抗感菜豆品種對(duì)菜豆普通花葉病毒侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析

摘 要：菜豆普通花葉病毒（BCMV）在世界范圍內(nèi)分布廣泛并可造成菜豆嚴(yán)重減產(chǎn)。菜豆是 BCMV 的主要寄 主，不同遺傳背景的菜豆對(duì) BCMV 侵染的響應(yīng)存在顯著差異，目前菜豆抗性基因功能及 BCMV 的致病機(jī)制鮮有 報(bào)道。為了為菜豆抗性基因功能的研究以及分子抗病育種提供相關(guān)依據(jù)，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing）技 術(shù)對(duì) BCMV（C54 株系）侵染感性及不同抗性的菜豆品種材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)所得數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因并 進(jìn)行 Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集以及進(jìn)行 Weighted correla? tion network analysis（WGCNA）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的菜豆品種中病毒的積累量、差異表達(dá)基因的定位及一些 關(guān)鍵通路對(duì)病毒侵染的響應(yīng)存在共性和差異（如晝夜節(jié)律、光合作用、植物-病原體的相互作用和一些代謝途徑 相關(guān)通路等）。在接種葉上，Dubbele witte 品種（DW，對(duì) BCMV 侵染易感）與 Redland’s greenleaf C 品種（RGLC， 對(duì) BCMV 侵染具有抗性）差異表達(dá)的基因類型上更為相似，定位于光合體系，在光合作用、光合作用-天線蛋白以 及光合生物中的碳固定等通路富集，而 Sanilac（對(duì) BCMV 侵染具有抗性）的差異基因沒有在光合作用等通路富 集。在系統(tǒng)葉上，2 個(gè)抗性品種中的差異表達(dá)基因類型也有差異。植物被病毒侵染后會(huì)干擾植物激素的合成與 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過選取 8 個(gè)關(guān)鍵的植物激素合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)錄組和 qPCR 數(shù)據(jù)結(jié)果表 明，不同的植物激素合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在 BCMV 侵染菜豆后的表達(dá)情況存在差異：BCMV 侵染促進(jìn)了參 與水楊酸、茉莉酸和赤霉素合成通路的關(guān)鍵基因的正向調(diào)控；乙烯、油菜素內(nèi)酯以及脫落酸相關(guān)的基因在抗感品 種中的表達(dá)變化趨勢(shì)不相同。研究結(jié)果明確了 BCMV 侵染不同遺傳背景的菜豆品種后的轉(zhuǎn)錄組差異反應(yīng)。

關(guān) 鍵 詞 ：菜豆普通花葉病毒；轉(zhuǎn)錄組；WGCNA；菜豆

中 圖 分 類 號(hào) ：S436.43 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 ：A 文 章 編 號(hào) ：1002?2481（2024）02?0065?13

菜豆普通花葉病毒（Bean common mosaic virus， BCMV）在自然條件下可侵染多種豆科植物，菜豆 （Phaseolus vulgaris）是其主要的寄主。BCMV 侵 染菜豆后可引起花葉、畸形、黃化、生長遲緩等癥 狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起局部或者系統(tǒng)性的壞死甚至造成 植株死亡，是影響菜豆產(chǎn)量和質(zhì)量最具危害性的病 原之一[1] 。菜豆普通花葉病毒是馬鈴薯 Y 病毒屬的 成員之一，為正單鏈 RNA 病毒，全長約為 10 kb，包 含一個(gè)開放閱讀框，編碼一個(gè)多聚蛋白，通過蛋白 酶切割產(chǎn)生 10 個(gè)具有不同功能的成熟蛋白。從 5' 端到 3'端依次是：P1（First protein）、HC-Pro（Helper component-proteinase）、P3（Third protein）、6K1、CI （Cylindrical protein）、6K2、NIa（Nuclear inclusion body 'a' protein，包含 NIa-VPg 和 NIa-Pro 等 2 個(gè)蛋 白）、NIb（Nuclear inclusion body 'b' protein）、CP（Coat protein）。此外，P3 蛋白中核糖體滑移產(chǎn)生一個(gè)非 結(jié) 構(gòu) 性 蛋 白 ：PIPO（Pretty interesting potyviridae ORF）[2-5] 。

