生物保鮮劑對氣調包裝鹽水鵝制品品質的影響研究

曾玉祥 沈海軍 曹仲文

摘要：針對地方特色美食揚州鹽水鵝易腐性高、不耐保藏的現狀，研究復合生物保鮮劑對氣調包裝鹽水鵝制品品質的影響。在4 ℃的條件下對N2氣調包裝鹽水鵝做破壞性試驗，分離鑒定其殘存的微生物菌群，檢測出的代表性菌株有熒光假單胞菌、產氣腸桿菌、消化乳桿菌、熱殺索絲菌和腐生葡萄球菌。以Nisin（乳酸鏈球菌素）、殼聚糖（chitosan）、丁香提取物（clove extract）3種生物保鮮劑為指標進行單因素抑菌試驗，根據單因素試驗結果，對3種保鮮劑進行復配試驗，經Box-Behnken design（BBD）與響應面優化，測其TVB-N值。結果表明，最優復合保鮮劑組合為Nisin 0.03%+殼聚糖0.42%+丁香提取物2.40%，曲面極值點TVB-N最小值為12.47 mg/100 g。該試驗為氣調包裝鹽水鵝制品保鮮技術的應用研究提供了理論基礎。

關鍵詞：鹽水鵝；氣調包裝；腐敗菌；復合保鮮劑

中圖分類號：TS206.1 ?????文獻標志碼：A ????文章編號：1000-9973（2024）04-0186-06

Stndy on the Effect of Biological Preservatives on the Quality of

Modified Atmosphere Packaged Salted Goose Products

ZENG Yu-xiang1， SHEN Hai-jun1，2， CAO Zhong-wen2，3*

（1.School Point of Yangzhou Tourism and Business School， Jiangsu Union Technical Institute，

Yangzhou 225001， China; 2.Key Laboratory of Chinese Cuisine Intangible Cultural Heritage

Technology Inheritance， Ministry of Culture and Tourism， Yangzhou 225127， China;

3.School of Tourism and Cuisine， Yangzhou University， Yangzhou 225127， China）

Abstract： In response to the high perishability and poor storage resistance of Yangzhou salted goose， a local specialty food， the effect of composite biological preservatives on the quality of modified atmosphere packaged salted goose products is studied. Destructive test is conducted on N2 modified atmosphere packaged salted goose under 4 ℃ conditions， and residual microbial groups are isolated and identified. The representative strains are Pseudomonas fluorescens， Enterobacter aerogenes， Lactobacillus alimentarius， Brochothrix thermosphacta and Staphylococcus sarophyticus. With three preservatives， namely Nisin， chitosan and clove extract， as the indexes， single factor antibacterial test is carried out. Based on the single factor test results， composite test is conducted on the three preservatives， and through Box-Behnken design （BBD） and response surface optimization， TVB-N values are measured. The results show that the optimal composite preservative combination is Nisin 0.03%+chitosan 0.42%+clove extract 2.40%， and the minimum TVB-N value of the surface extreme point is 12.47 mg/100 g. This test has provided a theoretical basis for the application and study of preservation techniques for modified atmosphere packaged salted goose products.

Key words： salted goose; modified atmosphere packaging; spoilage bacteria; composite preservatives

收稿日期：2023-11-26

基金項目：教育部人文社會科學研究一般項目（17YJAZH006）；四川省高等學校重點實驗室開放基金項目（PRKX201911）

作者簡介：曾玉祥（1972—），男，高級講師，碩士，研究方向：食品開發、烹飪工藝標準化。

*通信作者：曹仲文（1973—），男，副教授，博士，研究方向：輕工技術與工程及傳統烹飪產業化。

鹽水鵝是經各種香料鹵制而成的鵝肉制品，屬江蘇揚州與周邊地區的傳統特色風味食品。其肉質細嫩、口味鮮美、肥而不膩、營養豐富，深受消費者喜愛[1—2]。但由于鹽水鵝具有較高的含水量和豐富的營養物質，為微生物的生長繁殖提供了有利的條件，在銷售和運輸過程中易受雜菌污染，導致其品質降低，嚴重制約了其銷售范圍[3—4]。研究其相關的保鮮技術對延長鹽水鵝的貨架期、保證其食品安全、減少營養損失等具有重要意義[5]。目前揚州市面上鹽水鵝包裝制品大多為真空包裝，已有學者對真空包裝的鹽水鵝進行研究，發現其制品中仍有一定的殘存菌群。董洋等[4]利用傳統平板培養結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術對其加工過程中微生物菌群的多樣性進行了分析，研究得出真空包裝的鹽水鵝產品中的腐敗菌主要為莓實假單胞菌和魏斯氏菌。周濤等[6]根據染色鏡檢、生理生化試驗研究得出導致鹽水鵝腐敗變質的主要微生物為熒光假單胞菌和成團泛菌。王虎虎等[7]研究發現在4 ℃的條件下，鹽水鵝包裝品的優勢腐敗菌為銅綠假單胞菌。相較于傳統的普通包裝，雖然真空包裝具有進一步阻止細菌滋生、延長保質期的優點[8]，但是真空包裝的鹽水鵝制品的肉質過于緊密，使其失去原本細膩的口感。氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）制品具有可以改變菌相構成、抑制優勢腐敗菌繁殖的優點[9]，且經過氣調包裝的制品口感與新鮮制品相近，因此氣調包裝逐漸被看好，但尚未見鹽水鵝菌相構成及配套保鮮技術方面的研究。

