高效液相色譜UltiMate3000直接進樣分析水中萘及3D數據分析實踐

【摘要】PPB級濃度的萘可以使用高效液相色譜儀器進行定量分析。本實驗采用賽默飛UltiMate3000色譜儀進行直接進樣分析，集中在操作技巧方面，包括儀器平衡、工作條件設置、結果數據處理等。實驗給出定量分析性能指標包括校準曲線、檢出限和加標回收率。濃度性檢測器通過比較發現，峰高的精密度高于峰面積。使用Hypersil ODS C18色譜柱，在柱溫度40℃、220 nm的紫外波長條件下，以1 mL/min的甲醇為淋洗液方案進行操作，直接進樣獲得分析性能為0.29μg/L的檢出限以及4.5%的相對標準偏差。

【關鍵詞】萘；直接進樣；高效液相色譜；DAD數據

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.003

Practice of HPLC Determination of Naphthalene in Water under UltiMate3000 in Direct Injection and Application of 3D Data Analysis

YANG Gangming

（Xiaogan Ecological Environment Monitoring Center of Department of Ecology and Environment of Hubei Province， Xiaogan 432100， China） Abstract： PPB grade concentration of naphthalene can be quantitatively analyzed using high-performance liquid chromatography instruments. This practice uses a direct injection analysis operation on the Thermo Fisher UltiMate3000 chromatograph. The practice mainly focuses on operational techniques， including instrument balance， working condition settings， and result data processing. It provides quantitative analysis of performance indicators， including calibration curves， detection limits， and spiked recovery rates. The precision of the concentration detector is higher than that of the peak area through comparison. Using a Hypersil ODS C18 chromatographic column， operating at a column temperature of 40℃， a UV wavelength of 220 nm， and a methanol elution solution of 1 mL/min， a detection limit of 0.29μg/L and a relative standard deviation of 4.5% were obtained by direct injection.

Keywords： Naphthalene； direct injection； high performance liquid chromatography； DAD data

萘，化學式C10H8，白色易揮發晶體，25℃時飽和蒸汽壓為0.0131 kPa，光解最大吸收波長為310.5～220.5 nm[1]，是最簡單的雙苯有機物。萘是工業生產中重要的稠環烴，主要用于生產苯酐、萘酚和萘胺，以及作為生產染料中間體，也是衛生球的原料之一。萘應用于水泥產品中可以增加水泥塑性變形而不降低其強度。萘的IARC致癌性評論：G2B，可疑人類致癌物，是PAHs統計構成之一[1-2]。研究人員在地表水、土壤中均檢出了萘的存在[3-7]。水中萘的檢測方法有氣相色譜-質譜法和高效液相色譜-熒光檢測器-紫外檢測器法。實驗室檢測一般參照HJ 478—2009《水質多環芳烴的測定液液萃取和固相萃取高效液相色譜法》規定的方法，適合低濃度含量萘的水質檢測。GBT14848—2017《地下水質量標準》中規定Ⅰ類地下水中萘的標準限值為1μg/L.

本實驗使用賽默飛公司UltiMate3000型（簡稱U3000）高效液相色譜儀建立直接進樣方式分析水中萘。U3000配置由泵系統、進樣器、柱箱、紫外-可見光光度檢測器、熒光檢測器、二極管整列檢測器（DAD）構成。二極管整列檢測器波段范圍為180～900 nm。U3000配套的軟件工作站包括一般的樣品進樣以及譜圖分析計算，還包括由DAD檢測器獲取的3D數據的分析功能。

本次分析使用紫外監測器，波長采用JJG 705—2014《液相色譜儀》檢定規程通用的監測波長設置進行分析，同時根據U3000的配置特征打開DAD采集數據，然后利用3D分析模塊分析最佳光波，最后使用最佳光波進行再分析。

1主要部件和試劑

色譜柱：賽默飛Hypersil ODS C18 5μm 2.1 mm×200 mm反相色譜柱。檢測器：賽默飛SPD 3400 D3D UV-VIS檢測器。甲醇：MERK，色譜純，為減少甲醇的消耗，配置一定比例水，采用實驗室純水機制取的超純水。

2儀器參數

1）平衡預操作。對全部流動相通道進行反沖洗以消除氣泡（存在氣泡時，儀器會持續告警Pressure is below limit，同時儀器不能工作），然后清洗注射器、緩沖環、進樣器外部。

2）平衡內容。儀器按照廠家推薦參數方法進行，設置100%甲醇為淋洗方案，將色譜柱維持為40℃，打開紫外線燈，設置檢測器紫外波長值為254 nm，帶寬為1 nm。打開泵維持流速在1.0 mL/min，同時打開基線監控程序觀察系統各狀態，進樣體積設置為10μL。

3）平衡時間。在完成平衡前期操作后進行系統平衡。平衡時間為30 min，進樣出峰不穩定，存在雜峰，見圖1。

平衡時間為1 h，出峰表現穩定，見圖2。

4）流動相比例。使用20%的水和80%的甲醇作為流動相，在譜圖中會多出至少一個峰，即為溶劑水的峰，由于水的極性大于萘，根據反相色譜的規則，水峰會先出，同時在不同時間會出現一些雜峰，見圖3。

3譜圖分析

使用100%的甲醇為淋洗液，流量為1.0 mL/min，進樣量為10μL，紫外檢測波長為254 nm波長，同時開啟3D掃描。連續進行多次進樣，出峰情況良好。出峰時間為2.377 min，保留時間穩定，保留時間相對標準偏差為3%，峰面積相對偏差在13%，見圖4。