BCMV 的防治主要依靠抗病育種，菜豆針對(duì) BCMV 的抗性基因有 6 個(gè)，包括顯性抗病基因 I 和 隱形基因 bc-ud 、bc-1、bc-2、bc-3 和 bc-4[6-13] 。根據(jù) BCMV 分離株在不同遺傳背景的菜豆鑒別寄主品 種上的生物學(xué)反應(yīng)，將其分為8個(gè)致病型（pathogroup， PGs），為 PG-I～PG-VIII[7，14-15] 。 已 有 研 究 表 明 ， bc-1 和 bc-2 基因可能不會(huì)影響接種葉中的病毒復(fù) 制和胞間移動(dòng)，但它們可能限制病毒在植物中的遠(yuǎn) 距離運(yùn)輸，從而影響病毒的系統(tǒng)性移動(dòng)。對(duì)于大多 數(shù)分離株，2 個(gè)隱性基因（bc-1 和 bc-2）共同作用的 情況下對(duì) BCMV 分離株的抗性比單獨(dú)作用（bc-1 或bc-2）產(chǎn)生的抗性更有效[16] 。Vps4 AAA+ATPase ESCRT 蛋 白（Phvul.011G092700）為 bc-2 候 選 基 因 。 另 一 個(gè) Vps4 AAA+ATPase ESCRT 蛋 白 （Phvul.005G125100）被鑒定為新的隱性 bc-4 基因 的候選基因，bc-2 與緊密連鎖的 bc-4 或 bc-ud結(jié)合 后表現(xiàn)出不同的反應(yīng)[13] 。bc-3基因影響病毒的翻譯， 本質(zhì)為 eIF4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E）[10] 。bc-ud 和 bc-4 的基因功能尚不明確。目前 市場(chǎng)上的抗性品種多攜帶 1 個(gè)或多個(gè)抗性基因，深 入了解菜豆對(duì) BCMV 的抗病機(jī)制，可為分子抗病 毒育種提供有價(jià)值的參考。

植物為了應(yīng)對(duì)病原物的侵染，發(fā)展了多種防御 機(jī)制。防御策略包括對(duì)與新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋 白質(zhì)修飾和其他細(xì)胞功能相關(guān)的各種基因進(jìn)行差 異化調(diào)控[17-19] 。其中，植物激素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò) 占據(jù)著非常重要的地位。對(duì)生物脅迫的響應(yīng)主要 是由水楊酸（SA）、茉莉酸（JAs）和乙烯（ET）等植 物激素介導(dǎo)的，這些激素誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)[20] 。 建立植物局部或者系統(tǒng)獲得抗性（SAR）主要依賴 于水楊酸的積累[21] ，而誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR）的發(fā) 展伴隨著茉莉酸的積累[22] 。有研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序技術(shù)（RNA-sequencing）和后期的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)揭示 了 SA 響應(yīng)途徑參與了菊花對(duì)壞死營養(yǎng)真菌鏈格孢 菌防御的響應(yīng)[23] 。也有報(bào)道證實(shí)，SA 或 JA 的施用 誘導(dǎo)了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK3）防御基因的 表達(dá)，并增強(qiáng)了番茄對(duì)番茄黃卷葉病毒的抗性[24] 。

水稻被水稻矮縮病毒侵染后，其體內(nèi)的赤霉素 GA1 的含量變低并且赤霉素合成通路中的內(nèi)根-貝殼杉 烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）的表達(dá)水平下 調(diào)，GAs 積累的減少直接導(dǎo)致了 GA 調(diào)節(jié)細(xì)胞過程 的異常功能，從而誘導(dǎo)相關(guān)癥狀的產(chǎn)生[25] 。利用 ET 信 號(hào) 通 路 突 變 體 ein2（ethylene insensitive2）和 etr1（ethylene response 1）進(jìn)行的相關(guān)研究表明，去 除 ET 信號(hào)可以減弱 SA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制并啟動(dòng)植 物的防御反應(yīng)，從而使擬南芥對(duì)花椰菜花葉病毒侵 染的抗性增強(qiáng)[26] 。據(jù)報(bào)道，ABA 對(duì)多種病毒的侵 染 過 程 均 有 響 應(yīng)[27-29] 。 研 究 發(fā) 現(xiàn) ，經(jīng) 蕓 苔 素 內(nèi) 酯 （Brassinolide，BL）處理的野生型煙草對(duì)煙草花葉 病毒的抗性增強(qiáng)，并且 BL 誘導(dǎo)的抗性不同于系統(tǒng) 獲得抗性（SAR）和傷口誘導(dǎo)的抗病性[30] 。

我 們 在 菜 豆 田 間 樣 品 上 分 離 出 了 BCMV 株系 ，命 名 為 C54（GenBank Accession：OP828732）。

該株系可以系統(tǒng)侵染 Dubbele witte（簡稱 DW）菜豆 品種并產(chǎn)生皺縮、畸形、黃化等癥狀，但是不能系 統(tǒng)侵染 Redland's greenleaf C 品種（簡稱 RGLC；抗 性基因：bc-1）和 Sanilac 品種（抗性基因：bc-2，bc- 4）。以 C54 接種感性和不同抗性的菜豆材料為研 究對(duì)象，對(duì)病毒侵染植株及對(duì)照植株樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 組測(cè)序分析，明確 BCMV 侵染 DW、RGLC、Sanilac 菜豆品種后的接種葉和系統(tǒng)葉基因在轉(zhuǎn)錄水平上 表達(dá)的共性和差異。本研究進(jìn)行了感性及不同抗 性的菜豆品種被 BCMV 侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析，旨 在為進(jìn)一步解析不同菜豆品種對(duì) BCMV 的抗病機(jī) 制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物栽培和病毒接種

