玉露香梨花青苷調控基因PbrMYB19的克隆及功能分析

摘 要：花青苷含量決定了果實色澤，是衡量果實商品價值的重要指標之一，其生物合成受到 MYB 轉錄因子的 調控，然而關于 MYB 負調控梨果實花青苷合成的機制尚未完全明確。基于前期轉錄組學數據的差異表達基因 中篩選到 1 個 MYB 基因家族成員 PbrMYB19，暗示其可能參與調控果實花青苷生物合成。為明確其結構和功 能，為進一步解析 PbrMYB19 對果實花青苷的調控機制奠定基礎，試驗以玉露香梨果皮 cDNA 為模板，克隆 PbrMYB19 全長，利用生物信息學軟件對該基因的結構、親緣關系、保守結構域及順式作用元件進行預測，采用 qRT-PCR 對不同顏色果皮中 PbrMYB19 基因表達水平進行分析，并通過果實瞬時表達系統驗證其功能。結果 表明，PbrMYB19 基因開放閱讀框為 714 bp，編碼 237 個氨基酸，分子質量為 26.85 ku，預測亞細胞定位于細胞核。 系統發育樹分析結果表明，PbrMYB19 與已報道花青苷轉錄抑制子 FaMYB1 和 PbrMYB120 在同一個進化分支 上，且其蛋白 C 端存在 EAR 類似抑制序列。PbrMYB19 基因啟動子序列包含光調控元件、植物激素響應元件。 通過 qRT-PCR 分析發現，紅色和黃色果皮中 PbrMYB19 基因的表達水平顯著高于綠色果皮。構建過表達載體 和瞬時轉化果實結果表明，PbrMYB19 過表達顯著抑制果皮花青苷積累。

關 鍵 詞 ：梨；PbrMYB19 基因；克隆；系統發育樹；功能驗證

中 圖 分 類 號 ：S661.2 文 獻 標 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0036?08

花青苷是一類重要的次生代謝產物，其含量決 定多種水果顏色，是果實外觀品質的重要指標之一[1-2] 。研究證明，花青苷具有較強的抗氧化活性， 在生物和非生物脅迫中發揮著重要作用[3] 。此外， 花青苷能清除自由基、抗腫瘤，有益于人體健康[4] 。 果實花青苷的積累過程受激素、低溫、高溫、強光、 UV-B 輻射等因素的影響[5] 。目前，果實花青苷分 子調控機制解析已成為植物次生代謝研究熱點。

花青苷的生物合成途徑在高等植物中高度保 守[6-8] 。研究發現，苯丙氨酸氨解酶（PAL）、4-香豆 基-輔酶 A 連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHS）、查 爾酮異構酶（CHI）、類黃酮-3'-羥基酶（F3'H）、類黃 酮 -3'，5'- 羥 基 酶（F3'5'H）、黃 烷 酮 3- 羥 基 酶 （F3H）、二氫黃酮醇 4-還原酶（DFR）、花青素合成 酶（ANS）和 UDP-葡萄糖-類黃酮類 3-O-葡萄糖 基轉移酶（UFGT）等參與花青苷的生物合成[9-10] ， 而這些結構基因的表達受轉錄因子在轉錄水平上 的調控，尤以 R2R3-MYB、堿性-螺旋-環-螺旋和 WD40 蛋白組成的轉錄激活復合體（稱為 MBW 復 合體）研究最多[11] 。其中，MYB 對花青苷的合成起 到關鍵的調控作用[12] 。根據 MYB 所含的 R 基序不 同，可以分為 4 類：R1-MYB、R3-MYB、R4-MYB 和 R2R3-MYB，其 中 隸 屬 于 第 6 亞 族 SG6 的 R2R3-MYB 類參與激活花青苷的生物合成途徑， 例如蘋果 MdMYB10、MdMYB1 和 MdMYB110a， 草 莓 FaMYB10，楊 梅 MrMYB1，梨 PyMYB10、 PyMYB114[13-16] 參與 MBW 復合體的形成，進而上 調花青苷結構基因的表達水平[17-19] 。此外，也存在 2 類對花青苷生物合成起負調控的 MYB 抑制子： 第 1 類 是 R3-MYB 抑 制 子 ，當 R3-MYB 結 合 bHLH 蛋白時，競爭性限制了 MBW 復合體的形成， 造 成 了 花 青 苷 結 構 基 因 的 轉 錄 活 性 的 被 動 抑 制[20-21] 。其已在番茄、越桔和沼澤越桔中鑒定出抑 制果實花青苷積累的 R3-MYB[22-23] 。第 2 類抑制子 屬于 SG4 的 R2R3-MYB，能夠直接抑制花青苷結 構基因的表達，主要因為它們具有乙烯響應元件結 合因子相關的兩親性抑制（EAR）基序[21] 。據報道， SG4 MYB 在包括蘋果、葡萄、桃子和草莓在內的許 多水果品種中抑制果實花青苷的產生[24-28] 。

