黃土區農田土壤細菌和真菌群落對長期施氮的響應特征

關鍵詞： 施氮量； 全氮； 碳氮比； 酶活性； 微生物群落結構

微生物是陸地生態功能的重要影響因素，在調控土壤養分的“源”和“庫”過程中發揮著重要作用[ 1 ? 3 ]。不同土壤微生物類群能感知土壤性質的改變，從而做出差異化的響應[4?5]。氮肥的持續施用雖然提高了土地生產力，但也顯著改變微生物棲息的微環境[6]。近年來，雖然我國實行了氮肥增效減施行動，但2022 年中國氮肥施用量仍高達1654.1 萬t[7]。因此，探究施氮條件下微生物群落的變化有助于農田土壤培肥和健康措施的制定。

細菌和真菌可以調控土壤生物化學過程和生態系統功能，但氮肥對細菌和真菌群落的影響尚未明確。有報道指出，細菌和真菌多樣性均隨氮肥施用量增加呈降低趨勢[8]，且施氮量越高多樣性的降低幅度越大[9]。也有部分研究發現短期施氮降低細菌多樣性，對真菌多樣性無顯著影響[10]，但也存在施氮顯著增加細菌和真菌多樣性的結論[11]。此外也有學者發現施氮對細菌和真菌多樣性均無顯著影響[12]。對于細菌和真菌群落組成而言，施氮增加肉座菌目、被孢霉目等真菌及放線菌門、綠彎菌門等細菌的豐度，降低變形菌門、酸桿菌門和厚壁菌門的豐度[13]，但也有研究指出施氮降低放線菌門、酸桿菌門等細菌豐度，增加厚壁菌門和擬桿菌門等細菌豐度[14]，另有部分關于施氮在門水平對細菌和真菌群落組成無顯著影響的報道[12]。此外，施氮對細菌和真菌各類群間關系的影響研究，也存在降低共現網絡的復雜性[10]與提高共現網絡的復雜性[15]的不一致報道。

黃土高原水土流失嚴重，土壤肥力匱乏，大量氮肥投入土壤中以保證糧食產量[16]。但是，黃土區細菌和真菌的群落結構和功能對長期施氮的響應并不清楚。本研究基于長期氮肥管理試驗，測定不同施氮量（0、45、90、135、180 kg/hm2） 的細菌和真菌特性、土壤微生物活性（7—9 月休閑季土壤呼吸量）、碳氮養分含量等理化性質；分析土壤細菌和真菌群落結構對施氮的響應特征；辨析土壤理化性質與微生物特性、碳代謝功能之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究區及長期定位試驗概況

陜西長武農田生態系統國家野外科學觀測研究站長期氮肥管理試驗于1984 年建立。該試驗地點位于黃土高原溝壑區長武縣十里鋪村（107°40′E，35°12′N，海拔1200 m），屬于典型旱作雨養農業區，無灌溉條件；1 9 5 7—2 0 1 8 年年均降水量為580 mm，7—9 月份降水量占年降水量的49.0% 左右；平均氣溫為9.1℃，年日照時數2230 h，日照率為51.0%，年輻射總量為484 kJ/cm2。土壤為黏壤質黑壚土，1984 年布設試驗時土壤有機碳6.5 g/kg，全氮0.6 g/kg，pH 8.4，CaCO3 含量10.5%，黏粒（lt;0.002 mm） 含量24.0%。試驗共設24 個肥料處理，每個處理3 次重復，共72 個小區，區組隨機排列，小區長6 m，寬4 m，小區間距0.3 m，區組間距0.8 m，四周路寬1 m。種植制度為冬小麥（Triticumaestivum L.） 連作，所用化肥為尿素、重過磷酸鈣，不施用鉀肥，氮磷肥全部在播種前撒施地表后耕翻入土，后期不再追肥。