用于接種的毒株分離于山西晉中，經(jīng)過酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定及病毒序列擴(kuò)增測(cè)序確定為菜豆普通 花葉病毒，并將其命名為 BCMV-C54，在易感品種 DW 上進(jìn)行擴(kuò)繁，并保存于實(shí)驗(yàn)室。將菜豆易感品種 DW、抗性品種 Sanilac 和 RGLC 種植于人工智能氣 候箱（白天 16 h，30 ℃/晚上 8 h，24 ℃，20 000 lx）中， 待菜豆長至第 1 對(duì)真葉完全展開時(shí)，對(duì)其進(jìn)行病毒 接 種 ，接 種 前 在 葉 片 上 撒 0.002 5 mm 金 剛 砂 ，取 BCMV 染病組織加入磷酸緩沖鹽溶液（1.8 mmol/L KH2PO4 ，8.0 mmol/L Na2HPO4·12H2O，137.0 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl）進(jìn)行研磨，取研磨均勻后的 汁液對(duì) 2 片初生葉進(jìn)行摩擦接種。對(duì)照組使用磷 酸緩沖鹽溶液進(jìn)行處理。每組樣品進(jìn)行 3 次獨(dú)立 的生物重復(fù)。接種后所有植株安置于 26 ℃的溫室 （白天 16 h/晚上 8 h，20 000 lx）培養(yǎng)。14 d 后觀察 植株葉片癥狀。采用 Trizol 試劑（Biosharp，白鯊生 物公司）提取各植株系統(tǒng)葉片的 RNA，然后使用 MMLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit（北京博邁 德基因技術(shù)有限公司）合成第 1 鏈 cDNA，以 cDNA 為模板，使用 BCMV 特異性引物（表 1）進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增 。 PCR 反 應(yīng) 程 序 為 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2 樣片采集和測(cè)序

接種 14 d 后采集各組接種葉（in）和系統(tǒng)葉（s）， 在液氮中冷凍 1 h 后立即放入干冰箱中送往公司進(jìn) 行 RNA-sequencing 測(cè)序。測(cè)序委托北京百邁客生 物科技有限公司進(jìn)行。首先進(jìn)行總 RNA 提取，檢測(cè) RNA 樣品的純度、濃度和完整性，樣品檢測(cè)合格后， 進(jìn)行文庫構(gòu)建，主要流程包括：用帶有 Oligo（dT）的 磁 珠 富 集 真 核 生 物 mRNA，加 入 Fragmentation Buffer 將 mRNA 進(jìn)行隨機(jī)打斷；以 mRNA 為模板， 用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成第 1 條 cDNA 鏈 ，然 后 加 入 緩 沖 液 、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成第 2 條 cDNA 鏈，利用 AM? Pure XP beads 純化 cDNA；純化的雙鏈 cDNA 再進(jìn) 行末端修復(fù)、加 A 尾并連接測(cè)序接頭，然后用 AM? Pure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇；最后通過 PCR 富集得到 cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后，使用實(shí)時(shí)熒 光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）方法對(duì)文庫的有效 濃度（文庫有效濃度gt;2 nmol/L）進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以 保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，不同文庫按照目標(biāo)下 機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行 pooling，使用 Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 比對(duì)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到 Clean Data，與菜豆 參考基因組（Phaseolus vulgaris v2.1）進(jìn)行比對(duì)，得 到 Mapped Data，然后進(jìn)行生物信息分析。同時(shí)，將 測(cè)序結(jié)果與 BCMV-C54 基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到 病毒基因在各樣本中的的比對(duì)效率以及各基因比 對(duì)各樣本的 raw counts 數(shù)目。對(duì)樣品中的 Mapped Reads的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長度進(jìn)行歸一化，采用 FPKM （Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水 平的指標(biāo)。基于以下數(shù)據(jù)庫（非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù) 據(jù) 庫（Non-Redundant Protein Sequence Database， NR）、含 有 詳 細(xì) 注 釋 內(nèi) 容 的 蛋 白 質(zhì) 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 （Swiss-Prot）、基因本體論（Gene Ontology，GO）、蛋 白質(zhì)家族（Protein family，Pfam）、京都基因與基因組 百 科 全 書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge? nomes，KEGG）、直系同源蛋白簇（Cluster of Ortholo? gous Groups of proteins，COG）等）注釋基因功能。

