基于網絡藥理學及分子對接探究金線蓮降血脂的活性成分及作用機制

趙宏鶴，范方宇

（西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

“網絡靶標相關”的假說是由清華大學李梢教授于1999 年在中國科學技術協會第一次會議上提出。2007 年9 月，李梢教授發表了內容為“網絡靶標研究框架：基于生物網絡的方劑研究框架”的論文[1]。這一框架將傳統的中藥研究與現代的生物網絡技術結合，從整體上探討中藥有效成分、作用機制和藥物之間的聯系，更好地闡述中藥作用機理。同年10 月，英國藥理學專家A L Hopkins[2]也提出了“網絡藥理學”這一概念，其對網絡藥理學的基本觀點是：疾病是一種長期的、動態的、多靶點失衡所致的疾病，而單靶點藥物只能調節單一疾病靶點，不能使疾病的多靶點被有效治療，難以達到治療效果，還可能造成不良毒副作用。相對中藥而言，其理念為：多藥物成分、多靶點、多通路，協作治療，達到整體治療目的。李梢教授指出，網絡藥理學是一門將多個生物學領域相結合，從系統、生物網絡等層面，對藥物與疾病之間的分子關系進行分析，并揭示其作用機理，是一門全局性藥理學研究的新分支。

金線蓮是我國閩浙臺特有的民族中草藥，具有清熱解毒、涼血、潤肺止咳等功效，民間常稱為“金草”“神草”“藥王”等。金線蓮含有豐富的黃酮[3]、多糖[4]、甾體[5]等。近年來研究發現，金線蓮的有效成分[6-7]可治療肝炎、糖尿病、腫瘤等，同時具有降血壓、降血脂的功效[8]，這也是金線蓮作為藥食兩用食材的原因。閩浙臺普遍認為金線蓮具有預防、治療“三高”作用，是一種以調節機體為主的藥膳食材。金線蓮常與土鴨、家兔、鴿子、排骨等一起煲湯，具有清涼、明目、保肝、涼血、滋腎益氣等功效，深受人們喜愛。文獻查閱發現，金線蓮含有的多糖、金線蓮苷、黃酮等物質具有降血脂作用。近年來，以金線蓮作為原料的研究較多，但從網絡藥理學角度針對金線蓮降血脂的研究未見報道。試驗利用金線蓮已知文獻綜述，結合網絡藥理學理論，構建成分-靶點-疾病的網絡作用，分析金線蓮降血脂機制，為開發金線蓮降血脂的保健食品[9]提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 金線蓮化學成分篩選

通過國內期刊、碩博論文數據庫及PubMed、SCI 等數據庫，以金線蓮化學成分為研究對象，篩選金線蓮化學成分。采用Pubchem 數據平臺及化源網，并結合ChemDraw Professional 16.0 軟件，對其化學結構進行繪制。將繪制好的分子結構輸入Swiss ADME 數據庫進行藥物動力學篩選。檢測報告中，以藥代動力學（Pharmacokinetics）、類藥性作為篩選條件（Druglikeness） [選擇“腸胃道吸收為High”及5 個類藥性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中2 個為“Yes”的化學物質] ，滿足以上條件的化學物質作為金線蓮降血脂的有效化學成分。

1.2 金線蓮化學成分篩選及靶點預測

金線蓮化學成分進行分析，并對其作用靶點進行預測。使用SwissTargetPrediction 平臺對金線蓮化學成分進行靶點預測。參數設置：選擇人類（Homo sapiens），并輸入SDF 格式的化學結構，點擊運行，獲取相應的化學成分靶點。

1.3 高血脂靶點的篩選

GeneCards 是一個包含了人類所有已被標注和預測的基因數據庫。該數據庫整合了全球150 多家與人類基因數據相關的網站，是一個綜合性基因數據庫。使用“Hyperlipidemia”作為關鍵詞搜索數據庫，以相關分數（Relevance score） ≥2 為篩選標準，并將其歸類為高脂血癥的靶點。