1.2 土壤樣品采集

于2022 年7 月小麥收獲后，選取同一施磷水平（P 39 kg/hm2） 下5 個氮肥施用量處理：N 0、45、90、135、180 kg/hm2 （N0、N45、N90、N135、N180）小區，采集0—20 cm 土層樣品。每個小區以“S”形采樣法采集5 鉆土樣，制成混合樣品，共計15 個樣品。新鮮土樣通過2 mm 篩后，剔除根系殘體，用冷藏箱帶回實驗室：一部分樣品在?80℃ 保存供土壤微生物群落結構測定；另一部分樣品4℃ 保存供微生物量碳、土壤酶活性、硝態氮（NO3?-N） 等理化性質的測定；剩余樣品在室溫下風干，用于土壤pH、有機碳、氮素含量等理化性質的測定。根系在小麥成熟后，利用根鉆在行間和行上各采集三鉆，將根系揀出，沖洗干凈，70℃～80℃ 烘干至質量恒定，再分別稱量和記錄[17]。

1.3 土壤理化性狀分析

土壤有機碳（soil organic carbon，SOC） 測定利用H2SO4–K2CrO7 外加熱法[18]，全氮（total nitrogen，TN） 測定利用凱氏定氮法[19]，土壤微生物量碳（soilmicrobial biomass carbon，SMBC） 采用氯仿熏蒸―萃取法[20]，土壤NO3?-N 用2 mol/L KCl 溶液浸提鮮土樣后，用流動分析儀測定（SAN++，Skalar，Holland）。土壤微生物量碳的測定方法中未用氯仿熏蒸步驟測定的碳含量即為土壤可溶性有機碳（dissolved organic carbon，DOC）。土壤酶活性采用微孔板熒光法測定[21]。土壤水分采用恒溫箱烘干法，有機質芳香程度（SUV254） 采用紫外?可見分光光度計測定254 nm 處的紫外吸光度[22]。

土壤微生物活性為7—9 月土壤呼吸速率的平均值。7 月到9 月為休閑季節，土壤呼吸值為微生物呼吸，可表征微生物活性[23]，選擇晴好天氣在9：00—11：00 利用土壤碳通量測量系統LI-8100 （LI-COR，Lincoln，NE，USA） 測定土壤呼吸速率，大約每10 天測定1 次。

1.4 DNA 提取和高通量測序

采用Fast DNA SPIN Kit for soil 試劑盒和MPFastPrep-24 核酸提取儀提取土壤中的DNA，使用帶B a r c o d e 的特異引物進行P C R 擴增： 3 3 8 F（5′?ACTCCTACGGGAGGCAGCAG?3′） 和806R（5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3′） 擴增細菌16S rRNA 基因V3～V4 區域，ITS1 （5′?ACTCCTACGGGAGGCAGCAG?3′） 和ITS2 （5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3′） 擴增真菌ITS 基因區域[ 2 4 ]。純化擴增產物并制備序列文庫，然后用Qubit@2.0 Fluorometer （Thermo Scientific） 和AgilentBioanalyzer 2100 系統檢測文庫質量。在北京諾禾致源科技股份有限公司利用Illumina HiSeq2500PE250 平臺進行高通量測序。將雙末端序列根據Barcode 序列和PCR 擴增引物標簽拆分出各個樣品的數據，將每個樣品的序列借助FLASH （V1.2.7，http：//ccbjhu.edu/software/FLASH） 進行拼接，然后根據QⅡME[25]質控流程進行質量控制。根據UCHIME算法[ 2 6 ]去除嵌合體序列，然后將剩余的序列利用UParse 軟件[27]以97% 的相似度聚類劃分OTU。對于OTU 的每一個代表序列，使用RDP Classifier 算法與Green Gene 數據庫以80% 的置信閾值進行物種注釋分析。最后以數據量最少的樣品為標準對得到的OTU 豐度數據進行均一化處理，后續的alpha 和beta 多樣性分析均基于均一化處理后的數據。此外，細菌的功能預測是通過PICRUSt 生物信息軟件包實現，根據16S 測序數據進行基于KEGG 數據庫的功能預測[28]。