1.4 差異表達(dá)分析及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)試驗(yàn)中的生物學(xué)重復(fù)使用皮爾遜相關(guān)性系 數(shù)作為評(píng)估指標(biāo)。r 2 越接近 1，說明 2 個(gè)重復(fù)樣品相 關(guān)性越強(qiáng)。使用 BMKCloud 平臺(tái)的差異表達(dá)基因 （DEG）分析工具進(jìn)行分析。對(duì)于有生物學(xué)重復(fù)的 樣 本 ，使 用 DESeq2 進(jìn) 行 樣 品 組 間 的 差 異 表 達(dá) 分 析，獲得 2 個(gè)生物學(xué)條件之間的差異表達(dá)基因集。

在差異表達(dá)基因檢測(cè)過程中，篩選標(biāo)準(zhǔn)為 FDR（錯(cuò) 誤發(fā)現(xiàn)率）lt;0.05，與對(duì)照相比，變化倍數(shù)大于等于 1.5 倍的基因用于分析[31] 。篩選后的差異表達(dá)基因 使 用 GO、KEGG 和 Pathway 途 徑 進(jìn) 行 富 集 分 析 。 以基因相對(duì)表達(dá)量 FPKM 值（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每 百萬映射讀取的片段）gt;0.1 的全部基因?yàn)楸尘埃?用北京百邁客生物科技有限公司云平臺(tái)的 WGCNA分析工具進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 總 RNA 提取及 qPCR 分析

通過菜豆或者近緣物種序列注釋選取了有代 表性的 8 個(gè)植物激素合成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基 因。在接種 14 d 時(shí)分別對(duì) DW 和 RGLC 病毒處理 組和健康對(duì)照組植株的系統(tǒng)葉片取樣，每組樣品進(jìn) 行 3 次獨(dú)立的生物重復(fù)。將上述采集的樣品在液 氮中研磨并使用 Trizol 試劑（Biosharp，白鯊生物公 司）提取總 RNA。然后使用 HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR（Vazyme Biotech Co.，Ltd.）合成第 1 鏈 cDNA。使用 ChamQ Univer? sal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech Co.， Ltd.）在 QuantStudio 平臺(tái)進(jìn)行植物激素相關(guān)基因 的 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（qRT-PCR）。

PCR 擴(kuò)增參數(shù)如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s 和 60 ℃ 15 s，共 40 個(gè) 循 環(huán) 。 使 用 IDT PrimerQuest Tool （https：//sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index） 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表 1。菜豆基因 Actin 作 為內(nèi)參基因用來歸一化基因表達(dá)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行 3 次技術(shù)重復(fù)。選擇基因的相對(duì)表達(dá)水平以 2-ΔΔCt 法進(jìn)行計(jì)算并且以平均值表示。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn) 偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCMV 侵染菜豆的鑒定

在 菜 豆 上 用 機(jī) 械 摩 擦 接 種 的 方 法 接 種 了 BCMV-C54，14 d 后觀察病毒侵染癥狀，如圖 1-A 所示，BCMV-C54 侵染 DW 后的葉片表現(xiàn)為花葉 和黃化。

在 菜 豆 未 摩 擦 接 種 的 上 部 葉 片 中 采 用 RTPCR 方法分析驗(yàn)證了病毒的積累量，如圖 1-B 可 知，在 C54 侵染 DW 的葉片組織中獲得了相應(yīng)的特 異性擴(kuò)增條帶，而在 C54 侵染 Sanilac 和 RGLC 的 葉 片 組 織 中 沒 有 獲 得 特 異 性 擴(kuò) 增 條 帶 ，說 明 BCMV 成功侵染感性品種 DW 但不能侵染 Sanilac 和 RGLC，可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.2 比對(duì)信息統(tǒng)計(jì)

為了研究感性以及不同抗性的菜豆與 BCMV 之間的互作機(jī)制進(jìn)行了 RNA-sequencing 測(cè)序，共 完成 36 個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，各樣品 Clean Data 均 達(dá)到 5.94 Gb，Q30 堿基百分比在 92.68% 及以上， 表明數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可用于后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。將過 濾后的reads與菜豆的參考基因組（Phaseolus vulgaris v2.1）進(jìn) 行 比 對(duì) ，總 體 比 對(duì) 的 百 分 比 為 76.90%～ 95.59%，唯一位置比對(duì)的百分比為73.33%～89.75%， 有 2.79%～8.66% 的 reads 比對(duì)到參考基因組多處 位置（表 2）。

2.3 病毒比對(duì)率分析

通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)到病毒基因組的 reads 數(shù)占樣品 總 reads 數(shù)的比例得到 BCMV-C54 在各樣本中的 積累量（表 2）。其中，感性品種的接種葉樣本中的 病毒積累量分別為 40.64%、44.64% 和 33.01%，而 系統(tǒng)葉中的病毒積累量整體高于接種葉，均為 50% 以上。Sanilac 與 RGLC 處理組接種葉和系統(tǒng)葉上 的 病 毒 積 累 量 有 明 顯 下 降 ，為 0.03%～8.84%。

