β-谷甾醇對帕金森病模型大鼠腦氧化應激損傷及Nrf2/HO-1蛋白通路的影響

袁明洲，袁欣欣，林 瑤，蔡 晶

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學修園臨床醫學院，福建 福州 350122）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是世界第二大神經退行性疾病［1］。中腦部位的黑質致密部多巴胺神經元（dopaminergic neurons，DN）的進行性損傷是造成PD 的主要病理變化。而氧化應激的發生可導致機體出現氧化-還原失衡，進而導致生成大量活性氧，這是導致中腦黑質DN 損害的重要原因［2-3］。在臨床中往往采用口服左旋多巴，即美多芭外源性補充多巴胺進行治療。但單一長期用藥易引起較多不良反應，因此可考慮聯合用藥。核轉錄因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種氧化還原的關鍵調節因子［4］。大部分抗氧化細胞產生的保護蛋白表達受Nrf2 信號蛋白的調控。在PD 患者中，Nrf2 及下游蛋白醌氧化還原酶-1（NQO-1）激活可有效保護細胞免受氧化應激損傷［5］。β-谷甾醇（β-sitosterol）是一種重要的植物甾醇，廣泛存在于如肉蓯蓉、半夏等中藥植物中，具有顯著的抗氧化作用［6］，β-谷甾醇還可在不影響線粒體外膜的情況下，使線粒體膜電位及ATP 含量增加，起到緩解神經退行性疾病的作用［7］。但β-谷甾醇能否改善PD 大鼠腦氧化應激損傷尚有待研究。本實驗擬通過構建PD 動物模型驗證β-谷甾醇對大腦氧化應激的保護作用，進一步探究是否通過Nrf2 及下游蛋白Nrf2、HO-1、NQO-1 發揮作用，為β-谷甾醇對PD 氧化應激的保護作用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1實驗動物 2 月齡SPF 級SD 雄性大鼠40 只，體質量為（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心。飼養條件：室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，飼喂標準大鼠飼料，自由飲水和取食。

1.2實驗試劑 β-谷甾醇（貨號：S1270）、魚藤酮（貨號：R8875）均購自美國Sigma 公司；美多芭（貨號：H10930198）購自上海羅氏制藥有限公司；魚藤酮（貨號：A8007）、葵花油乳化液（貨號：H8923）均購自美國Sigma 公司；丙二醛（MDA）測試盒（貨號：A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：A001-1）均購自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE 凝膠配置試劑盒（貨號：P0012A）購自上海碧云天生物技術研究所；ECL 化學發光檢測試劑盒（貨號：B500022）購自美國Bio-Rad 公司；PVDF 膜（貨號：W0162）購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：PT0001）購自福建邁新技術有限公司。

1.3實驗儀器 電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；倒置顯微鏡（上海尼康儀器有限公司）；光學顯微鏡（上海徠卡儀器有限公司）；石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）；石蠟包埋機（孝感亞光醫用電子技術公司）；電泳儀（上海伯樂生命醫學醫學產品公司）；轉膜儀（上海伯樂生命醫學產品公司）；化學發光成像儀（上海伯樂生命醫學產品公司）。

2 實驗方法

2.1分組與造模 將40 只大鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組、治療組和美多芭組，每組10只。模型組、治療組及美多芭組大鼠采用魚藤酮葵花油乳液（將魚藤酮、葵花油乳液按1.5∶1 比例混合均勻）頸背部皮下注射，每只大鼠注射劑量為1.5 mg/（kg·d），連續注射14 d［8］。根據VOITENKO 等［9］行為學標準，得分2～8 分者為合格的PD 模型大鼠。PD 模型大鼠表現為自主行為減少，拒捕行為減弱，弓背向上抬高，單側斜臥，行走困難。正常組大鼠正常飲食，不予處理。

2.2給藥方法 以60 mg/（kg·d）β-谷甾醇的給藥劑量對大鼠進行灌胃［10］，美多芭組予5 mg/（kg·d）美多芭混懸液灌胃，正常組、模型組大鼠采用生理鹽水灌胃。以上各組給藥均為每天1次，連續14 d。

2.3觀察指標

2.3.1大鼠一般情況 每天觀察4 組大鼠進食、飲水、活動、精神情況，并做好記錄。

2.3.2血清SOD、MDA 含量 造模、干預成功后，所有大鼠處死留取血液，離心后取上層血清，采用SOD、MDA 試劑檢測4 組大鼠血清中SOD、MDA含量。

2.3.3腦黑質組織TH、Nrf2 陽性細胞率 取4 組大鼠腦黑質組織于多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后切片。切片烘干脫蠟后進行抗原修復，再用內源性過氧化物酶孵育10 min，PBS 清洗，非特異性染色阻斷劑孵育10 min，一抗4 ℃孵育過夜，第2 天烘箱37 ℃復溫30 min，二抗孵育10 min，PBS 清洗，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育10 min，最后DAB 染色。200 倍顯微鏡下觀察，以棕黃色或淡黃色顆粒染色為陽性表達。每張切片隨機選取5 個視野，應用Image Plus 6.0 軟件分析圖像，讀取TH、Nrf2 陽性反應細胞率，取平均值。

2.3.4腦黑質組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達量 取相應腦組織50 mg，BCA 法測定蛋白濃度。經過蛋白變性、SDS-PAGE 電泳、濕轉轉膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h。加一抗 Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1 000）、NQO-1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過夜。TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并成像，Image Lab 4.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值做為目的蛋白相對表達量。