4波長調試

使用254 nm紫外波長進行檢測后，重新使用220 nm紫外波長進行進樣分析，維持其他條件不變，出峰穩定狀態不變。可以看出，峰的形態稍有變化，上升階段曲線相對下降階段曲線變得陡峭，見圖5。

53D數據的使用

U3000可以提供180～900 nm范圍的連續波長吸收檢測。前述進樣分析時，開啟3D數據，對應需要設置波長范圍，由于萘吸光響應在紫外區域，因此對應設置為190～400 nm。與傳統色譜圖工作不同，檢測器不僅僅在沿時間軸捕獲一個特定波長的吸光度，而是沿時間軸捕獲全部190～400 nm范圍全部波長（精度可設，默認為1 nm）對應的全部吸光度系列值。系統獲得的吸光度為特定時間和特定波長的響應量，每個數據對組合了時間、波長和吸光度，稱為3D數據。利用此數據，可以提取出兩個方式的二維數據曲線：一個表現為常見的色譜圖，即時間和吸光度信號的對應關系，這個色譜圖可以基于任意一個波長點；另一個表現為波長和吸光度信號的二維圖，即光譜圖，這個光譜圖可以基于任意時間點。利用第一個圖可以一次進樣完成全部波長的掃描，通過工作站軟件可以定性確定最佳波長，而且定量出對應的色譜數據。圖6中，O線表示進樣時的波長對應峰的形態，A線表示希望得到的任意波長的對應的峰的面積形態，這樣可以對比出最佳波長。使用這個方法得到吸光度最佳的波長為220 nm。

利用第二個圖（即光譜圖）可以得到物質對全部波段光波吸收的特征信息，進一步可以得到不同物質在實驗環境下的特征信息。這些信息如同物質的“指紋”，可對未知物質鑒別做定性分析。圖7顯示了在190～400 nm范圍內萘的吸收光譜圖。圖中可以看出萘在波段范圍內出現兩個顯著的可吸收區域，此圖也可以看出最佳吸收點在220.16 nm。

工作站軟件提供平臺將這個光譜圖進行歸檔入庫，這樣可以用于鑒別未知物質，見圖8。利用光譜庫進行物質鑒別結果，見圖9。

利用3D數據還可以分析出峰的另外一個重要指標，即峰匹配度。峰匹配度表示峰最大值處的光譜與前沿和托尾上光譜的相似度。從工作站軟件計算出的峰拖尾處的峰匹配度值中可以看出，峰拖尾處匹配度為946.6。

6定量分析質量控制

1）相關系數

提長山[8]使用3×10-7、1×10-7、4×10-7、2×10-7、0.5×10-7g/mL標準溶液進行相關分析得出相關系數為0.9996，但未做檢出限。本次實驗使用1、2、4、6、8、10μg/L的標準溶液進行分析，以峰面積進行定量，得到標準曲線為y=1.2998x-0.2739，相關系數為0.9994。

2）檢出限

提長山使用1×10-7g/mL以及1×10-4g/mL標準溶液進行7次進樣測試，得到相對標準偏差分別為2.08%和0.02%。參考HJ 1073—2019《水質萘酚的測定高效液相色譜法》萘酚中檢出線為0.2μg/L，預計檢出限為0.2μg/L。使用1μg/L的標準溶液進行重復進樣10次，計算出檢出限為0.29μg/L。

3）精密度

使用1μg/L標液進行重復進樣10次，計算峰面積和峰高的相對標準偏差。

由表1可見，峰高的相對標準偏差明顯優于峰面積。這種情況與檢測器原理有關。UVD檢測器為濃度型檢測器，峰高相對穩定。因為峰面積和淋洗液速率的乘積值相對穩定，所以受淋洗液器件穩定性的影響，當流速出現波動時，峰面積會隨之波動[9]。

4）加標回收率

使用2μg/mL，8μg/mL兩個濃度系列進行加標回收率計算，結果全部回收率在78%～89%之間。

7實際水樣分析

直接預處理后，采用直接進樣方式進行進樣分析[10-12]，選擇6個地表水水樣進行測量，使用光譜庫進行物質鑒別。最終萘的檢測結果顯示未檢出。

選擇3家化工廠水樣進行現場水樣處理，根據HJ 91—2002《污水采樣技術規范》經過0.45μm濾膜過濾預處理后，添加抗壞血酸低溫保存，實驗室再經過0.22μm濾膜過濾后經過稀釋后進樣，一個樣品檢出萘的含量在12.1μg/mL。

8結束語

使用UltiMate3000配置Hypersil ODS C18將水樣直接進樣進行萘分析，以甲醇為流動相，1.0 mL/min流速，柱溫40℃，在220 nm波長可以得到最大的吸光度響應，實驗條件下檢出限測定為0.29μg/L，保留時間相對標準偏差為3%。

儀器響應在樣品濃度在1～10μg/L范圍有較好的線性關系，可以滿足地下水水質的檢測。建議使用峰高進行定量分析。使用3D功能可以一次獲得全部波長數據，進行光譜分析，建立特征物質光譜庫。

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【作者簡介】

楊剛明，男，1970年出生，學士，研究方向為環境監測綜合分析評價。

（編輯：李鈺雙）