RGLC 處 理 組 接 種 葉 的 平 均 病 毒 比 對(duì) 率 高 于 Sanilac 處理組接種葉，說明 RGLC 的接種葉病毒積 累量高于 Sanilac。在系統(tǒng)葉中，大多數(shù)的病毒處理 過 的 RGLC 和 Sanilac 樣 本 中 的 病 毒 積 累 量 很 少 （lt;0.1%），但是 Sanilac 的一個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本中 的病毒 reads 的比例約為 3.44%（T11）。

根據(jù) C54 各基因序列比對(duì)各樣本的 raw counts 數(shù)目可以看出，在接種后的 DW、Sanilac 和 RGLC 的接種葉和系統(tǒng)葉中，NIb 的積累量最多，然后依 次是 CI、CP、HC-Pro、P1、P3、NIa、VPg（表 3）。

2.4 差異表達(dá)基因篩選和分析

通過對(duì)樣品間進(jìn)行相關(guān)系數(shù)熱圖及數(shù)據(jù)分析， 將重復(fù)性差的樣品剔除（CK6、T3、T4），剔除后的 生物學(xué)重復(fù)樣品兩兩之間的 r 2 ≥0.845 5，表明樣品間 的相似度較高，生物學(xué)重復(fù)可靠，可進(jìn)行下一步分析。

本研究中，各處理組篩選到的上調(diào)和下調(diào)基因 如圖 2 所示。為了確定 C54 在 3 個(gè)不同菜豆品種上 引起的基因表達(dá)水平變化，利用維恩圖分析了差異 表達(dá)基因（圖 3）。在接種葉上，C54-DW 與 C54- RGLC 相較于 C54-Sanilac 有更多共同的差異表達(dá) 基因。其中，C54-DW、C54-Sanilac 存在 656（376+ 280）個(gè) 共 同 的 差 異 表 達(dá) 基 因 ，C54-DW 和 C54- RGLC 存在 1 618（1 242+376）個(gè)共同的差異表達(dá) 基 因 ，C54-Sanilac 與 C54-RGLC 存 在 527（376+ 151）個(gè)共同的差異表達(dá)基因。3 個(gè)品種特有的差異 表達(dá)基因分別為3 576、281、1 112個(gè)。而在系統(tǒng)葉上， C54-DW 與 C54-Sanilac、C54-DW 與 C54-RGLC、 C54-Sanilac 與 C54-RGLC 分別存在 221、220、66 個(gè) 共同的差異表達(dá)基因。3 個(gè)品種特有的差異表達(dá)基 因分別為 5 794、157、163 個(gè)。

結(jié)果顯示，差異基因表達(dá)發(fā)生變化數(shù)量的多少 與癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。C54 接種 RGLC 和 Sanilac 后在系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因較接種葉 少，并且 Sanilac 上的差異表達(dá)基因數(shù)量比 RGLC 少。而 C54 接種 DW 在接種葉片上引起的差異表 達(dá)基因比系統(tǒng)葉片上的數(shù)量少。

2.5 病毒侵染 3 個(gè)菜豆品種后的 DEGs 的 GO 富集 分析

對(duì) C54 侵染 3 個(gè)菜豆品種后引起的差異表達(dá) 基因進(jìn)行 GO富集分析（表 4）。本研究中的數(shù)據(jù)證實(shí)了被 BCMV 侵染后，菜豆的代謝途徑和基因表達(dá) 水平發(fā)生了很大的變化。在細(xì)胞組分這個(gè)分支中 DW 的接種葉和系統(tǒng)葉的差異表達(dá)基因分別顯著 性富集 33 個(gè)和 23 個(gè) GO term，主要集中于膜的組 成部分（GO：0016021）、質(zhì)體（GO：0009536）、葉綠 體（GO：0009507）、葉綠體類囊體（GO：0009534）、葉 綠 體 類 囊 體 膜（GO：0009535）、葉 綠 體 基 質(zhì)（GO： 0009570）、光合體系（GO：0009522、GO：0009523）。

抗性品種 Sanilac 被病毒侵染后引起的差異表達(dá)基 因顯著性富集在細(xì)胞骨架部分（GO：0044430）、肌 動(dòng) 蛋 白 細(xì) 胞 骨 架（GO：0015629）、胞 間 連 絲（GO： 0009506）、肌凝蛋白復(fù)合物（GO：0016459）。抗性品 種 RGLC 被病毒侵染后引起的接種葉上的差異表 達(dá)基因在細(xì)胞組分分支中顯著性富集 21個(gè) GO term， 為膜的組成部分、類囊體、葉綠體類囊體、光合體系、 細(xì)胞外基質(zhì)（GO：0031012）、質(zhì)外體（GO：0048046）， 系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因在細(xì)胞外基質(zhì)富集。

