減少了其占總微生物量的比例。油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物以真菌和G+細(xì)菌為主，有機(jī)肥施用促進(jìn)根系氨基酸分泌，進(jìn)而增加了利用光合同化碳的微生物多樣性。總而言之，化肥有機(jī)肥1∶3 配比作為油菜綠色施肥管理推薦方案，能夠?yàn)楦H土壤微生物提供更友好的微生態(tài)環(huán)境。