前期針對梨果實色澤變化的轉錄組數據研究 發現，MYB 家族成員基因 PbrMYB19 在果實色澤 變化期間差異表達，但具體功能尚不清楚。本研究 以玉露香梨果皮 cDNA 為模板，克隆調控果實花青 苷的 MYB 轉錄因子基因 PbrMYB19（Pbr013413）， 并對其結構、編碼蛋白的理化性質進行生物信息學 分析，同時構建過表達載體后在蘋果果實上進行瞬 時表達驗證觀察表型，以期為下一步解析和豐富梨 果實中 MYB 類轉錄因子對花青苷合成的調控模式 研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試梨品種為玉露香梨（Pyrus bretschneideri Rehd. cv. Yuluxiang），于 2020 年 8 月開始在山西農 業大學園藝學院試驗站收集轉色期果實，立即運回 實驗室后用削皮刀削取果皮，液氮處理后儲存至 -80 ℃冰箱，用于 RNA 的提取。未著色的紅星蘋果 （Malus domestica L. cv. Delicious）購于山西太谷農 家果園。完成瞬時轉化和花青苷誘導后，仔細削取 菌液處理的果皮，用于花青苷含量測定。

1.2 玉露香梨 PbrMYB19 基因的克隆

用液氮將果皮研磨成粉末，運用改良 CTAB 法[29-30] 提 取 果 皮 的 總 RNA，按 照 cDNA 試 劑 盒 （TaKaRa）說明書將總 RNA 反轉為 cDNA 后備用。 通 過 白 梨 基 因 組 數 據 庫（http：//peargenome. njau. edu. cn/）獲 得 PbrMYB19 基 因 CDS 序 列 ，用 Primer Premier 5.0 軟件設計引物（表 1），PCR 克隆 目的基因。PCR 反應體系：模板 cDNA 2 μL，上下游 引物（10 mol/L）各 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL， 加DEPC水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預熱6 min； 94 ℃ 變 性 30 s，55 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸 1 min， 30 個循環。之后，PCR 產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電 泳 ，將 回 收 純 化 后 的 電 泳 產 物 與 入 門 克 隆 載 體 PNC-AEnTopo 連接，篩選陽性克隆后送至通用生 物（安徽）股份有限公司，利用 SnapGene 4.1.9 軟件 對測序得到的 PbrMYB19 編碼區序列進行比對。

1.3 PbrMYB19 基因的生物信息學分析

利用 DNAMAN 軟件對 PbrMYB19 基因進行 氨基酸翻譯和多重序列比對，利用在線分析工具ProtParam（http：//web. expasy. org/protparam/）進 行 蛋 白 特 性 分 析 ，利 用 在 線 分 析 工 具 Protscale （https：//web.expasy.org/protscale/）進行親疏水性 分析，利用在線分析工具 NetPhos 3.1（http：//www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行磷酸化位點預 測 ，利 用 在 線 分 析 工 具 SignalP（https：//services. healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）進行信 號肽分析，利用 NCBI 網站 CCD 工具（https：//ww. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）進 行 蛋 白 保 守 結 構 域 分 析 ，利 用 在 線 分 析 工 具 SOPMA （https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa_ sopma.html）進行蛋白二級結構預 測 ，利用在線分析工具 SWISS-MODEL（https：// swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白三級結 構預測 ，利用在線分析工具 Plant-mPLoc（http：// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行亞 細胞定位預測分析，利用 MEGA.07 進行系統進化 樹 構 建 ，利 用 在 線 分 析 工 具 PlantCARE（http：// bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/ html/）分析順式作用元件[31] 。