1.4 金線蓮-高血脂交集靶點基因的獲取

利用Venny2.1.0 在線網站，輸入金線蓮成分靶點及高血脂靶點，繪制金線蓮與高血脂交集靶點韋恩圖。交集靶點即為金線蓮治療高血脂的潛在靶點。

1.5 金線蓮-活性成分-靶點-高血脂網絡圖的繪制

將金線蓮化學成分、成分對應靶點與高血脂交集的靶點匯總后導入Cytoscape3.8.0 軟件，依據這些靶點之間的對應關系，建立“金線蓮-化學成分-交集靶點-高血脂”相互關聯的網絡圖。通過對網絡關系的調整，使藥物-靶點-疾病三者之間的內在聯系更為明確。

1.6 構建蛋白-疾病（PPI） 網絡圖

將金線蓮化學成分與高脂血交集靶點輸入STRING 數據庫，物種設定為人類進行分析。預測結果去除非關聯點，并將相互作用系數設置為0.4，獲得關鍵靶點的互作圖。互作圖再導入Cytoscape3.8.0軟件，以介數中心度數值進行繪制交集靶點互作（PPI） 網絡圖。互作網絡圖可以直觀地了解生物體蛋白工作原理、疾病變化及蛋白間的功能關系，對于分析靶點相互作用具有重要的意義。

1.7 生物通路與功能富集

選定“Homo sapiens”，將交集靶點（成分與疾病交集靶點） 導入DAVID 數據庫，根據GO 功能富集的BP（生物學過程）、CC（細胞組成）、MF（分子功能） 及KEGG-pathway 通路數據，繪制柱狀圖。在KEGG-PATHWAY 數據庫輸入KEGG-pathway 數據中相關性較高的通路名稱，并使用KEGG Mapper工具繪制通路圖并分析。

1.8 分子與疾病靶點對接

選取與蛋白質相互作用的前6 個靶點，分別輸入PDB 數據庫，下載相應3D 結構圖。篩選出6 個核心靶點對應的金線蓮化學成分，將化學成分輸入Pubchem 數據庫，下載2D 分子結構文件。將分子結構圖錄入MOE 建立小分子數據庫，再將處理好的靶點蛋白與小分子數據庫進行分子對接，對接次數設定為30 次，分子結構設定為10，其余參數默認。

2 結果與分析

2.1 金線蓮化學成分篩選

通過檢索有關文獻，以“金線蓮的化學成分”為關鍵字，獲得128 種有效成分[10-12]。將128 個化學成分分別輸入到Swiss ADME 數據庫，以胃腸道吸收較好、類藥性較好為篩選條件，最終選取了62 個化合物，并將其作為此次研究金線蓮的化學成分。其中金線蓮苷腸胃道吸收較低，但多篇文獻報道其具有降血脂[13]功效，因此也被列為金線蓮活性成分。

金線蓮活性成分篩選見表1。

表1 金線蓮活性成分篩選

2.2 金線蓮活性成分作用靶點的篩選結果

將篩選后的62 個金線蓮化學成分[14-16]輸入到Swiss 靶點預測數據庫，預測靶點。從數據庫預測結果共得到2 469 個靶點，去重后獲得645 個活性成分作用靶點。

2.3 高血脂靶點篩選結果

在GeneCards 數據庫搜索“Hyperlipidemia”關鍵字，設定相關分數（Relevance score≥2），去除重復數據，獲得了315 個與高脂血有關的靶點。

2.4 金線蓮化學成分靶點- 高血脂交集靶點篩選結果

采用在線韋恩圖軟件，對金線蓮和高血脂交集靶點韋恩圖進行分析，結果顯示高血脂有315 個靶點，約占靶點總數的34.3%；金線蓮有645 個靶點，約占靶點總數的70.3%；其中金線蓮- 高血脂交集靶點共有43 個，占全部作用靶標的4.7%。由圖1 可知，金線蓮化學成分[17-19]的作用靶點和高血脂交集靶點韋恩圖表。

