睡眠調節相關褪黑素對類風濕關節炎滑膜細胞的作用

常樂 孫禎 蔡振煜 翁曉源 董學峰

摘要?目的：分析褪黑素對白細胞介素-17（IL-17）刺激下類風濕關節炎滑膜細胞活性及相關蛋白Rankl、Bcl-2和Bax表達水平的影響。方法：將類風濕關節炎滑膜細胞分為對照組、IL-17組及IL-17+褪黑素組，分別使用CCK8試劑盒以及蛋白質印跡實驗檢測細胞活性及相關蛋白Rankl、Bcl-2及Bax表達水平。結果：與對照組比較，IL-17組有更高的細胞活性（P<0.01）；而IL-17+褪黑素組的細胞活性低于IL-17組（P<0.01）。與對照組比較，IL-17組的Rankl、Bcl-2蛋白表達水平上升，Bax表達水平下降（P<0.01）；與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Rankl、Bcl-2表達水平則下降，Bax表達水平上升（P<0.01）。結論：褪黑素能抑制IL-17對類風濕關節炎滑膜細胞的活性作用，同時褪黑素能減弱IL-17對類風濕關節炎滑膜細胞表達Rankl以及抗凋亡作用。

關鍵詞?類風濕關節炎；白細胞介素-17；褪黑素；睡眠；晝夜規律

Effects of Sleep-regulated Melatonin on Synovial Cells in Rheumatoid ArthritisCHANG Le1，SUN Zhen1，CAI Zhenyu2，WENG Xiaoyuan1，DONG Xuefeng1

（1 Department of Internal Medicine，Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China; 2 Department of Orthopedics，Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

Abstract?Objective：To analyze the effect of melatonin on the activity of synovial cells and the expression of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax in rheumatoid arthritis stimulated by interleukin-17 （IL-17）.Methods：Rheumatoid arthritis synovial cells were divided into control group，IL-17 group and IL-17+melatonin group.Cell activity and expression levels of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax were detected by CCK8 kit and western blotting.Results：Compared with the control group，the IL-17 group had higher cell activity （P<0.01）.The cell activity of IL-17+melatonin group was lower than that of IL-17 group （P<0.01）.Compared with the control group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 proteins in the IL-17 group increased，while the expression levels of Bax decreased （P<0.01）.Compared with the IL-17 treatment group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 in the IL-17+melatonin group decreased，and the expression level of Bax increased （P<0.01）.Conclusion：Melatonin can inhibit the activity of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells，and melatonin can reduce the expression of Rankl and anti apoptosis of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells.

Keywords?Rheumatoid arthritis; Interleukin-17; Melatonin; Sleep; Circadian rhythm

中圖分類號：R593.22；R338.63文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.065

褪黑素是人體的一種內源性激素，主要由松果體分泌，它的分泌有晝夜規律并且和年齡有關，可以誘導自然睡眠并具有抗氧化和抗炎活性。白天的光照信息可以通過人和動物的視網膜、視神經傳遞到視交叉上核，從而抑制褪黑素的分泌，其含量低至幾乎檢測不到；然而褪黑素在夜間分泌量逐漸增多，于凌晨2～4點間達高峰［1-4］。由此可見，褪黑素分泌的高峰期正處于人和動物的睡眠期。褪黑素是一種天然有效的抗炎及抗氧化劑，富含電子的芳香系統及由氧甲基和氮乙?；鶜埢a生的化合物兩親性被認為是其功能的分子基礎［5］。類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種由于滑膜增生導致關節破壞和殘疾的慢性炎癥性自身免疫性疾病。白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）是一種重要的炎癥介質，可誘導成纖維細胞產生多種細胞因子，例如IL-6、IL-8和粒細胞集落刺激因子［6］。先前的研究表明，IL-17可增強成纖維滑膜細胞的遷移、侵襲，從而加重RA的后果［7］。本研究旨在探究褪黑素在IL-17刺激下的類風濕關節滑膜細胞中的作用。

1?材料與方法

1.1?細胞培養

類風濕關節炎滑膜細胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司），在含10%胎牛血清（HyClone，Logan，UT，USA）的DMEM培養基（Gibco，Grand Island，NY，USA）中培養，放置于37 ℃，5%CO2的孵箱中。細胞因子IL-17（PeproTech公司）；褪黑素（索萊寶生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（優逸蘭迪生物科技有限公司）；Rankl、Bcl-2和Bax一抗（Abcam公司）。