1.4 PbrMYB19 在蘋果果實中瞬時表達

利用 Nimble Cloning（NC）克隆方法[32] ，將連接 入門載體 PNC-AEnTopo 的 PbrMYB19 基因導入 PNC-Cam2304 過 表 達 載 體 ，重 組 載 體 命 名 為 PbrMYB19-OE。之后將過表達載體導入農桿菌 EHA105 并劃線培養，挑取單菌落加入 1 mL LB 液 體培養基（含抗生素）在 28 ℃、180 r/min 搖床中培 養，隨后將 1 mL 菌液倒入 50 mL 液體培養基中在 28 ℃、180 r/min 搖床中培養 12～16 h。離心收集菌 體 ，棄 去 培 養 基 ，利 用 重 懸 液 將 菌 體 重 懸 ，調 節 OD600至 0.3 左右，遮光室溫培養 3 h。用 5 mL 注射 器吸取重懸菌液，將針頭緩慢插入蘋果表皮注射重 懸菌液，后將蘋果放入光照培養箱中誘導 3～5 d。

1.5 基因的表達分析

分別在果實成熟前期、成熟后期和貯藏期收集 玉露香梨果皮，分別呈現綠色、紅色、黃色。利用試 劑盒 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit（Vazyme）進行實 時熒光定量 PCR。利用 Primer Premier 5.0 軟件設 計特異性引物（表 1），對熒光值變化曲線和熔解曲 線進行分析后，通過 2-??Ct方法計算 PbrMYB19 在 不同處理時期的相對表達量。每個處理重復 3 次， 每個重復有 5～7 個果實。

1.6 花青苷含量測定

參考 UBI 等[33] 的方法，鹽酸-甲醇溶液（V∶V= 1∶99）浸提，使用分光光度計在 530、620、650 nm 處 測定吸光度值。

1.7 數據處理

采用 Microsoft Excel 2017 進行數據整理和圖 表制作，采用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析，采用 AVONA 進行各處理間的顯著性檢驗（Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 玉露香梨 PbrMYB19 基因的克隆與理化性質 分析

PbrMYB19 基 因 序 列 與 氨 基 酸 序 列 如 圖 1 所示。

以玉露香梨果皮 cDNA 為模板，PCR 擴增并進 行亞克隆測序，結果顯示（圖 1），PbrMYB19 基因完 整的開放閱讀框長度為 714 bp，共編碼 237 個氨基 酸，與梨基因組數據庫中序列對比一致。理化性質 分析表明，PbrMYB19 分子質量為 26.85 ku，分子式 為 C1156H1854N356O360S11，總原子數為 3 737 個，理論等 電點 pI 為 8.90；不穩定指數為 49.13，被歸類為不穩 定蛋白。PbrMYB19 編碼蛋白含有帶正電荷的氨 基酸殘基（Asp+Glu）28 個，含有帶負電荷的氨基 酸殘基（Arg+Lys）34 個。

2.2 PbrMYB19 蛋白的結構分析

通 過 Conserved Domain Search 對 PbrMYB19 基 因 編 碼 的 蛋 白 保 守 結 構 域 進 行 分 析 ，結 果 顯 示 ，其 屬 于 PLN03091 超 基 因 家 族（圖 2-A）。 對 PbrMYB19 基因編碼蛋白進行磷酸化位點預測，結 果表明（圖 2-B），PbrMYB19 基因含有 7 個 Thr 位 點，1 個 Tyr 位點，19 個 Ser 位點。信號肽分析結果 顯示，該蛋白不存在信號肽。親疏水性分析結果表 明，該基因編碼蛋白親水的氨基酸（負值）多余疏水 的氨基酸（正值），屬于親水蛋白，其中，第 80 位分 值最高，為 2.100，疏水性最強；第 125 位分值最低， 為-3.156，親水性最強（圖 2-C）。