易感品種 DW 被病毒侵染后接種葉和系統(tǒng)葉 上引起的差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程方面主要富 集在光合作用-光捕獲（GO：0009765）、光合作用 （GO：0015979）、蛋白質(zhì)生色團(tuán)連接（GO：0018298）、 翻譯（GO：0006412）、脫落酸激活的信號(hào)通路（GO： 0009738）、葉綠素生物合成過程（GO：0015995）、肉 桂酸生物合成過程（GO：0009800）等 GO term。抗 性品種 Sanilac 被病毒侵染后在接種葉上的差異表 達(dá)基因在脫落酸激活的信號(hào)通路（GO：0009738）、 轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA 模板（GO：0006355）、RNA 生物合 成過程的調(diào)控（GO：2001141）等基因表達(dá)的調(diào)控方 面富集，系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因在對(duì)銅離子的響 應(yīng)（GO：0046688）顯著富集。抗性品種 RGLC 被病 毒侵染后在接種葉上的差異表達(dá)基因的富集結(jié)果 為光合作用-光捕獲、蛋白質(zhì)生色團(tuán)連接、光合作 用、葉綠素生物合成過程、肉桂酸生物合成過程等， 系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因的富集結(jié)果為 DNA 整合 （GO：0015074）以及基因表達(dá)的調(diào)控。

在分子功能方面，易感品種 DW 被病毒侵染后 接種葉和系統(tǒng)葉上引起的差異表達(dá)基因在蛋白激 酶 活 性（GO：0004672）、氧 化 還 原 酶 活 性（GO： 0016491）、葉 綠 素 結(jié) 合（GO：0016168）、多 糖 結(jié) 合 （GO：0030247）、ATP 結(jié)合（GO：0005524）、幾丁質(zhì) 結(jié)合（GO：0008061）、脫落酸結(jié)合（GO：0010427）等 GO term 顯著富集。抗性品種 Sanilac 被病毒侵染 后在接種葉上引起的差異表達(dá)基因在多糖結(jié)合、內(nèi) 肽酶抑制劑活性（GO：0004866）、RDDP 活性（GO： 0003964）等顯著富集，系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因在 多糖結(jié)合、FAD 結(jié)合（GO：0071949）、內(nèi)肽酶抑制 劑活性顯著富集，并且二者均有在水楊酸甲酯酯酶 活性（GO：0080031）和茉莉酸甲酯酯酶活性（GO： 0080032）富集。抗性品種 RGLC 被病毒侵染后在 接種葉上的差異表達(dá)基因在葉綠素結(jié)合、多糖結(jié) 合、蛋白激酶活性、單加氧酶活性（GO：0004497）、 鐵離子結(jié)合（GO：0005506）、脫落酸結(jié)合、ATP 結(jié) 合顯著富集，系統(tǒng)葉上的差異表達(dá)基因在多糖結(jié) 合、內(nèi)肽酶抑制劑活性顯著富集。

富集結(jié)果顯示，從細(xì)胞組分、生物學(xué)過程、分子 功能來看，在 BCMV 侵染后 DW 與 RGLC 接種葉 中差異表達(dá)的基因更為相似，多定位在光合體系， 富集于光合作用及光合作用相關(guān)，而 Sanilac 中的 差異表達(dá)基因多定位于細(xì)胞骨架和胞間連絲，富集 在生物合成過程和基因表達(dá)的調(diào)控。

2.6" 病 毒 侵 染 3 個(gè) 菜 豆 品 種 后 的 DEGs pathway 富集分析

KEGG 路徑可以幫助進(jìn)一步確定基因的生物 功能和相互作用[32] 。根據(jù)與 KEGG 數(shù)據(jù)庫的比較， 對(duì) Plt;0.01 的 KEGG pathway 進(jìn)行分析，選取富集 最顯著的前 20 個(gè)代謝通路，繪制 KEGG 富集氣泡 圖（圖 4）。C54 侵染 DW 后在接種葉和系統(tǒng)葉上引 起的差異基因共同顯著性富集在植物-病原物互作 （ko04626）、光合作用（ko00195）、光合作用-天線蛋 白（ko00196）、類胡蘿卜素生物合成（ko00906）、光合 生 物 中 的 碳 固 定（ko00710）、晝 夜 節(jié) 律 - 植 物 （ko04712）。C54 侵染 RGLC 后在接種葉上引起的 差異表達(dá)基因同樣在光合作用、光合作用-天線蛋白以及光合生物中的碳固定上富集，但是 Sanilac 的接種葉上引起的差異表達(dá)基因沒有在這方面富 集。2個(gè)抗性品種 Sanilac和 RGLC 接種葉上的差異 表達(dá)基因共同富集有植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）、 MAPK 信號(hào)通路-植物（ko04016）、植物-病原物互 作（ko04626）和異黃酮生物合成（ko00943）等代謝 途徑。晝夜節(jié)律-植物在 2 個(gè)抗性品種系統(tǒng)葉上的 差異表達(dá)基因中共同富集。病毒侵染后引起的花 葉癥狀可能主要與光合作用、光合作用-天線蛋白、 類胡蘿卜素生物合成等代謝途徑有關(guān)。

