UPLC-QQQ-MS法檢測孕康口服液中驢皮源和牛皮源成分

黎嘉茗　張萬青　劉瀟瀟

【摘 要】目的：建立孕康口服液中驢皮源及牛皮源成分的專屬性檢測方法。方法：選用胰蛋白酶技術對孕康口服液中膠類成分進行處理，利用超高效液相色譜-三重四極桿質譜（UPLC-QQQ-MS）對驢皮源及牛皮源成分的專屬性特征分子離子峰進行檢測。結果：10批樣品均檢出驢皮源成分的特征離子峰，并且均未檢出牛皮源成分的特征離子峰。結論：該方法操作簡便、準確、快速，靈敏度高，可用于孕康口服液中驢皮源的鑒別及牛皮源的檢查。

【關鍵詞】超高效液相色譜-三重四極桿質譜；孕康口服液；驢皮源；牛皮源；特征肽

【中圖分類號】

R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）06-0043-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.06.zgmzmjyyzz202406010

Determination of Donkey Skin and Bovine Skin in Yunkang Oral Liquid by UPLC-QQQ-MS

LI Jiaming ZHANG Wanqing LIU Xiaoxiao^*

Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510663，China

Abstract：Objective To establish a specific method for determination of donkey skin and bovine skin in Yunkang oral liquid.Methods The trypsin technology was used to treat the gum components in Yunkang oral liquid，the specific molecular ion peaks of the components from donkey skin and bovine skin were detected by UPLC-QQQ-MS.Results The characteristic ion peaks of donkey skin components were detected in all 10 samples，and no characteristic ion peaks of bovine skin components were detected.Conclusion The method is simple，accurate，rapid and highly sensitive.It can be used for the identification of donkey skin source in Yunkang oral liquid and the examination of cow skin source.

Key words：UPLC-QQQ-MS;Yunkang Oral Liquid;Donkey Skin Source;Cow Skin Source;Characteristic Peptide

目前，市場上驢皮資源緊缺且價格高昂，少數藥品企業可能會為了尋求更高的經濟效益，將牛皮充當阿膠投料或摻偽，影響用藥安全，為了保證藥品的質量及提高檢測的專屬性，藥品監管部門頒布了一系列膠類原料和制劑的檢測方法^［1-4］。孕康口服液作為臨床常用藥，由山藥、續斷、阿膠等二十三味中藥材組成，具有健脾固腎，養血安胎的功效，臨床用于腎虛型和氣血虛弱型先兆流產和習慣性流產，該藥收載于中國藥典2020年版一部^［2］，但是正文項下并無膠類成分的檢測項目。這種由中藥材中的阿膠專屬性檢測方法的缺失，使以摻偽阿膠投料或少投料、不投料生產中成藥的現象有了存在的空間。為了保證藥品的質量及提高檢測的專屬性，作者結合相關研究^［5-8］，以超高效液相－三重四極桿質譜儀建立了含膠類中藥孕康口服液中驢皮源及牛皮源成分的專屬性檢測方法，并進行了相關方法學驗證，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters XevoTQ-S三重四級桿質譜聯用儀；DK-8D型電熱恒溫水槽；KQ-300DE型超聲清洗器；sartorius CP225D電子天平；100 μL BRAND移液槍；10 μL BRAND移液槍。

1.2 對照品 阿膠對照藥材（批號：121274-201703，中國食品藥品檢定研究院），黃明膠對照藥材（批號：121695-201301，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 試藥與試劑 孕康口服液樣品10批，樣品均為線上藥店采購，詳見樣品信息表1。乙腈（批號：A801556）、甲酸（批號：A543804）均購自默沙東公司；碳酸氫銨（批號：20221001）購自廣州化學試劑廠；胰蛋白酶（批號：0000138466）購于普洛麥格（北京）生物科技有限公司。水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 色譜條件 照高效液相色譜-質譜法（中國藥典2020年版通則0512、0431），以ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，按表2進行梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。

2.1.2 質譜條件 采用質譜檢測器，電噴霧正離子模式（ESI+），噴霧電壓為3.1 kV，鞘氣為20 Arb，輔助氣為8 Arb，離子傳輸管溫度350 ℃，蒸發溫度350 ℃，掃描模式為 MRM，多反應監測（MRM），選擇2020年版《中國藥典》一部阿膠^［2］項下的檢測離子對與m/z 641.3（雙電荷）→726.2和m/z 641.3（雙電荷）→783.3作為檢測離子對，碰撞能量分別為16 V和20 V，要求檢測離子對測定的MRM色譜峰的信噪比大于10∶1。牛皮源質譜參數詳見表3。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品4.0 mL，精密量取，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.2.2 陰性樣品溶液制備 取不含牛皮源的樣品，精密稱定，照供試品溶液制備方法制得。

2.2.3 黃明膠對照藥材溶液制備 取黃明膠對照藥材粉末0.1 g，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.2.4 阿膠對照藥材溶液制備 取阿膠對照藥材粉末0.1 g，自“置50 mL量瓶中”起，同黃明膠對照藥材溶液制備的制備方法。