對 PbrMYB19 基因編碼的蛋白進行二級結構 預 測 ，結 果 顯 示（圖 2-D），該 蛋 白 α -螺 旋 占 比 為 36.71%，延 伸 鏈 占 比 為 5.06%，β - 轉 角 占 比 為 5.91%，自 由 卷 曲 占 比 為 52.32%。 PbrMYB19 基 因編碼的蛋白含有多個 β/α/β 類 Rossmann 折疊區 域（圖 2-E）。此外，利用在線分析工具 Plant-mPLoc 進行亞細胞定位預測分析，結果表明，PbrMYB19 基因編碼的蛋白位于細胞核中。

系統進化樹分析表明（圖 3-A），梨 PbrMYB120 和草莓 FaMYB1 對花青苷的生物合成起負向調控的作用[18，26] ，而梨 PbrMYB19 也聚類于這一進化分 支，推測 PbrMYB19 具有相似的功能。PbrMYB19 的氨基酸序列與擬南芥 AtMYB4、草莓 FaMYB1、 馬鈴薯 PhMYB4、白梨 PbrMYB120 進行多重序列 比對，結果顯示（圖 3-B），PbrMYB19 的 C 端有與 FaMYB1、PbrMYB120 等相似的 EAR 抑制序列。

2.3 PbrMYB19 基因啟動子順式元件分析

對 PbrMYB19 基因起始密碼子前 2 000 bp 序 列順式元件預測分析，結果發現（表 2），PbrMYB19 基因啟動子除含有典型的 TATA-box 和 CAATbox 核 心 啟 動 子 元 件 外 ，還 含 有 4 個 光 響 應 元 件 GT1-motif、2 個脫落酸反應順式作用元件 ABRE、 1 個厭氧誘導所需元件 ARE、1 個分生組織表達調 控元件 CAT-box、1個赤霉素響應元件 P-box和 1個 MYB 結合位點 MYB-binding site。

2.4 PbrMYB19 基因的表達分析

PbrMYB19基因的相對表達量情況如圖4所示。

從圖 4 可以看出，PbrMYB19 基因在綠色、紅 色、黃色果皮中均有表達，但在綠色果皮中的表達 量明顯低于在紅色和黃色果皮中，在紅色和黃色果 皮中表達量無明顯差異。

2.5 PbrMYB19 基因功能驗證

為了進一步驗證 PbrMYB19 基因的功能，構建 了該基因的過表達載體，導入農桿菌 EHA105。之 后，將農桿菌用重懸液懸浮注射蘋果表皮，以含有 空載體的農桿菌作為對照，經過在光照培養箱內誘 導花青苷，結果發現，蘋果表皮注射 PbrMYB19 過 表達載體部位沒有紅色產生，而對照仍然變紅（圖 5-A）。其中，PbrMYB19 過表達處理后花青苷含 量 是 對 照 的 27.99%（ 圖 5-B）；與 之 相 反 ， PbrMYB19 基因在過表達部位表達量明顯高于對 照（圖 5-C）。可見，過表達 PbrMYB19 對果實中花 青苷的生物合成起到抑制作用。

3 結論與討論

衡量玉露香梨果皮著色的一個重要的指標是 花青苷的含量多少，而 MYB 轉錄因子通過轉錄調 控酶的表達進而影響花青苷的合成。本研究從玉露 香梨果皮中克隆了 PbrMYB19 基因，通過對其生物 信息分析顯示，PbrMYB19 開放閱讀框有 714 bp， 編 碼 237 個 氨 基 酸 ，屬 于 轉 錄 因 子 MYB 基 因 家 族 R2R3-MYB 類中的一員。前人的研究已表明， PbrMYB120 和 FaMYB1 是花青苷合成調控的轉錄 抑制子[18，26] ，預測進化樹同為一支的 PbrMYB19 可 能對花青苷合成起抑制的作用。序列比對發現， PbrMYB19 在 C 端存在 1 個 EAR 抑制基序 ，結合 已 發 現 的 蘋 果 MdMYB32 的 EAR 基 序 可 以 影 響 ANS 的表達水平[34] ，MdMYB16 的 EAR 基序可以 影響 UFGT 和 ANS 的啟動子活性[35] ，進一步說明 PbrMYB19 具有花青苷抑制子功能。更重要的是， qRT-PCR 分析發現，PbrMYB19 基因在綠色果皮 與紅色和黃色果皮中的表達差異顯著，而果皮從綠 色 轉 變 為 紅 色 和 黃 色 又 是 由 光 照 引 起 的 ，且 PbrMYB19 基因的啟動子序列中存在光響應元件， 說明 PbrMYB19 基因的表達可能與光照有關。此 外 PbrMYB19 基因的啟動子區域還存在多種植物 激素響應元件，說明 PbrMYB19 基因的表達可能也 受到了激素的影響。