生物保鮮劑是天然物質，通常來源于動物、植物或微生物的新陳代謝產物，具有天然、安全、無毒的優點，通過浸泡、噴淋或涂抹等方式應用于食品中，從而達到防腐保鮮的效果[10]。常用的保鮮劑有乳酸鏈球菌素（Nisin）、殼聚糖、曲酸、納他霉素、茶多酚、丁香提取物等。篩選出適合的保鮮劑及最佳配比有望實現延長鹽水鵝貨架期的目的。

為了探究不同生物保鮮劑對鹽水鵝氣調包裝制品品質的影響，本文以揚州市售鹽水鵝為研究對象，在貯藏溫度為4 ℃的條件下，對其N2氣調包裝鹽水鵝樣品做破壞性試驗，采用選擇性培養基進行菌相分析，保藏5 d后，對培養物中的代表性菌株進行分離純化和16S rDNA測序鑒定，確定菌種。依據《食品安全國家標準?食品添加劑使用標準》，以Nisin、殼聚糖、丁香提取物3種生物保鮮劑為考察因素進行單因素試驗，經BBD（Box-Behnken design）與響應面優化，得出最佳配比，以期為氣調包裝鹽水鵝制品的保鮮技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光鵝（當天宰殺，約1 200 g）、生姜、香蔥、花椒、食鹽、黃酒、胡椒粉、味精、香油、香葉等：購于揚州大潤發超市；25 cm×35 cm PA/PE復合光面透明包裝袋：揚州南方儀器設備化工有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。菌株鑒定試劑：Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、PCR產物純化試劑盒、細菌DNA提取試劑盒：均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。Nisin（食品級）、殼聚糖（食品級）：上海藍季生物科技有限公司；丁香提取物（食品級）：西安瑞迪生物科技有限公司。

2720 Thermal Cycler型PCR儀 美國應用生物系統公司；HC-2518R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；QYC-200型全溫培養搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司；YX280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DT-200型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；HH-8型數顯恒溫水浴鍋 杭州同華電器有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

鹽水鵝樣品的制備：鵝用冷水浸泡30 min去血水→加入生姜8 g、香蔥10 g，煮制30 min→洗凈→加入香葉、食鹽腌制4 h→加入蔥段10 g、姜片7 g、黃酒適量、胡椒粉適量和腌制好的鵝于碗中→上屜蒸50 min→冷卻后加入味精、香油于鹵汁中→成品。

氣調包裝鹽水鵝樣品的制備：充入100% N2，充氣時間15 s，加熱時間5 s，加熱溫度60 ℃，總壓力5 MPa，于15 ℃放置，做破壞性試驗，分離菌群。將鹽水鵝以25 g為基本單元，用復合保鮮劑浸泡5 min，瀝干10 min，作N2氣調包裝，置于4 ℃條件下，保藏5 d，序時檢測，對鹽水鵝進行菌落總數的序時測定，并對各類菌作分類計數，統計占比（%）。

1.2.2 培養基的制備

營養瓊脂培養基、MSA培養基、MRS培養基、STAA培養基、VRBGA培養基、Pseudomonades培養基，按文獻[11]進行配制。

1.2.3 代表性菌株的鑒定

對培養物中的代表性菌株進行分離提純和16S rDNA測序鑒定，確定菌名?；蚪MDNA提?。翰捎眉毦鶧NA提取試劑盒提取基因組DNA。目標片段PCR擴增：參考賴宏剛[12]的方法提取基因組DNA、PCR循環條件、凝膠電泳、純化回收。系統發育樹構建：將所測序列在NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中使用BLAST程序在GenBank數據庫進行同源性比較，獲得最相似典型菌的DNA序列，構建系統發育樹。

1.2.4 TVB-N值的測定

TVB-N值的測定及樣品的處理參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[13]。每個樣品測試3次，取其平均值為最終結果。