2.2.5 牛皮源參比溶液制備 取黃明膠對照藥材0.10 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液 5 mL，置100 mL量瓶中，加阿膠對照藥材粉末0.20 g，加1%碳酸氫銨溶液80 mL，超聲處理30 min，再加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃ 恒溫酶解12 h，即得。

2.2.6 胰蛋白酶溶液的制備 取序列分析級胰蛋白酶適量，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL中含1 mg的溶液，作為胰蛋白酶溶液。本溶液臨用新配。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 以m/z 641.3（雙電荷）→726.2，783.3作為檢測離子對，按檢測條件，分別檢測合格樣品、陰性樣品、阿膠對照藥材、黃明膠對照藥材，結果發現陰性樣品未檢測出牛皮源特征離子對，說明孕康口服液中其它藥味對牛皮源的檢測無干擾。如圖1、圖2所示。

2.3.2 基質效應 取1 mL黃明膠對照藥材溶液4份，置20 mL容量瓶中，分別以1%碳酸氫銨溶液、阿膠基質溶液、自制樣品溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

結果表明，以自制樣品基質比以阿膠基質的響應值略小。本檢查方法以阿膠基質代替自制樣品基質制備參比溶液，相當于適當放寬檢出限度。詳見表4。

2.3.3 線性關系 取黃明膠0.1 g，置50 mL量瓶中，加1% 碳酸氫銨溶液至刻度，搖勻。吸取上述對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、1 mL、2 mL、4 mL、10 mL，置20 mL量瓶中，加0.69 g自制樣品（相當于含0.04 g阿膠的樣品量），分別制得0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、1 mg/mL黃明膠的系列對照藥材溶液（相當于投料的阿膠中摻入1%、2%、5%、10%、20%、50%的黃明膠），按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測得峰面積。以峰面積值為縱坐標，阿膠中摻入黃明膠的量為橫坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程：m/z 641.3（雙電荷）→783.3：Y=58834X-33.48，r²=0.995；m/z 641.3（雙電荷）→762.2：Y=80995X-410.4，r²=0.995，在1%～10%范圍內，黃明膠摻入量與色譜峰面積成正比關系。結果見表5和如圖3、圖4所示。

2.3.4 檢測限 以m/z 641.3（雙電荷）→726.2，783.3作為檢測離子對，取黃明膠對照藥材溶液，用自制樣品溶液逐級稀釋。濃度為0.001 mg/mL黃明膠溶液（相當于投料的阿膠中摻入0.05%黃明膠）特征峰m/z 641.3→783.3的信噪比為3.51，滿足信噪比3的要求，作為本次試驗的檢測限。

2.3.5 重復性試驗 取供試品（批號：170601）平行制備6份，以黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3→726.2，783.3作為檢測離子對進行測定，比較峰面積。結果6份樣品均檢出相應的黃明膠特征分子離子峰。結果見表6，峰面積和保留時間的RSD均＜10%，說明該法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 取供試品（批號：170601），按擬定方法制備供試品溶液，分別于2 h、6 h、8 h、12 h、16 h、20 h內進樣測定，提取黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3→726.2，783.3，比較保留時間和峰面積（表7）。結果表明，樣品在24 h內符合黃明膠檢查的要求。

2.4 樣品測定結果 10批孕康口服液均檢出驢皮源成分，并且均未檢出牛皮源成分。見表8。

3 討論

分別采用Waters Xevo^TMTQ-S、Agilent G6460 Triple Quad兩臺質譜檢測器，ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Agilent SB-C1（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）兩根色譜柱，以m/z 641.3→726.2，783.3作為選擇離子進行檢測，考察該法的耐用性。結果參比溶液的信噪比均大于10，可滿足檢驗要求。

制劑阿膠摻偽主要為牛皮源，本品種暫缺乏相關研究。本次項目組研究驢皮源與牛皮源的摻偽檢測方法，采用三重四級桿質譜檢測器結合本次研究的方法對10批孕康口服液進行檢驗，檢測是否混入雜皮藥材生產孕康口服液。該方法的建立，為進一步了解相關產品的質量狀況提供了基礎數據和方法依據。

綜上，本研究建立的專屬性檢測方法，經過對多批次產品的驗證，陰性無干擾，方法的專屬性較強。能有效控制孕康口服液的投料，對孕康口服液中驢皮源及牛皮源成分的檢測提供了一個有效的補充方法。

參考文獻

［1］國家食品藥品監督管理總局.藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2012001［S］.北京，2012.

［2］中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2020：197.

［3］國家食品藥品監督管理總局，藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2014013［S］.北京，2014.

［4］國家食品藥品監督管理總局，藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2014014［S］.北京，2014.

［5］程顯隆，李文杰，魏鋒，等.動物膠類藥材的鑒別方法研究進展［J］.亞太傳統醫藥，2011，7（3）：167-169.

［6］陳蕊，袁千，王凌.動物膠類藥材質量評價方法研究進展［J］.中國現代應用藥學，2018，35（11）：157-161.

［7］陽洪波，王韋達，李意，等.基于特征肽段的液相色譜－質譜技術鑒定膠原蛋白的物種來源［J］.分析測試學報，2018，47（11）：12-19.

［8］程顯隆.膠類藥材質量控制關鍵技術研究［D］.北京：北京中醫藥大學，2014.

（收稿日期：2023-07-02 編輯：陶希睿）