利用果實瞬時表達技術驗證花青苷調控基因 的功能已有廣泛報道[36] 。本研究嘗試用轉色期玉 露香梨果實注射過表達載體，以期獲得抑制果實花 青苷積累的表型。然而，玉露香梨果實含水量較 高，果實注射孔腐爛嚴重，導致同源表達試驗失敗。 對于遺傳轉化體系較困難的木本植物，異源表達驗 證基因功能也是常用的手段之一。例如，LI 等[37] 利用煙草和草莓花托，通過瞬時表達系統驗證了梨花 青苷調控基因 PyWRKY31 或 PyWRKY26 與其伴 侶 PyMYB10、PyMYB114 和 PybHLH3 共 轉 化 后 促進花青素的積累效果。所以，本研究選擇較易著 色的蘋果果實異源過表達 PbrMYB19 基因，結果發 現，該基因參與果實著色和花青苷負調控作用。總 之，PbrMYB19 基因過表達能夠抑制果實花青苷積 累，具體調控機制還需進一步驗證。

本研究通過克隆和生物信息學分析玉露香梨 果皮的 PbrMYB19 基因，結果發現，其編碼的蛋白 質具有 MYB 轉錄因子家族的特征，并在進化上與 已知的花青苷合成抑制子 PbrMYB120和 FaMYB1 密 切 相 關 。 進 一 步 的 qRT-PCR 分 析 揭 示 了 PbrMYB19 在不同色澤果皮中的表達差異，以及其 啟動子中光響應元件的存在，暗示了光照和植物激 素可能對其表達有影響。通過在蘋果果實中的異 源過表達試驗，研究證實了 PbrMYB19 基因能夠抑 制 花 青 苷 的 積 累 。 研 究 結 果 為 深 入 理 解 PbrMYB19 在梨果著色過程中的調控機制奠定了 基礎，并為未來梨果品質改良提供了分子層面的 參考。

參 考 文 獻：

［1］ JIMENEZ-GARCIA S N，GUEVARA-GONZALEZ R G， MIRANDA-LOPEZ R，et al. Functional properties and quality characteristics of bioactive compounds in berries：Biochemistry， biotechnology，and genomics[J]. Food Research International， 2013，54（1）：1195-1207.

［2］ DAVIES K M，ALBERT N W，SCHWINN K E. From land? ing lights to mimicry：the molecular regulation of flower coloura? tion and mechanisms for pigmentation patterning[J]. Functional Plant Biology：FPB，2012，39（8）：619-638.

［3］ YU B，ZHANG D，HUANG C H，et al. Isolation of anthocy? anin biosynthetic genes in red Chinese sand pear（Pyrus pyrifolia Nakai） and their expression as affected by organ/tissue，cultivar， bagging and fruit side[J]. Scientia Horticulturae，2012，136： 29-37.

［4］ 張雪，王荔，瞿飛，等 . 引種紅梨花青苷合成及相關因子變化 [J]. 西南農業學報，2017，30（5）：1162-1167.

ZHANG X，WANG L，QU F，et al. Relationship between an? thocyanin biosynthesis and related factors in red pear varieties in? troduced from Yunnan[J]. Southwest China Journal of Agricul? tural Sciences，2017，30（5）：1162-1167.

［5］ LI G，MENG X Q，ZHU M K，et al. Research progress of beta? lain in response to adverse stresses and evolutionary relationship compared with anthocyanin[J]. Molecules，2019，24（17）：3078.

［6］ NAING A H，KIM C K. Roles of R2R3-MYB transcription fac? tors in transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in horticultural plants[J]. Plant Molecular Biology，2018，98（1）： 1-18.

