HPLC切換波長法同時測定散痰止咳露中5種成分

桂立華

【摘 要】目的：建立HPLC法同時測定散痰止咳露（苦杏仁、連翹、化橘紅、黃芩等）中5種成分的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為依利特C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm、275 nm；進樣量為10 μL。結果：苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷分別在11.514～287.85 μg/mL（r=0.9997）、4.968～124.2 μg/mL（r=0.9998）、12.088～302.2 μg/mL（r=0.9997）、20.512～512.8 μg/mL（r=0.9999）、4.438～110.95 μg/mL（r=0.9999）范圍內線性關系良好，平均加樣回收率（RSD）分別為98.87％（0.63%）、99.71％（0.37%）、99.42％（0.50%）、98.88％（0.44%）、99.15％（0.68%）。結論：該方法操作簡單、專屬性強、精密度高、重現性好，可用于散痰止咳露的質量控制。

【關鍵詞】散痰止咳露；5種成分；高效液相色譜；含量測定

【中圖分類號】

R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）06-0028-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.06.zgmzmjyyzz202406007

Simultaneous Determination of Five Constituents in Santan Zhike Syrup by HPLC Wavelength Switching Method

GUI Lihua

Center for Food and Drug Inspection of Yunnan Province，Kunming 650106，China

Abstract：Objective To develop an HPLC method for the simultaneous quantitative determination of five constituents in Santan Zhike Syrup.Methods High performance liquid chromatography was used，the determination was performed on Yilite C₁₈column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid-methanol at the flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was 30 ℃，and the detection wavelengths were set at 210 nm and 275 nm.The injection volume was 10 μL.Results Amygdalin，forsythoside A ，naringin， baicalin and wogonoside were linear within the rang of 11.514-287.85 μg/mL（r=0.9997），4.968-124.2 μg/mL（r=0.9998），12.088-302.2 μg/mL（r=0.9997），20.512-512.8 μg/mL（r=0.9999），4.438-110.95 μg/mL（r=0.9999），respectively.The average recoveries （RSDs） were 98.87％（0.63%），99.71％（0.37%），99.42％（0.50%），98.88％（0.44%），99.15％（0.68%）．Conclusions The method is convenient，specific，accurate and reproducible in the quality control of multicomponents in Santan Zhike Syrup.

Key words：Santan Zhike Syrup；Five Constituents；HPLC；Determination

散痰止咳露是曲靖市第一人民醫院制劑，由麻黃、苦杏仁、川芎、桔梗、黃芩、法半夏、連翹、化橘紅、甘草、枇杷葉（密炙）10味中藥制成。具有止咳平喘、祛風化痰之功效，用于上感咳嗽、急、慢性氣管炎。中醫學認為，苦杏仁具有降氣止咳平喘、潤腸通便之功能，連翹具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱之功能，化橘紅具有理氣寬中、燥濕化痰之功能，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功能?，F代藥理研究表明，苦杏仁苷具有止咳平喘、抗胃潰瘍等藥理作用，是苦杏仁藥理活性主要成分^［1］；連翹酯苷A具有抗炎、抗氧化等作用，是連翹主要特征性有效成分之一^［2］；柚皮苷具有消炎、止咳、平喘等藥理作用，是化橘紅的有效成分之一^［3］；黃芩苷、漢黃芩苷等黃酮類化合物具有具有解熱、抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用，是黃芩藥理作用中主要的藥效物質基礎^［4］。該制劑經過近20年的臨床使用，療效確切。但現行質量標準，僅對連翹、麻黃進行薄層色譜鑒別，不利于其質量控制，中藥制劑成分復雜，很有必要對多成分進行測定，從而很好的服務臨床。本文參考《中國藥典》^［5］及文獻^［6-19］，分別選擇苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷和漢黃芩苷為苦杏仁、連翹、化橘紅、黃芩的質控指標，建立了HPLC法同時測定散痰止咳露中苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷含量的方法，為該制劑質量標準提供支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（Shimadzu公司），UV-2401型紫外可見分光光度計（Shimadzu公司），XS105型電子天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 材料 苦杏仁苷（批號：110820-201808，含量：88.2%）、連翹酯苷A（批號：111810-201606，含量：93.4%）、柚皮苷（批號：110722-201714，含量：93.4%）、黃芩苷（批號：110715-201720，含量：93.5%）、漢黃芩苷對照品（批號：112002-201702，含量：98.5%），以上對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院；散痰止咳露（批號：20200721，20200816，20200530，曲靖市第一人民醫院制劑室）；乙腈為色譜純（Merck KGaA公司）；水為超純水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 依利特C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1%磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～50 min，20%→60% B，50.01～60 min，20% B）；檢測波長：0～34 min，210 nm（苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷）；34～60 min，275 nm（黃芩苷、漢黃芩苷）體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量，用80%甲醇制成分別含上述對照品0.5757 mg/mL、0.2484 mg/mL、0.6044 mg/mL、1.0256 mg/mL、0.2219 mg/mL的混合對照品儲備液。精密量取上述混合對照品儲備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品1 mL，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，靜置，取上清液，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝與比例，分別制得缺苦杏仁、缺連翹、缺化橘紅、缺黃芩的陰性樣品，按“2.2.2”項下制成陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性與專屬性試驗 分別吸取“2.2”項下的溶液各10 μL，在“2.1”色譜條件下測定，結果5種成分各峰的對稱因子為 0.90～1.10，分離度均大于1.5，陰性樣品在與對照品和供試品色譜峰保留時間相應位置上沒有色譜峰，陰性樣品不干擾測定。如圖1所示。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。濾液分別進樣10 μL，記錄峰面積。以對照品質量濃度（X）、峰面積（Y）分別為橫、縱坐標，進行線性回歸，結果見表1，5種成分在各自的線性范圍內有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。結果，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.15%、0.09%、0.21%、0.24%、0.16%。儀器有良好的精密度。