1.2.5 保鮮劑單因素試驗

參照GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[14]，在肉類樣品中殼聚糖的最大用量為6 g/kg，Nisin的最大用量為0.5 g/kg，由于天然香辛料提取物安全性較高，標準中未規定其最大用量，依據聶相珍[15]的研究結果，確定丁香提取物最大濃度為6%。將Nisin、殼聚糖、丁香提取物按表1設置不同濃度，做單因素試驗。

1.2.6 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，運用Design Expert 13進行響應面試驗，對Nisin、殼聚糖和丁香提取物進行復配設計，將復合保鮮劑添加到鹽水鵝中，測定TVB-N值，通過回歸方程的構建擬合因素與響應值之間的函數關系，得到保鮮效果最佳的變量組合。

1.3 數據分析

運用Mega 7.0軟件進行系統發育樹的構建，BLAST軟件對基因序列進行比對分析，SPSS 24.0軟件進行數據處理，Origin軟件進行繪圖，Design Expert 13軟件進行響應面優化試驗設計。

2 結果與分析

2.1 鹽水鵝N2氣調包裝制品的菌相構成

經N2氣調包裝的鹽水鵝在4 ℃下保藏5 d后，從選擇性培養基上挑取典型生長菌落，在其相應的平板上劃線分離，分離純化2～3次，得到純化的單菌落[16]，通過觀察其菌落形態、生理生化試驗和16S rDNA鑒定，其菌相構成見表2。

由表2可知，各菌株占比以假單胞菌（52.30%）和腸桿菌（31.09%）為主，占比達到菌落總數的83.39%，剩余腐敗菌分別為熱殺索絲菌（12.40%）、乳酸菌（2.69%）、球菌（1.50%）。以上結果表明，在貯藏條件下鹽水鵝的腐敗優勢菌為假單胞菌和腸桿菌。代表性菌株系統發育樹見圖1，菌株分別標記為J、C、S、R、P。

2.2 鹽水鵝N2氣調包裝制品的代表性菌株鑒定結果

根據《伯杰細菌鑒定手冊》[17]與《常見細菌系統鑒定手冊》[18]，用BLAST軟件將5個菌株（假單胞菌、腸桿菌、熱殺索絲菌、乳酸菌、球菌）的16S rDNA序列與GenBank中已知序列進行比對分析，選取同源性較高的菌株序列構建系統發育樹，結果見表3和圖1。

由表3和圖1可知，J與假單胞菌屬的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）同源性最高，相似性為99%；C與腸桿菌科的產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）同源性最高，相似性為97%；S與索絲菌屬的熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）同源性最高，相似性為99%；R與乳酸菌屬的消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）同源性最高，相似性為92%；P與葡萄球菌屬的腐生葡萄球菌（Staphylococcus sarophyticus）同源性最高，相似性為98%。根據已知腐敗代表性菌株，進一步為鹽水鵝的保鮮技術提供了理論依據。

2.3 鹽水鵝N2氣調包裝制品保鮮劑單因素試驗結果

3種生物保鮮劑的單因素抑菌試驗結果見表4，空白組中各抑菌圈均為8.0 mm。

由表4可知，當Nisin濃度范圍為0.03%～0.05%時，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，其對R、P、S的抑制作用逐漸增強，J、C的抑菌圈無明顯變化，因此，可將此Nisin濃度范圍用于復配。當殼聚糖濃度范圍為0.36%～0.60%時，隨著殼聚糖濃度的增加，其對J和C的抑制作用逐漸增強，同時R的抑菌圈逐漸擴大，但擴大速度較慢，而P和S的抑菌圈無明顯變化。因此，殼聚糖的濃度范圍為0.36%～0.60%時可用于復配。當丁香提取物濃度范圍為3.6%～6.0%時，隨著丁香提取物濃度的增加，其對J、C、R、P、S 5種代表性菌株均有抑制作用，特別對J、R和P的抑制作用較強。因此，丁香提取物濃度范圍為3.6%～6.0%時抑制作用最強，可用于復配。

2.4 鹽水鵝保鮮劑BBD與響應面優化

根據單因素試驗結果，運用Design Expert 13對Nisin、殼聚糖和丁香提取物進行復配試驗，并將復合保鮮劑添加于鹽水鵝中，于4 ℃條件下保藏3 d，測其TVB-N值，結果見表5。

對表5中的數據進行回歸擬合，得到鹽水鵝的TVB-N值與Nisin、殼聚糖和丁香提取物3個因素之間的二次方程：TVB-N=11.28+0.67A+0.68B+0.15C－0.78AB－0.013AC－0.40BC+0.41A2+1.14B2+0.12C2，可知鹽水鵝復合保鮮劑的最佳添加量為Nisin 0.03%、殼聚糖0.42%、丁香提取物2.40%，在此復配組合下，鹽水鵝的TVB-N值較小，預測值為10.23 mg/100 g。實際測得TVB-N值為12.47 mg/100 g，與預測值基本相符，表明優化后的回歸方程能較好地預測各因素與TVB-N值之間的關系，該復配工藝具有實際應用價值。對該模型進行方差分析，結果見表6。