［7］ LLOYD A，BROCKMAN A，AGUIRRE L，et al. Advances in the MYB-bHLH-WD repeat（MBW） pigment regulatory model： addition of a WRKY factor and co-option of an anthocyanin MYB for betalain regulation[J]. Plant and Cell Physiology， 2017，58（9）：1431-1441.

［8］ HICHRI I，BARRIEU F，BOGS J，et al. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway [J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（8）：2465-2483.

［9］ SAITO K，YONEKURA-SAKAKIBARA K，NAKABAYASHI R，et al. The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis： structural and genetic diversity[J]. Plant Physiology and Bio? chemistry：PPB，2013，72：21-34.

［10］ 王川藝，黃紅濤，陳發波，等 . 胭脂蘿卜 RsCHS1 基因克隆及 表達分析[J]. 河南農業科學，2023，52（9）：122-132.

WANG C Y，HUANG H T，CHEN F B，et al. Cloning and expression analysis of RsCHS1 gene in red radish（Raphanus sativus L.）[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，2023，52 （9）：122-132.

［11］ XU W J，DUBOS C，LEPINIEC L. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR complexes[J]. Trends in Plant Science，2015，20（3）：176-185.

［12］ AN X H，TIAN Y，CHEN K Q，et al. The apple WD40 pro? tein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate anthocyanin accumulation[J]. Journal of Plant Physiol? ogy，2012，169（7）：710-717.

［13］ ESPLEY R V，HELLENS R P，PUTTERILL J，et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB tran? scription factor，MdMYB10[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2007，49（3）：414-427.

［14］ LI Y Y，MAO K，ZHAO C，et al. MdCOP1 ubiquitin E3 li? gases interact with MdMYB1 to regulate light-induced anthocy? anin biosynthesis and red fruit coloration in apple[J]. Plant Physiology，2012，160（2）：1011-1022.

［15］ UMEMURA H，OTAGAKI S，WADA M，et al. Expression and functional analysis of a novel MYB gene，MdMYB110a_ JP，responsible for red flesh，not skin color in apple fruit[J]. Planta，2013，238（1）：65-76.

［16］ YAO G F，MING M L，ALLAN A C，et al. Map-based clon? ing of the pear gene MYB114 identifies an interaction with other transcription factors to coordinately regulate fruit anthocy? anin biosynthesis[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2017，92（3）：437-451.

［17］ AN J P，WANG X F，LI Y Y，et al. EIN3-LIKE1，MYB1，and ETHYLENE response factor3 act in a regulatory loop that syn? ergistically modulates ethylene biosynthesis and anthocyanin ac? cumulation[J]. Plant Physiology，2018，178（2）：808-823.

［18］ SONG L Y，WANG X L，HAN W，et al. PbMYB120 nega? tively regulates anthocyanin accumulation in pear[J]. Interna? tional Journal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1528.

［19］ NI J B，PREMATHILAKE A T，GAO Y H，et al. Ethyleneactivated PpERF105 induces the expression of the repressortype R2R3-MYB gene PpMYB140 to inhibit anthocyanin bio? synthesis in red pear fruit[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2021，105（1）：167-181.

［20］ ZHANG W，NING G G，LV H Y，et al. Single MYB-type transcription factor AtCAPRICE：a new efficient tool to engi neer the production of anthocyanin in tobacco[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，388（4）： 742-747.

［21］ ALBERT N W，DAVIES K M，LEWIS D H，et al. A con? served network of transcriptional activators and repressors regu? lates anthocyanin pigmentation in eudicots[J]. The Plant Cell， 2014，26（3）：962-980.

［22］ PRIMETTA A K，KARPPINEN K，RIIHINEN K R，et al. Metabolic and molecular analyses of white mutant Vaccinium berries show down-regulation of MYBPA1-type R2R3 MYB regulatory factor[J]. Planta，2015，242（3）：631-643.

［23］ ZORENC Z，VEBERIC R，SLATNAR A，et al. A wild 'al? bino' bilberry（Vaccinium myrtillus L.） from Slovenia shows three bottlenecks in the anthocyanin pathway and significant dif? ferences in the expression of several regulatory genes compared to the common blue berry type[J]. PLoS One，2017，12（12）： e0190246.