1.5 數據分析方法

采用SPSS 2.0 軟件對土壤性狀和微生物群落α-、β-多樣性指數進行單因素方差分析（ANOVA），并進行F 顯著性檢驗。采用R （4.3.0） 對微生物數據進行整理，通過ggplot2 包繪制門、綱水平排名前10 的細菌和真菌群落相對豐度圖和土壤微生物群落豐富度（Chao1 指數） 及多樣性（Shannon 指數）、功能結構，利用“vegan”包繪制主坐標分析圖（PCoA），用“corrplot”數據包繪制微生物群落結構與土壤理化性狀的相關關系圖。

2 結果與分析

2.1 施氮對土壤生物理化性質的影響

施氮顯著影響土壤生物理化性質（表1）。土壤有機碳、可溶性有機碳、全氮和NO3?-N 隨施氮量的增加呈上升趨勢；土壤碳氮比（C/N） 隨施氮量增加而降低。與N0 處理相比，N180 處理土壤有機碳和可溶性有機碳的上升幅度最高，分別提高13.0% （6.50 νs.7.35 g/kg） 和55.0% （22.43 νs. 34.87 mg/kg）；而N180 處理顯著降低C/N （13.0%）。N45、N90 與N135 處理下微生物量碳較N0 處理（112.96 mg/kg） 分別升高79.0% （202.58 mg/kg）、73.0% （195.65 mg/kg）和107.0% （234.00 mg/kg）。土壤微生物活性（土壤呼吸量） 隨著施氮量的增加而增加，與N0 相比，N45、N135、N90、N180 處理分別提高18.0%、29.1%、35.4%、47.6%；施氮使木糖苷酶活性提高了13.5%～39.3%，纖維二糖水解酶活性提高了50.3%～126.8%（圖1）。施氮使土壤pH 顯著降低。

2.2 施氮對細菌和真菌群落結構及功能的影響

氮肥施用量影響細菌群落的豐富度和多樣性，對真菌群落無顯著影響（圖2）。N45 和N180 處理顯著降低細菌豐富度（Chao1），分別降低4.0% 和12.3%。細菌多樣性（Shannon） 隨著施氮量的增加而降低，降低幅度為1.6%～1.8%，其中N180 處理的降幅達到顯著性水平。對于群落結構而言，長期施氮改變細菌群落結構，且施氮量之間存在顯著差異，但真菌群落結構在各施氮量間無顯著差異（圖3）。與N0 處理相比，施氮量越高對細菌的影響越大（圖4、圖5），N180 處理顯著降低變形菌門（Proteobacteria，2.4%～16.4%），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，2.1%～26.3%），擬桿菌門（Bacteroidetes，24.1%～50.0%），增加放線菌門（Actinobacteria，10.4%～34.7%） 和酸桿菌門（Acidobacteria，37.8%～54.1%）及綠灣菌門（Chloroflexi，14.3%～28.6%） 的相對豐度。與細菌相比，真菌受氮肥影響較弱，不同施氮量之間對真菌群落結構的影響差異不大。施氮顯著提高子囊菌門（Ascomycota，8.3%～73.8%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，29.4%～58.8%）、傘菌綱（Agaricomycetes，44.4%～88.9%） 和銀耳綱（Tremellomycetes，18.2%～45.5%） 的相對豐度。此外，施氮也顯著影響了參與碳氮循環過程的相關功能菌的豐度?；墚愷B、好氧化能異養等功能菌豐度占據總功能菌豐度的30% 左右，且在不同施氮量處理中相對豐度變化存在差異，其中硝化作用菌豐度（14.3%～39.6%）、好氧氨氧化功能菌豐度（25.1%～48.2%） 和芳香烴降解功能菌豐度隨著施氮量的增加而升高（圖6）。