1.2?細胞活性實驗

將滑膜細胞以3×103/cm2的密度接種到96孔板中，分別在0 h，1 d及2 d時，隨機取出一塊96孔板，將CCK-8溶液（10 μL）添加到每個孔中，并在37 ℃下孵育1 h。然后使用酶標儀測量450 nm處的吸光度，以此來檢測各組細胞在不同刺激下的細胞活性。

1.3?蛋白質印跡實驗

將細胞在4 ℃下用裂解緩沖液裂解并以12 000 r/min離心30 min后收集上清液。將上清液與上樣緩沖液混合并煮沸5 min。樣品通過12%SDS-PAGE分離后，在60 V條件下轉膜至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h，4 ℃孵育過夜。之后再將一抗稀釋，1∶1 000孵育結合目的蛋白，隨后將膜用TBST洗滌3次，并在室溫下予以1∶6 000或1∶10 000稀釋的二抗孵育2 h。使用EC3成像系統（UVP Inc.，Upland，CA，USA）對條帶進行可視化，并使用ImageJ軟件（NIH）測量每個條帶的光密度。

1.4?統計學方法

采用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）統計軟件進行單因素方差分析及LSD-t組間兩兩比較，所有的數據用均數±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?褪黑素抑制IL-17對類風濕關節炎細胞的活性作用

細胞活性實驗結果顯示，與對照組比較，0.1 mmol/L褪黑素對細胞活性的影響無統計學差異，而0.5 mmol/L褪黑素抑制細胞的活性，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。為了排除高濃度褪黑素本身對細胞的不良反應，后續研究采用對細胞活性無明顯抑制作用的0.1 mmol/L的褪黑素濃度。結果顯示，與對照組比較，IL-17（20 ng/mL）組可以提高細胞活性（P<0.01），而在相同時間點上，IL-17（20 ng/mL）+褪黑素（0.1 mmol/L）組的細胞活性低于IL-17（20 ng/mL）組（P<0.01）。見表2。這意味著褪黑素能抑制IL-17對類風濕關節炎細胞的活性作用。

2.2?褪黑素可減弱IL-17刺激下的類風濕關節炎細胞生成骨侵蝕因子Rankl，同時減弱細胞抗凋亡水平

蛋白質印跡法結果顯示，與對照組比較，IL-17處理組的Rankl蛋白表達水平顯著增多（P<0.01），這表明IL-17能促進類風濕關節炎細胞表達Rankl蛋白。而與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Rankl表達水平則明顯下降（P<0.01），這表明褪黑素能減弱IL-17對類風濕關節炎細胞表達Rankl的作用。見圖1。而在凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax蛋白表達水平上，與對照組比較，IL-17處理組的Bcl-2蛋白表達水平顯著增多（P<0.01），Bax蛋白表達水平顯著增減低（P<0.01），這表明IL-17促進類風濕關節炎細胞抗凋亡能力提升。而與IL-17處理組比較，IL-17+褪黑素組的Bcl-2表達水平則明顯下降（P<0.01），Bax蛋白表達水平顯著增高（P<0.01），這表明褪黑素能減弱IL-17對類風濕關節炎細胞抗凋亡作用。見圖2。

3?討論

睡眠障礙是風濕病的一個常見但未被認識的特征。睡眠對人類免疫力有著重大而廣泛的影響，對人類健康至關重要，并且越來越被認同是一種影響生活的行為。在新西蘭進行的一項動物模型研究表明，睡眠不足會導致免疫紊亂，這不僅可能包括對病原體的反應降低，還可能破壞免疫自我耐受，從而導致自身免疫性疾病的出現。根據研究，50%～75%的RA患者患有睡眠障礙，睡眠質量差和總睡眠時間減少是RA患者的常見癥狀，失眠影響了一半以上的患者。

在橫斷面研究中，睡眠障礙與RA有關，但研究結果相互矛盾，尚不清楚睡眠問題是否是RA的獨立風險因素。根據RA睡眠障礙隊列研究的基線評估數據，87.4%的人睡眠時間短。隨著疾病活動的惡化，包括疼痛、疲勞和功能障礙在內的身體健康狀況受到影響，睡眠障礙變得更加常見。英國的一項隊列的基線數據顯示，類風濕因子水平與睡眠時間有關，這意味著睡眠時間可能會影響類風濕因子水平。這些結果表明，睡眠障礙可能導致類風濕性關節炎的發展［8］。

盡管有證據表明，這些患者在慢波睡眠期間的睡眠潛伏期更長，睡眠效率較差，覺醒次數更多，但是目前很少有對照研究對RA患者的睡眠進行定量評估。據我們所知，只有2項研究使用活動記錄儀來評估RA患者夜間覺醒的次數。此外，大多數研究受到缺乏比較對照、樣本量小和依賴傳統睡眠評分方法的限制，相對缺乏對RA患者的睡眠和神經生物學機制進行綜合評估的研究。

