胡黃連苷Ⅱ調節cAMP/PKA信號軸對脊髓損傷大鼠神經功能恢復的影響

范雁東 王佳明 馬木提江·木爾提扎 羅坤

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是指交通事故、戰時、自然災害等造成的脊柱骨折,合并脊髓和神經根損傷,是一種破壞性的神經和病理狀態,可導致主要的運動、感覺和自主神經功能障礙[1]。全球范圍內SCI的發病率為10.4～83.0例/百萬/年,是社會發病負擔的重要來源。對于急性SCI的管理策略包括早期手術減壓和固定、使用血管加壓藥物增加平均動脈血壓、使用皮質類固醇等,最近使用去甲腎上腺素作為神經重癥監護策略,但對神經保護和再生的作用有限[2],因此,需要探索新型治療制劑。有研究發現,胡黃連苷Ⅱ(picroside Ⅱ,PⅡ)是從胡黃連提取的環烯醚萜類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡活性,能夠抑制脊髓反應性星形膠質細胞介導的神經炎癥,減輕慢性縮窄性損傷誘導的大鼠神經性疼痛[3],但對SCI神經功能的研究較少。此外,激活環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號可以改善SCI后炎癥[4],PⅡ是否能通過調節cAMP/PKA通路改善SCI神經功能尚不清楚,因此,本研究借助SCI大鼠模型,探究PⅡ對其神經功能的影響及相關cAMP/PKA通路的調節作用,以期為臨床治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠(220～240 g),購自河南省實驗動物中心[SCXK(豫)-2022-0001]。飼養環境為12 h/12 h光暗循環,溫度(25±1)℃,濕度(50±5)%,實驗操作遵守相關規定。

1.2 試劑 PⅡ(純度≥98%,G0174),購自美國Merck公司;PKA抑制劑H-89(HY-15979),購自美國MCE公司;勞克堅牢藍(LuxolFastBlue, LFB)染液,購自南京信帆生物技術有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、cAMP ELISA試劑盒,購自北京四正柏有限公司;一抗磷酸化(p)-PKA、PKA、p-環磷酸腺苷反應成分結合蛋白(CREB)、CREB,購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 造模與分組:①造模:大鼠吸入乙醚至完全麻醉后,俯位固定,背部剃毛并消毒,計數肋骨以確定(第10胸椎)T10水平,以T10水平為中心作3 cm長縱向切口,剝離椎旁肌,去除棘突和椎板,暴露(第9胸椎)T9～T10節段脊髓;在3 cm高度使10 g NYU打擊器自由下落擊打T9～T10節段脊髓,隨后脊髓充血、水腫,大鼠后肢和尾部抽搐,表示SCI大鼠模型建立成功[5]。為預防感染,建模大鼠傷口縫合后連續3 d皮下注射105U·kg-1·d-1青霉素G。②分組:大鼠適應1周,將其分為正常組(CT組)、SCI模型組(SCI組)、PⅡ低劑量組(PⅡ L組)、PⅡ高劑量組(PⅡ H組)和PⅡ高劑量組+H-89組(PⅡ H+H-89組),每組18只。除CT組外的所有大鼠按上述方法建立SCI模型并注射青霉素G,CT組大鼠僅暴露T9～T10節段脊髓不損傷脊髓;PⅡ溶于1×PBS獲得2 mg/mL PⅡ溶液,PⅡ L組、PⅡ H組分別腹腔注射5 mg·kg-1·d-1、20 mg·kg-1·d-1PⅡ[3];PⅡ H+H-89組腹腔注射20 mg·kg-1·d-1PⅡ+5 mg·kg-1·d-1H-89[6];CT組和SCI組大鼠腹腔注射適量0.9%氯化鈉溶液,給藥時間從造模后第3天開始持續2周。

1.3.2 運動功能評分:使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分評價大鼠的運動功能恢復情況[7]。觀察大鼠行走時臀、膝、踝關節及軀干運動及協調情況,以0～21分做等級評估,0代表完全不能運動,21代表正常運動,每增加1分代表運動功能逐漸恢復,分別在給藥期0、7、14 d做BBB評分。

1.3.3 脊髓組織病理學特征檢測:給藥結束后每組選取6只大鼠,吸入乙醚麻醉,打開大鼠胸腔暴露心臟,剪開右心耳,在心尖處注入4℃ PBS至內臟變白,將PBS換成4%多聚甲醛,注射至組織變硬,分離脊柱,去除肌肉及椎骨,以損傷部位為中心取1 cm長的脊髓組織,固定于4%多聚甲醛中12 h,脫水,石蠟包埋并做橫向切片,HE染液染色,二甲苯做透明處理,封片,使用低、高倍顯微鏡觀察組織病理學特征。