2.7 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA 主要運(yùn)用在大樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)， 從中挖掘出具有相似表達(dá)譜的基因，將這些基因 聚集在一起，歸于同一基因模塊（module），并探索 基因網(wǎng)絡(luò)與關(guān)注的表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，以及網(wǎng) 絡(luò)中的核心基因。本試驗(yàn)中，WGCNA 將全部基因 （FPKMgt;0.1）分成模塊，并將它們與表型相關(guān)聯(lián)。 這為不同抗性品種菜豆之間的差異研究提供了分 子基礎(chǔ)。一般取 R2 （相關(guān)系數(shù)）gt;0.8 或達(dá)到平臺(tái)期 時(shí)最小的 β 值（鄰接函數(shù)的參數(shù)）用于構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

從圖 5 可以看出，確定 β=5 的軟閾值（soft thresh? olding power）。共得到 12 個(gè)模塊。12 個(gè)模塊中大 部分呈負(fù)相關(guān)，但正相關(guān)的相關(guān)性高。功能分類表 明，C54RGLCin 與 MEcyan 的相關(guān)性為 0.84（顯著 性值為 1e?09），模塊中的關(guān)鍵基因主要是關(guān)于植物- 病原體互作、黃酮和黃酮醇的生物合成、亞油酸代 謝。亞油酸代謝包含 JA 生物合成，而黃酮醇作為 重要次生代謝物質(zhì)，其生物合成受 JA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的 調(diào)控。

2.8 qPCR 分析

為了明確植物激素相關(guān)基因在應(yīng)對(duì)病毒侵染 中的潛在功能，從病毒侵染感性品種 DW 和抗性品 種 RGLC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中選取了 8 個(gè)植物激素 合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的代表性基因的表達(dá)水平進(jìn) 行了 qPCR 驗(yàn)證。由圖 6 可知 ，這 8 個(gè)基因 qRTPCR 的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)趨勢(shì)一 致，說明該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可信度較高。其中， 在病毒侵染后，抗性品種和感性品種的系統(tǒng)葉中 AIM1、PAL、PR1、AOS、KO 的 mRNA 表達(dá)水平相 比于對(duì)照均上調(diào)，而 ETR1 和 DET2 在感性品種中 的表達(dá)水平略微上調(diào)，在抗性品種中的表達(dá)水平基 本沒有變化或者略微下調(diào)。ABF4 表達(dá)水平的變 化則相反，與對(duì)照相比，在感性品種中下調(diào)，在抗性 品種中上調(diào)。結(jié)果表明，植物激素合成以及信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)變化多樣。這 8 個(gè)基因在面對(duì) 病毒侵染時(shí)感性品種和抗性品種呈現(xiàn)出截然不同 的表達(dá)模式，這可能與它們?cè)谥参镏忻鎸?duì)病毒侵染時(shí)的生物學(xué)功能密切相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

為了明確易感和 2 個(gè)抗性品種在 BCMV-C54 侵 染 后 的 基 因 表 達(dá) 情 況 ，對(duì) 病 毒 接 種 的 DW、 RGLC、Sanilac 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本試驗(yàn)在病毒 接種后的第 14 天分別取對(duì)照組和病毒處理組的接 種葉和系統(tǒng)葉樣品進(jìn)行 RNA-sequencing，并對(duì)篩 選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO、KEGG Pathway富集分析和 WGCNA。從病毒比對(duì)率以及差異表 達(dá)基因來看，病毒的復(fù)制在 RGLC 接種葉上要比 Sanilac 接種葉稍活躍，并且病毒在系統(tǒng)性侵染 2 個(gè) 抗性品種時(shí)受到阻礙，可能是由于接種葉病毒的積 累量較少，不足以進(jìn)行長距離運(yùn)輸所導(dǎo)致的。抗性 基因在病毒侵染菜豆的過程中引發(fā)的防御機(jī)制可 能阻礙了病毒在接種葉上的復(fù)制，但具體原因尚有 待進(jìn)一步研究。