2.4統計學方法 數據采用SPSS 24.0 軟件進行分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；各組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結 果

3.14 組一般情況比較 造模后正常組大鼠活動無差異；模型組大鼠造模7 d 后出現皮毛變黃，自發活動減少，尾部僵硬，弓背向上抬高，行走困難等帕金森癥狀。治療組和美多芭組大鼠一般情況有較為明顯改善，皮毛較光亮，行動不便情況也有所好轉。

3.24 組血清SOD、MDA 含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD 含量降低，MDA 含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組和美多芭組SOD 含量升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 4 組血清中SOD、MDA 含量比較（±s） μg/moL

表1 4 組血清中SOD、MDA 含量比較（±s） μg/moL

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.34 組腦黑質組織TH、Nrf2 陽性細胞表達情況比較 與正常組比較，模型組TH、Nrf2 陽性細胞率均減少（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和美多芭組TH、Nrf2 陽性細胞率均增加（P＜0.05）。見圖1-2、表2。

圖1 4 組腦黑質TH 陽性細胞表達情況（免疫組化，×200）

圖2 4 組腦黑質區Nrf2 陽性細胞表達情況（免疫組化，×200）

表2 4 組腦黑質TH、Nrf2 陽性細胞率比較（±s）

表2 4 組腦黑質TH、Nrf2 陽性細胞率比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.44 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達情況 見圖3、表3。

圖3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白條帶圖

表3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達水平比較（±s）

表3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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4 討 論

PD 是高發于老年人的慢性神經退行性疾病，其主要病理特征為中腦DN 凋亡導致其數目減少。造成DN 凋亡的機制尚未完全明確，但氧化應激損傷起到了十分重要的作用。氧化應激造成腦內氧化與還原能力的失衡，增多的氧化產物損害中樞組織和細胞的功能，引發PD 癥狀［11］。因此尋找有效的抗氧化藥物成為PD 治療的有效手段。

β-谷甾醇是一種廣泛存在于中草藥植物根、莖、葉中的植物甾醇，具有多種生物學活性，可抑制腫瘤細胞增殖、抗衰老、修復損傷和調節血糖等多種作用［12-14］。尤其引人注意的是，β-谷甾醇在如阿爾茨海默病等神經退行性疾病中的作用。SHI等［15］的研究證實，β-谷甾醇可抑制葡萄糖氧化酶誘導的氧化應激損傷及脂質過氧化反應，從而改善因腦脂質過氧化引起的阿爾茨海默病。本實驗應用β-谷甾醇干預后，治療組大鼠自主行為、拒捕行為增多，弓背向上抬高、行動困難等PD 相關癥狀有所改善。TH 陽性細胞數反應腦內存活的多巴胺神經元的數量，本實驗結果顯示，運用β-谷甾醇治療后，治療組TH 陽性細胞數與模型組比較有所增加，說明β-谷甾醇可有效保護PD 大鼠多巴胺神經元細胞。

SOD 是機體重要的抗氧化酶蛋白質，可有效去除氧自由基，起到重要的維持氧化和抗氧化平衡的作用。但在PD 患者中，SOD 含量往往降低［16］。實驗研究證實，PD 小鼠模型腦部病變區域MDA 含量增加，而MDA 是重要的脂質過氧化指標［17］。YIN等［18］在急性肝損傷小鼠模型中發現，β-谷甾醇可增高小鼠SOD、降低MDA 的表達，起到較好的抗氧化應激作用。本研究采用β-谷甾醇干預PD 大鼠模型，大鼠血清中SOD 含量高于模型組，MDA 濃度低于模型組。提示β-谷甾醇在PD 中亦有較好的抗氧化應激作用。

為進一步明確β-谷甾醇在PD 中的抗氧化作用機制，本研究采用免疫組化檢測腦黑質中Nrf2 表達，Western blot檢測PD大鼠腦組織中的Nrf2、HO-1、NQO-1 的蛋白表達情況。Nrf2 是機體內重要的抗氧化調節因子［19］，當機體細胞出現氧化應激損傷時，磷酸化的Nrf2 進入細胞核并激活下游抗氧化基因HO-1 和NQO-1 的表達，使HO-1 和NQO-1 蛋白含量上調。HO-1 的抗氧化作用體現在可阻止游離膽紅素參與氧化應激反應及能夠激活具有抗氧化作用的膽紅素［20］，而NQO-1 可抑制ROS 的生成［21］，兩者共同發揮抗氧化損傷能力和保護細胞作用［22］。基于此，Nrf2 及下游蛋白HO-1 和NQO-1 可在多種由氧化應激損傷導致的疾病中起到保護作用［23］。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組腦黑質中Nrf2 陽性細胞數較正常組降低，β-谷甾醇治療后，Nrf2 陽性細胞數有所增加。同時，Western blot 結果顯示，模型組Nrf2、HO-1、NQO-1 表達較正常組降低，而在β-谷甾醇干預后，Nrf2、HO-1、NQO-1 表達較模型組升高，說明β-谷甾醇可通過上調Nrf2 并激活其下游基因發揮抗氧化應激損傷的作用。

綜上，β-谷甾醇可能通過Nrf2/HO-1 信號通路起到有效去除氧自由基、降低脂質過氧化的作用，一定程度抑制PD 大鼠腦組織中氧化應激損傷，從而發揮保護黑質神經元的作用。