1.3.4 脫髓鞘情況檢測:取1.3.3脊髓組織石蠟切片行LFB染色。切片用蒸餾水清洗,加入0.1%LFB溶液60℃下密封浸染8 h;蒸餾水清洗,加入95%乙醇分色;0.05%碳酸鋰水溶液分色10 s;再加入70%乙醇繼續分色,直至顯微鏡下觀察灰、白質區分清晰為止;滴加0.25%焦油紫與冰醋酸染液復染10 min,再次使用70%乙醇將復染顏色分至細胞核及尼氏體呈紅色;使用濾紙沾盡多余液體,加入正丁醇脫水2次,每次脫水5 min;二甲苯透明,封片,顯微鏡下觀察,髓鞘呈鮮藍色,核呈深藍色,統計LFB陽性組織比例。

1.3.5 星形膠質細胞、小膠質細胞活化增生情況檢測:每組選擇6只大鼠,麻醉,打開胸腔,使用鈍器分離出損傷部位處1 cm長的脊髓組織,PBS清洗,立即放入4%多聚甲醛過夜,乙醇梯度脫水,包埋劑包埋,切制5 μm切片。將切片置于抗原修復液內煮沸3次修復抗原,冷卻,使用胎牛血清封閉30 min,膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、離子鈣結合適配器分子-1(IBA-1)一抗稀釋液封閉過夜,FITC標記二抗稀釋液孵育1 h,DAPI染液孵育5 min,清洗切片,封片,熒光顯微鏡下觀察視野下GFAP、IBA-1陽性細胞。

1.3.6 MDA、SOD、cAMP含量檢測:將每組剩余6只大鼠麻醉,取損傷處脊髓組織,剪碎、勻漿,一半勻漿液-80℃儲存,剩余勻漿液離心取上清,根據ELISA試劑盒操作要求檢測MDA、SOD、cAMP含量。

1.3.7 p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達檢測:取1.3.6勻漿液,定量蛋白濃度,配制PAGE凝膠,點樣,電泳、轉膜后,封閉含樣品PVDF膜,置于p-PKA、PKA、p-CREB、CREB稀釋液中過夜,二抗孵育2 h,加入發光液, Tanon 1600拍照,分析蛋白表達水平。

2 結果

2.1 5組大鼠BBB評分比較 給藥0.7、14 d,與CT組比較,SCI組大鼠BBB評分降低(P<0.05);給藥7.14 d與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組BBB評分劑量依賴性升高(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組BBB評分降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠BBB評分比較 n=18,分,

2.2 5組大鼠脊髓組織病理學特征

2.2.1 低倍鏡:CT組大鼠組織完整;SCI組大鼠組織缺損較嚴重,空腔多見;與SCI組大鼠比較,PⅡ L組、PⅡ H組大鼠的組織損傷情況有所改善,空腔減少;PⅡ H+H-89組大鼠組織缺損,與SCI組大鼠情況類似。見圖1。

圖1 5組大鼠脊髓組織HE染色情況(×100)

2.2.2 高倍鏡:CT組組織及細胞生長狀態良好;SCI組損傷局部出現大量炎性細胞浸潤;與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組炎性細胞數量減少;與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組炎性細胞浸潤增加。見圖2。

圖2 5組大鼠脊髓組織HE染色情況(×400)

2.3 5組大鼠脊髓組織脫髓鞘比較

2.3.1 LFB染色結果:與CT組比較,SCI組大鼠脫髓鞘增加,LFB染色陽性比例顯著減少(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組脫髓鞘呈劑量依賴性降低,LFB染色陽性比例顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組脫髓鞘增加,LFB染色陽性比例顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠脊髓組織LFB染色陽性比較 n=6,%,

2.3.2 高倍鏡:CT組髓鞘排列緊密、完整;SCI組可見大量髓鞘空泡,呈嚴重的脫髓鞘現象;PⅡ L組、PⅡ H組較SCI組空泡顯著減少,排列更加緊密;PⅡ H+H-89組呈現脫髓鞘現象。見圖3、4。

圖3 5組大鼠脊髓組織LFB染色(×100)

圖4 5組大鼠脊髓組織LFB染色(×400)

2.4 5組大鼠脊髓組織星形膠質細胞、小膠質細胞活化增生比較 與CT組比較,SCI組大鼠的脊髓組織GFAP陽性細胞數、IBA-1陽性細胞數增加,差異均有統計學意義(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組GFAP陽性細胞數、IBA-1陽性細胞數呈劑量依賴性降低,差異有統計學意義(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組GFAP陽性細胞數、IBA-1陽性細胞數增加,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖5、6。

圖5 5組大鼠脊髓組織星形膠質細胞免疫熒光染色(×200)

圖6 5組大鼠脊髓組織小膠質細胞免疫熒光染色(×200)

表3 5組大鼠脊髓組織GFAP、IBA-1陽性細胞數比較 n=6,個,

2.5 5組大鼠脊髓組織MDA、SOD、cAMP含量比較 與CT組比較,SCI組MDA含量增加,SOD、cAMP含量降低(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組MDA含量減少,SOD、cAMP含量增加,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組MDA含量增加,SOD、cAMP含量降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠脊髓組織MDA、SOD、cAMP含量比較 n=6,