2.6 重復性試驗 取同一批樣品（批號：20200721）6份，按“2.2.2”項下制備，測定苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷的含量，其含量的RSD分別為0.69%、0.76%、063%、0.58%、0.71%。

2.7 穩定性試驗 取同一“2.2.2”項下制備的樣品，室溫放置，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h時進樣10 μL，記錄峰面積。結果，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.60%、0.49%、0.72%、0.85%、0.64%，表明樣品在24 h內有良好的穩定性。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取測定含量的散痰止咳露（批號：20200721）6份，每份0.5 mL，分別置100 mL容量瓶中，精密加入“2.2.1”項下的混合對照品儲備液5 mL，按“2.2.2”項下制備。測得回收率見表2。

2.9 樣品測定結果 取5批散痰止咳露，按“2.2.2”項下的方法制備，測定含量，結果見表3。結果顯示，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷5種成分含量平均值（RSD）分別為5.5499（7.02%）、1.9492（6.15%）、5.6408（4.26%）、9.0479（4.11%）、2.0463（13.11%），說明5種成分5批次含量之間存在一定差異，特別漢黃芩苷差異較大，其含量RSD達13.11%，產生這種差異的原因可能與處方中各藥材的產地、采收季節、生長年限、炮制方法等多種因素有關。為保證制劑的質量穩定性，使臨床療效更有保障，很有必要對多成分進行含量測定。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 分別取苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷對照品溶液在200～400 nm范圍內進行紫外掃描，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷分別在210 nm、218 nm、212 nm、277 nm、275 nm處有最大吸收。曾嘗試用同一波長進行測定，用210 nm時，黃芩苷、漢黃芩苷峰響應較小，用275 nm時，苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷峰響應較小。最終定為切換波長法進行檢測。

3.2 提取方法的選擇 由于樣品為液體制劑，根據該制劑工藝并結合待測成分的溶解性，選擇用不同濃度（60%、70%、80%、100%）的甲醇作為溶媒，當用80%的甲醇作為溶媒時，5種待測成分回收率好，且雜質干擾較小，因此將80%的甲醇確定為本試驗的溶媒。

3.3 流動相的選擇 參考《中國藥典》^［5］及文獻^［6-19］，先進行預試驗，預試驗流動相為甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸以及乙腈-0.1%磷酸系統，預試驗發現，當甲醇-水、乙腈-水系統時，黃芩苷峰拖尾較重，后在甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸系統中試驗，經反復試驗流動相比例及梯度，當為乙腈-0.1%磷酸系統時，反復調整流動相比例及梯度，苦杏仁苷均分離不好，用甲醇-0.1%磷酸系統時，經反復調整流動相比例及梯度，5種待測成分峰形和分離度均能達到良好效果，最終確定甲醇-0.1%磷酸并進行梯度洗脫為本試驗的流動相。

綜上所述，本研究建立了HPLC切換波長的方法對散痰止咳露中苦杏仁苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷5種成分的含量進行了同時檢測。由于中藥制劑成分復雜，其臨床療效是多成分共同作用的結果，建立多成分含量測定的方法很有必要，本研究建立了散痰止咳露的多成分含量測定的方法，填補了該制劑現行質量標準無含量測定的空白，為今后更好挖掘散痰止咳露的臨床價值奠定了基礎。該方法操作簡單、專屬性強、精密度高、重現性好，可用于散痰止咳露中多成分的含量進行測定。

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（收稿日期：2023-06-25 編輯：劉 斌）