圖1 金線蓮化學成分靶點-高血脂靶點Venn 圖

金線蓮化學成分靶點- 高血脂靶點Venn 圖見圖1。

2.5 金線蓮-活性成分-交集靶點-高血脂網絡圖

將金線蓮與高血脂[20]共同交集的43 個靶點及對應的62 種活性成分導入Cytoscape 軟件，并依據介數中心度數值大小繪制網絡圖（見圖2），得到107 個節點，322 個連線。圖2 中JLX 表示金線蓮，圓形代表金線蓮62 種活性成分，平行四邊形代表交集靶點，GXZ 代表高血脂；CF58 亞麻酸、CF1 正十六烷酸、CF15 棕櫚酸、CF4 2- 十二烷酮、CF40 3-O-β-D-葡萄糖基-（1-壬烯-7-醇） 為主要金線蓮治療高血脂主要化學成分。根據介數中心性大小，列出前6 個化學成分。

圖2 金線蓮-成分-靶點-高血脂網絡圖

金線蓮- 成分- 靶點- 高血脂網絡圖見圖2，金線蓮化學成分介數中心性信息見表2。

表2 金線蓮化學成分介數中心性信息

2.6 蛋白質-疾病相互作用（PPI） 和主要作用靶點的繪制

金線蓮-高血脂交集靶點PPI 互作圖（a） 及網絡圖（b） 見圖3，交集靶點介數中心性信息見表3。

表3 交集靶點介數中心性信息

圖3 金線蓮-高血脂交集靶點PPI 互作圖（a） 及網絡圖（b）

利用String 數據庫，制作交集靶點（PPI） 互作圖。下載cys 格式的互作圖，并導入Cytoscape 3.8.0軟件，按照介數中心性數值大小，繪制出靶點蛋白之間的網絡圖。在網絡圖中，圖形越大，表示該靶點越重要；由圖3（b） 可知，從蛋白質相互作用關系圖中，選擇了6 個介數中心度較高的交叉靶點。

2.7 KEGG Pathway 和GO 富集分析

金線蓮-高血脂交集靶點GO 分析見圖4，金線蓮-高血脂交集靶點KEGG 通路富集分析見圖5。

圖4 金線蓮-高血脂交集靶點GO 分析

圖5 金線蓮-高血脂交集靶點KEGG 通路富集分析

利用DAVID 數據庫，導入金線蓮化學成分與高血脂交集靶點。選取OFFICIAL-GENE-SYMBOL，物種選取人類，對其進行分析。分別下載GO-BP、GO-CC、GO-MF、KEGG-PATHWAY 數據，分別得到BP 通路147 條，17 個CC 過程，45 個MF 功能。將GO-BP、GO-CC、GO-MF 數據按降序排列，取前10 條數據進行匯總。將匯總后的數據輸入微生信，進行GO 分析圖繪制（圖4）。從GO 分析圖可以看出，GO 的含量與BP、CC 和MF 均相關，包括RNA聚合酶II 啟動子的轉錄正調控、胞外空間，胞外基質，胞外的外來體，鋅離子結合等都有一定的相關性。將KEGG_PATHWAY 數據按照降序排列，取前10 條數據，通過微生信作圖工具繪制KEGG pathway氣泡圖（圖5）。圖5 中氣泡顏色越深，-LogQ 值越大，相關性越大。金線蓮主要通過Metabolic pathways、Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis -receptor activation、PPAR signaling pathway、Transcriptional misregulation in cancer 發揮降血脂作用。通過KEGG 通路分析，富集在Metabolic pathways 的靶點有15 個，是所有通路中最多的。Metabolic pathways 代謝通路是金線蓮化學成分主要發揮降血脂的通路，而癌癥通路僅次于Metabolic pathways 代謝通路，也是金線蓮主要發揮降血脂作用的通路，從信號圖中可看出金線蓮化學成分是通過作用于多通路、多靶點發揮降血脂的作用。