3 討論

施氮對細菌和真菌多樣性的影響存在差異。長期施氮顯著降低了細菌的多樣性和豐富度，但施氮條件下真菌的多樣性和豐富度并無顯著變化（圖2）。其原因可能與細菌比真菌具有更強的生境關聯性有關，而真菌具有更強的抵抗外界干擾的能力[29]。本研究中，施氮使土壤NO3?-N 含量從1.38 mg/kg 增加到1.78～2.25 mg/kg，C/N 值從8.90 降低到8.64～7.74 （表1），刺激了特定微生物類群大量繁殖，從而縮小其他物種的生存空間[30]，這種競爭排斥作用降低了細菌多樣性。其次，施氮促進植物生長，根系生物量從1.73 t/hm2 提高到2.32～2.98 t/hm2 （表1），土壤水分含量從39.40% 降低到38.45%～36.72%，降低了土壤中可利用底物的運移，而真菌具有更寬的碳/氮養分化學計量適應范圍和水分適應性[31?32]。上述土壤理化性狀變化對真菌無顯著影響。Xing 等[33]研究發現，施氮不僅提高細菌多樣性，而且也顯著增加真菌的多樣性。這可能與土壤養分的背景值存在較大差異有關，Xing 等[33]研究中的供試土壤有機碳（13.83 g/kg） 和全氮（1.98 g/kg） 顯著高于本研究的相應值（土壤有機碳6.50 g/kg，全氮0.6 g/kg），因此施用氮肥后沒有造成養分競爭引起的多樣性降低。

施氮肥對細菌和真菌群落結構的影響也存在差異。細菌的群落結構不僅因施氮而變化，并且還會因施氮量而改變，但真菌群落并不因施氮而變化（圖3～圖5）。細菌和真菌群落組成變化的差異源于對土壤環境變化的敏感性不同。已有土壤性質變化對細菌影響更大的報道[34]，證實了本研究中細菌群落發生顯著變化而真菌群落無明顯變化的結論。細菌群落的變形菌門相對豐度隨著土壤可溶性有機碳升高而降低，而放線菌門豐度隨著土壤有機碳、可溶性有機碳和NO3?-N 的升高而升高。施氮條件下可溶性有機碳含量的大幅升高促進了放線菌、厚壁菌和子囊菌等主要利用易分解有機碳組分的微生物的生長[35?36]。但真菌因對土壤環境變化不敏感，所以群落組成的變化（子囊菌升高，擔子菌降低） 與土壤理化性質間的關系不顯著（圖7）。

施氮顯著改善了木糖苷酶和纖維二糖水解酶等與碳氮循環過程相關的胞外酶活性。本研究中木糖苷酶和纖維二糖水解酶分別升高13.5%～39.3% 和50.3%～126.8%，這與施氮改變細菌和真菌群落結構有關。施氮增加了酸桿菌、放線菌和子囊菌等具有編碼纖維素酶、半纖維素酶和木糖苷酶功能基因的微生物類群豐度[37]；隨之分泌更多木糖苷酶和纖維二糖水解酶，從而提高了土壤微生物中與碳循環相關的功能菌豐度（芳香烴降解）。但是，也有報道發現，施氮降低了土壤微生物分解木質素的功能菌豐度，這可能與施氮降低了傘菌目等含木質素分解的基因的微生物類群豐度有關[38]。在本研究中施氮提高了含有木質素水解酶基因的變形菌、擬桿菌、子囊菌等微生物類群豐度。

本研究明確了不同施氮量下土壤微生物的活性、群落結構組成和功能的變化，從微生物的角度解釋了氮肥用量對黃土區土壤質量的影響。未來的研究將從功能基因變化以及真菌與細菌之間的相互作用方面，進一步解釋不同施氮量引起的微生物群落結構變化的原因。

4 結論

在黃土高原地區，長期施氮顯著提高了土壤微生物量和活性，改變了土壤細菌和真菌群落多樣性和結構組成，細菌較真菌對施氮的響應更敏感。細菌多樣性和豐富度隨施氮量增加而顯著降低，群落結構也因施氮發生改變，而真菌豐富度、多樣性對施氮量無響應，真菌群落結構在不同施氮量間無顯著差異。細菌群落組成的變化與土壤有機碳、可溶性有機碳和NO3?-N 含量呈顯著正相關，與全氮含量和C/N 呈顯著負相關。此外，氮肥施用增加了土壤中與碳循環相關的功能菌豐度，促進了木糖苷酶和纖維二糖水解酶的分泌。