2.6 5組大鼠脊髓組織p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達水平比較 與CT組比較,SCI組p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平降低(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組p-PKA/PKA、p-CREB/ CREB蛋白表達水平呈劑量依賴性增加(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組p-PKA/PKA、p-CREB/

CREB蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖7,表5。

圖7 5組大鼠脊髓組織蛋白表達水平;A CT組;B SCI組;C PⅡ L組;D PⅡ H組;E PⅡ H+H-89組

表5 5組大鼠脊髓組織蛋白表達水平比較 n=6,

3 討論

SCI是一種危及生命的神經系統疾病,男性發病率更高,除了造成醫療相關經濟負擔外,尤其對截肢、癱瘓患者腸道、性功能、心理障礙的影響也是毀滅性的[8],因此,亟須開發治療SCI的新策略。PⅡ基于其抗炎、抗氧化、抗凋亡特性,已經被用于預防和治療器質性缺血/再灌注損傷、炎癥、肝損傷、癌癥轉移及血管生成[9]。本研究主要探究PⅡ對SCI大鼠神經功能恢復的影響。

SCI分為原發性損傷和繼發性損傷,原發性損傷由機械損傷、牽引力、擠壓等引起脊髓通道血腫、缺血性梗死等;繼發性損傷指在SCI數小時或數天后,由于缺血灌注受損導致的出血、脫髓鞘、水腫和空腔形成,并伴有軸突和神經元壞死及神經組織的一系列病理變化,進一步增加梗死[10]。本研究中,SCI模型大鼠BBB評分降低,受損脊髓組織缺損嚴重,空腔多,出現大量炎性細胞浸潤且髓鞘減少,說明模型構建成功;PⅡ干預可以升高SCI模型大鼠BBB評分和髓鞘數量,組織損傷情況有所改善,空腔及炎性細胞浸潤減少,說明PⅡ可以幫助SCI大鼠恢復運動功能,減少損傷、炎性反應及脫髓鞘。

SCI繼發性損傷后,神經膠質細胞與外周免疫細胞一同對具有異質修復和病理特性的損傷產生強烈的炎性反應,并成為SCI治療修飾的目標[11]。星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的神經膠質細胞,對中樞神經系統生理學至關重要,并在維持穩態、突觸可塑性發展和神經保護方面發揮重要作用,星形膠質細胞在SCI、慢性疼痛、退行性疾病、神經腫瘤及其他神經系統疾病中通過反應性增生發揮不利影響[12]。SCI引起的免疫反應由背角和腹角的小膠質細胞激活主導,揭示小膠質細胞激活/增生與運動功能神經元和感覺傳入神經受損有關[13]。GFAP和IBA-1分別是星形膠質細胞和小膠質細胞的標志物,研究發現SCI大鼠受損周圍脊髓組織GFAP和IBA-1表達升高,代表星形膠質細胞和小膠質細胞活化增生,從而加劇繼發性損傷[5,14]。本研究與之一致,SCI大鼠受損脊髓組織GFAP和IBA-1表達增加,這種異常變化可以被PⅡ抑制,提示PⅡ可有效抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的增生,為突觸再生創造有益條件,減少神經炎性反應。

cAMP是維持細胞代謝和生理功能的重要物質,在G蛋白結合-耦聯受體聯合作用下激活腺苷酸環化酶(ACs),促進釋放[15]。PKA是cAMP的主要靶點,cAMP可以結合PKA并誘導PKA磷酸化,繼而促進CREB磷酸化并啟動轉錄,形成cAMP/PKA/CREB信號通路控制細胞生長過程[16]。激活cAMP/PKA/CREB信號可以抑制神經元凋亡,改善神經細胞營養和能量不足,緩解SCI[17]。本研究提示,SCI大鼠脊髓組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達減少,說明cAMP/PKA信號軸抑制;PⅡ干預可以增加SCI大鼠cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB的表達,其對神經功能的恢復作用可能與上調cAMP/PKA信號軸有關。使用cAMP/PKA抑制劑H-89聯合PⅡ干預SCI大鼠,其完全逆轉PⅡ的治療作用,驗證了PⅡ對SCI大鼠神經功能的恢復作用與激活cAMP/PKA信號通路有關。此外,我們還檢測了脊髓組織MDA、SOD的含量。MDA和SOD是氧化應激反應中的重要成員,MDA是自由基與脂質作用發生過氧化反應的產物,具有細胞毒性,促進細胞衰老;SOD能夠抵消氧自由基對細胞的損傷,修復受損細胞[18-19]。研究發現,通過減少氧化應激反應可以減少細胞凋亡,改善SCI大鼠的運動功能[20]。本研究中,PⅡ逆轉了SCI大鼠脊髓組織MDA含量增加、SOD含量降低,提高BBB評分,可能也是PⅡ在SCI中的另一個作用機制。

綜上所述,PⅡ可能通過激活cAMP/PKA信號軸促進SCI大鼠神經功能恢復。