2.8 金線蓮-高血脂分子對接

交集靶點與金線蓮分子對接信息見表4，金線蓮小分子與靶點蛋白分子對接信息見表5，金線蓮與高血脂靶點最低結合能熱圖見圖6，分子對接圖見圖7。

表4 交集靶點與金線蓮分子對接信息

表5 金線蓮小分子與靶點蛋白分子對接信息

圖6 金線蓮與高血脂靶點最低結合能熱圖

圖7 分子對接圖

從交集靶點PPI 互作圖中，依據介數中心性（Betweenness Centrality） 降序排列，取靠前的6 個靶點作分子對接[21-22]。根據篩選好的6 個靶點蛋白，篩選對應金線蓮化學成分，作為對接小分子。分別將靶點蛋白、小分子做前處理，對接靶點蛋白與對接小分子信息，利用MOE 軟件，進行分子對接。將金線蓮6 個化學成分與疾病6 個靶點蛋白進行分子對接，分子對接結果全部小于0 kcal/mol，可見金線蓮的化學小分子配體能與受體蛋白可自發結合。取對接最低結合能作聚類熱圖，熱圖中橫坐標代表靶點蛋白，縱坐標代表金線蓮活性成分。圖6 中黃色顏色越深，代表分子和靶點結合越好，其中CY3A4 與鄰苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARA 鄰苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARG 蛋白與亞麻酸（Linoelaidic acid）、VEGFA 與亞麻酸（Linoelaidic acid） 最低結合能平均值均在- 6 kcal/mol 以下，說明此4 種化學成分均能與高血脂靶點自由結合，說明配體和受體具有較強的結合活性[23]。選取熱圖中4 個與目標物結合得最好的小分子，進行分子對接，將其與目標物結合的區域進行放大，可以直觀地展示目標物與目標物的結合。由圖7 可知，在鄰苯二甲酸二丁脂中，CY3A4 和ARG130 和SER134之間形成了2 個氫鍵，它們之間的距離為3.19，3.93；在PPARA 鄰苯二甲酸二丁脂中，TYR334 和VAL332 2 個氨基酸殘基之間距離為3.05、3.69，且存在著2 個氫鍵；PPARG 蛋白與亞麻酸上的GLY284 和LYS265 之間形成了2 個氫鍵，它們之間的距離為3.28、3.26；VEGFA 與亞麻酸中THR31 和LEU32 之間存在2 個氫鍵，兩者之間的距離為2.92，2.94。

3 結論

經過研究發現，金線蓮降血脂是通過多種活性成分作用于高血脂多種靶點，如正十六烷酸（正十六烷酸與棕櫚酸互為同分異構體）、2-十二烷酮、亞麻酸、槲皮素-3,4'-二甲醚、山奈酚、槲皮素等化學成分。基于蛋白相互作用網絡圖及GO、KEGG 分析發現，金線蓮降脂網絡中含有多個與高脂血疾病相關的靶蛋白，包括IL-6、PPARA、PPARG、MMP9 等，多個靶蛋白協同調控高脂血癥。PPARA是調控脂肪細胞分化和脂代謝的關鍵因子。激活的PPARA 能夠與RXR 和DNA 上的過氧化酶體反應元件（PPRE） 相結合，從而促使細胞內與脂肪酸氧化有關的各種酶活化，促進細胞內脂肪酸異化，還對血清質有影響的載脂蛋白的表達有一定的調節效果[24]。MMP-9 主要是通過對基底膜進行降解，從而對單核細胞入侵起到了有利的作用，加快了氧化修改低密度脂蛋白的滲透速度，對平滑肌細胞的遷移和增殖起到了促進作用[25]。在KEGG-PATHWAY 通路中，有代謝通路（Metabolic pathways）、癌癥通路（Pathways in cancer）、化學致癌- 受體激活通路（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、過氧化物酶體增殖物激活受體α 通路（PPAR signaling pathway） 等信號通路，經查閱相關文獻發現，這些靶點和通路均與高血脂相關。

通過挖掘數據與分子對接，初步證實了金線蓮降血脂是利用多成分、多靶點、多通路協同治療治療高血脂，從而論證了民間食用金線蓮來降低高血脂的經驗。為深入研究其降血脂試驗研究提供了基礎。同時，也為金線蓮制作保健產品提供了理論依據。