由表6可知，該模型具有極顯著性差異（P＜0.01），且決定系數R2為0.986 1，說明該模型非常適合擬合試驗結果[19]。失擬項不顯著（P>0.05），表明模型誤差較小。校正決定系數RAdj2為0.968 1，表明模型在相關性和解釋能力方面表現出色，可用于理論分析和預測。

F值是評價各變量對響應值影響程度的重要指標。較大的F值表示模型分項對響應值的貢獻度較高。當顯著性檢驗概率P＜0.05時，表明該變量對響應值的影響顯著，并且具有統計學上的意義。分析各因素對TVB-N值的影響可知，一次項Nisin濃度（A）、殼聚糖濃度（B）對TVB-N值的影響極顯著（P＜0.01），3個影響因素中，對TVB-N值的影響程度為B＞A＞C，即殼聚糖濃度＞Nisin濃度＞丁香提取物濃度。二次項A2、B2對TVB-N值的影響極顯著（P＜0.01），說明這兩個因素對模糊數學感官評分具有非線性的影響。交互項AB、BC對TVB-N值的影響極顯著（P＜0.01）。

2.5 響應面交互作用分析

為研究各因素之間的交互作用，采用Design-Expert 13軟件繪制了響應面圖包括3D圖形和等高線圖。圖形的坡度越大表示對試驗結果的影響越顯著。觀察3D響應面圖能夠直觀地揭示各因素之間的交互作用對TVB-N值的影響，確定最佳工藝參數以及參數之間的相互作用。響應面分析結果見圖2～圖4。

Nisin濃度和殼聚糖濃度對鹽水鵝樣品TVB-N值的交互作用見圖2。

由圖2可知，等高線呈橢圓形，表示兩因素的交互作用顯著，響應面圖表示鹽水鵝的TVB-N值隨著Nisin濃度和殼聚糖濃度的增加呈先減少后緩慢增加的趨勢。

殼聚糖濃度和丁香提取物濃度對鹽水鵝樣品TVB-N值的交互作用見圖3。

由圖3可知，等高線呈橢圓形，表示兩因素的交互作用顯著，響應面圖表示鹽水鵝的TVB-N值隨著殼聚糖濃度和丁香提取物濃度的增加呈先減少后緩慢增加的趨勢。

Nisin濃度和丁香提取物濃度對鹽水鵝樣品TVB-N值的交互作用見圖4。

由圖4可知，在試驗范圍內，響應面圖表示鹽水鵝的TVB-N值隨著Nisin濃度和丁香提取物濃度的增加呈先減少后緩慢增加的趨勢。

2.6 最優工藝及驗證試驗結果

以TVB-N最小值為優化目標，用Design-Expert 13軟件對試驗進行優化設計，得到的TVB-N值較小，預測值為10.23 mg/100 g。此時3個因素的預測值分別為Nisin濃度0.03%、殼聚糖濃度0.42%、丁香提取物濃度2.40%，為了確定該模型的準確性，采用優化后的參數進行驗證試驗，為方便操作，條件參數設為Nisin濃度0.03%、殼聚糖濃度0.42%、丁香提取物濃度2.40%，平行3次試驗取平均值，測得TVB-N值為12.47 mg/100 g，與試驗數據基本相符，與模型預測值12.08 mg/100 g在5%偏差范圍內，說明優化后的回歸方程模型可以用于實踐。

3 結論

本研究以氣調包裝鹽水鵝制品為試驗對象，對其進行破壞性試驗，以被檢出的氣調包裝鹽水鵝制品中的代表性菌株為受試菌株，通過單因素試驗得出Nisin對R、S、P有較好的抑菌作用；殼聚糖對J、C有較好的抑菌作用；丁香提取物對J、R、P有較好的抑菌作用。利用MAP技術進行綜合保鮮，篩選出最佳復配保鮮劑，通過Design-Expert 13軟件對數據進行回歸擬合，得出鹽水鵝最優復合保鮮劑組合為Nisin 0.03%+殼聚糖0.42%+丁香提取物2.40%，鹽水鵝樣品的曲面極值點TVB-N值的最小值為12.47 mg/100 g。本研究為該保鮮技術的研究應用提供了基礎，同時為提高鹽水鵝的品質、擴大鹽水鵝的銷售市場、推進鹽水鵝產業化提供了一定的指導意義。

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