RA患者的睡眠質量比正常人群差，50%～75%的患者會出現睡眠問題，RA患者睡眠障礙可能跟疼痛、抑郁和疾病活動有關。RA患者已被證實晝夜節律存在異常，其關節腫痛、僵硬等臨床癥狀晨起加重的臨床現象被認為與患者體內的炎癥介質如IL-6、IL-1、IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子α等在夜間異常升高，而具有抗炎作用的皮質醇等激素分泌相對不足有關［9］。下丘腦-垂體-腎上腺軸損傷、褪黑素的水平波動可能在造成RA晝夜節律異常中起重要作用。褪黑素在負責調節晝夜節律外，被證明在哺乳動物中具有抗氧化、抗炎和免疫調節活性［10］。在一項涉及RA患者的臨床試驗中，褪黑素被認為是通過其抗氧化作用發揮著治療的效果［11］。成纖維滑膜細胞是RA的關鍵參與者，其通過分泌細胞因子、炎癥介質和降解細胞外基質的蛋白水解酶促進RA的進展。本人既往研究已證實IL-17可以促進類風濕關節炎細胞增殖，同時通過STAT3通路調控細胞自噬水平［12］。有研究支持IL-17在RA中具有促炎、加重關節損傷、促進免疫因子釋放等作用［13］。本研究結果顯示，褪黑素可以減弱類風濕滑膜細胞Bcl-2蛋白表達，升高Bax蛋白水平，意味著細胞的抗凋亡能力下降。

綜上所述，結合本研究結果，褪黑素能抑制IL-17對類風濕關節炎細胞的活性作用，同時褪黑素能減弱IL-17對類風濕關節炎細胞表達Rankl以及抗凋亡作用。因此，在臨床治療上，我們可以通過有效地管理睡眠，促進患者自身褪黑素水平的增加，可能會對減緩RA的癥狀有所作用。

利益沖突聲明：無。

參考文獻

［1］李佳佳，門海濤，高麗美.褪黑素的生理功能及應用研究進展［J］.江蘇農業科學，2023，51（8）：17-26.

［2］邵明坤，劉蓉，孫品，等.褪黑素人體網絡機制及其臨床應用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2022，27（9）：1031-1040.

［3］郭晉良，王丹妮，倪艷，等.基于褪黑素合成分泌探討中醫藥改善睡眠的研究進展［J］.中華中醫藥學刊，2021，39（7）：99-102.

［4］張如意，王平，張舜波，等.褪黑素治療睡眠障礙的作用機制探討［J］.中華中醫藥學刊，2018，36（2）：308-310.

［5］楊王浩，趙淑琴，閆美淋，等.松果體外褪黑素研究進展［J］.動物醫學進展，2022，43（4）：74-81.

［6］付生弟.類風濕性關節炎新靶點藥物治療進展［J］.中國藥物評價，2022，39（1）：44-47.

［7］杜彥儀.益母草堿對由TAZ介導的Th17/Treg失衡及成纖維樣滑膜細胞遷移、侵襲的調控［D］.廣東：廣州中醫藥大學，2021.

［8］GAO R C，SANG N I，JIA C Z，et al.Association Between Sleep Traits and Rheumatoid Arthritis：A Mendelian Randomization Study［J］.Front Public Health，2022，10：940161.

［9］金玥，吳沅皞，張磊，等.類風濕關節炎晝夜節律異常與時間治療研究進展［J］.中國免疫學雜志，2018，34（9）：1413-1417.

［10］李琳.褪黑素臨床研究新進展［J］.中國藥物經濟學，2020，15（10）：121-125.

［11］MACDONALD I J，HUANG C C，LIU S C，et al.Reconsidering the Role of Melatonin in Rheumatoid Arthritis［J］.Int J Mol Sci，2020，21（8）：2877.

［12］CHANG L，FENG X，GAO W.Proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes is enhanced by IL-17-mediated autophagy through STAT3 activation［J］.Connect Tissue Res，2019，60（4）：358-366.

［13］陳向華，王建吉，耿學麗，等.白細胞介素-17對老年類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞增殖和趨化因子分泌的影響及作用機制［J］.中國老年學雜志，2018，38（1）：45-47.

基金項目：泉州醫學高等?？茖W校校級課題青年科技（XJK1922B）通信作者：董學峰，E-mail：707683823@qq.com