［24］ ZHOU H，KUI L W，WANG F R，et al. Activator-type R2R3- MYB genes induce a repressor-type R2R3-MYB gene to bal? ance anthocyanin and proanthocyanidin accumulation[J]. The New Phytologist，2019，221（4）：1919-1934.

［25］ ZHU Z G，LI G R，LIU L，et al. A R2R3-MYB transcription factor，VvMYBC2L2，functions as a transcriptional repressor of anthocyanin biosynthesis in grapevine（Vitis vinifera L.）[J]. Molecules，2018，24（1）：92.

［26］ AHARONI A，DE VOS C H，WEIN M，et al. The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavo? nol accumulation in transgenic tobacco[J]. The Plant Journal： for Cell and Molecular Biology，2001，28（3）：319-332.

［27］ GAO J J，SHEN X F，ZHANG Z，et al. The myb transcription factor MdMYB6 suppresses anthocyanin biosynthesis in trans? genic Arabidopsis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture， 2011，106（2）：235-242.

［28］ PéREZ-DíAZ J R，PéREZ-DíAZ J，MADRID-ESPINOZA J，et al. New member of the R2R3-MYB transcription factors family in grapevine suppresses the anthocyanin accumulation in the flowers of transgenic tobacco[J]. Plant Molecular Biology， 2016，90（1）：63-76.

［29］ 周菲 . 改良 CTAB 法提取油用向日葵成熟葉片的總 RNA[J]. 黑龍江農業科學，2013（7）：8-10.

ZHOU F. An improved CTAB method for extraction of total RNA from mature leaves in oil sunflower[J]. Heilongjiang Ag? ricultural Sciences，2013（7）：8-10.

［30］ 閆冬梅，薛美昭，儀慧蘭，等 . 成熟葡萄果實高質量總 RNA 提 取方法的建立[J]. 山西農業科學，2022，50（1）：9-14.

YAN D M，XUE M Z，YI H L，et al. Establishment of extrac? tion methods for high quality rna from mature grape berry[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2022，50（1）：9-14.

［31］ 楊翠鳳，滕崢，韋春，等 . 百香果苯丙氨酸解氨酶基因 PePAL 克隆及表達分析[J]. 河南農業科學，2023，52（10）：100-108.

YANG C F，TENG Z，WEI C，et al. Cloning and expression analysis of phenylalanine ammonia-lyase gene PePAL in pas? sion fruit[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，2023，52 （10）：100-108.

［32］ YAN P，TUO D C，SHEN W T，et al. A Nimble Cloningcompatible vector system for high-throughput gene functional analysis in plants[J]. Plant Communications，2023，4（2）：100471.

［33］ UBI B E，HONDA C，BESSHO H，et al. Expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in apple skin：effect of UV-B and temperature[J]. Plant Science，2006，170（3）：571-578.

［34］ 許海峰，楊官顯，王意程，等 . 蘋果 MdMYB32 通過自身 EAR 抑制序列抑制花青苷的生物合成[J]. 中國農業科學，2018，51 （24）：4690-4699.

XU H F，YANG G X，WANG Y C，et al. Apple MdMYB32 inhibits the anthocyanin biosynthesis by its own EAR inhibitory sequence[J]. Scientia Agricultura Sinica，2018，51（24）：4690- 4699.

［35］ XU H F，WANG N，LIU J X，et al. The molecular mechanism underlying anthocyanin metabolism in apple using the Md? MYB16 and MdbHLH33 genes[J]. Plant Molecular Biology， 2017，94（1）：149-165.

［36］ LIU H N，SHU Q，KUI L W，et al. The PyPIF5-PymiR156aPySPL9-PyMYB114/MYB10 module regulates light-induced anthocyanin biosynthesis in red pear[J]. Molecular Horticul? ture，2021，1（1）：14.

［37］ LI C，WU J，HU K D，et al. PyWRKY26 and PybHLH3 cotar? geted the PyMYB114 promoter to regulate anthocyanin biosyn? thesis and transport in red-skinned pears[J]. Horticulture Re? search，2020，7：37.