病毒基因表達(dá)量差異可能與其特異性功能相 關(guān)。蛋白功能通常是根據(jù)其他馬鈴薯 Y 病毒屬成 員的研究結(jié)果推測(cè)：P1 與病毒復(fù)制和癥狀表達(dá)有 關(guān)；HC-Pro 蛋白與蚜蟲的傳播與病毒積累相關(guān)； P3 與寄主癥狀表達(dá)有關(guān)；NIb、6K1 和 6K2 參與基 因組復(fù)制；VPg 和 CI 與病毒在細(xì)胞間的移動(dòng)有關(guān)； NIa 可協(xié)助病毒在細(xì)胞中進(jìn)行定位。病毒 RNA 的 復(fù)制和翻譯可以通過細(xì)胞中 CP 的數(shù)量來調(diào)節(jié)。病 毒在 CP 濃度較高的情況下，RNA 復(fù)制被抑制，而 當(dāng) CP 的濃度較低時(shí)，RNA 的積累和翻譯增強(qiáng)[33-36] 。

相 關(guān) 研 究 表 明 ，至 少 有 4 種 病 毒 蛋 白 ，即 P3NPIPO、CI、P3 和 CP 對(duì)于馬鈴薯 Y 病毒的胞間移動(dòng) 是必不可少的[37] 。從各基因比對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫結(jié) 果來看，NIb、CI 和 CP 的積累量最多，推測(cè)它們可 能 在 BCMV 的 復(fù) 制 和 胞 間 移 動(dòng) 過 程 中 起 關(guān) 鍵 性 作用。

差異基因表達(dá)模式的分析清楚地表明了病毒 侵染后特異性的宿主反應(yīng)。本研究對(duì)差異表達(dá)基 因進(jìn)行 GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，病毒處理后的易感品種 DW 以及 RGLC 接種葉與健康對(duì)照相比表達(dá)水平 變化明顯的基因主要定位于膜、葉綠體和葉綠體相 關(guān)，這可能與病毒誘導(dǎo)的癥狀表達(dá)相關(guān)。Sanilac 中 差異表達(dá)的基因主要定位于細(xì)胞骨架部分、肌動(dòng)蛋 白細(xì)胞骨架、胞間連絲，說明植物病毒侵染 Sanilac 后產(chǎn)生差異表達(dá)的基因可能與移動(dòng)運(yùn)輸有關(guān)。從 pathway 富集結(jié)果來看，病毒侵染 DW 可能抑制寄 主的光合作用相關(guān)代謝通路，同時(shí)類胡蘿卜素生物 合成也受到明顯的影響，說明光合作用途徑對(duì)植物 被病毒侵染響應(yīng)較為敏感。同時(shí)，黃酮和黃酮醇生 物合成、異黃酮生物合成等途徑多在 2 個(gè)抗性品種 富集，這是光合作用所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。這些 次生代謝產(chǎn)物可能與植物產(chǎn)生的抗性相關(guān)。早些 時(shí)候就有關(guān)于病原體侵染后光合作用途徑和各種 代謝活動(dòng)相應(yīng)變化的報(bào)道[38-40] 。植物在病毒應(yīng)激條 件下，細(xì)胞廣泛地調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)和能量的產(chǎn)生。光 合作用基因活性的降低可能與系統(tǒng)病毒傳播后的 黃化或綠色組織表面積減少有關(guān)。這種嚴(yán)格的代 謝調(diào)節(jié)對(duì)于病毒侵染期間的特定的防御機(jī)制至關(guān) 重要[41] 。抗性品種 Sanilac 的差異表達(dá)基因在晝夜 節(jié)律-植物通路極顯著富集，而該通路參與病原體 相 關(guān) 分 子 模 式（Pathogen-associated molecular pat? tern，PAMP）誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)[42-43] ，但與響應(yīng)細(xì)菌 和真菌的侵染不同，在植物中至今未識(shí)別到植物病 毒核酸的模式識(shí)別受體（Pattern recognition recep? tor，PRR），植物應(yīng)對(duì)病毒的第 1 層次免疫反應(yīng)為完 善且高度保守的 RNA 沉默（RNAi）機(jī)制，若 RNA 沉默被抑制，則病毒效應(yīng)子激發(fā)的 R 基因功能被激 活。有研究表明，與 C54RGLCin 相關(guān)性最高的基 因主要是關(guān)于植物-病原體互作與茉莉酸生物合成 及下游調(diào)控，RGLC 和 Sanilac 對(duì) BCMV 的抗性分 子機(jī)制可能并不相同。

植物被病毒侵染后會(huì)干擾植物激素的合成與 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同時(shí)，植物激素可調(diào)控病毒的復(fù) 制、裝配、移動(dòng)以及癥狀表達(dá)等多個(gè)方面。不同植 物激素之間通過協(xié)同或拮抗作用調(diào)控病毒脅迫反 應(yīng)[25，44-48] 。 從 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 和 qPCR 結(jié) 果 來 看 ， BCMV 侵染促進(jìn)了參與水楊酸合成通路的關(guān)鍵基 因 PAL（Phenylalanineammonialyase，苯丙氨酸解氨 酶）和 AIM1（花序分生組織異常基因）的正向調(diào)控。 這些基因的上調(diào)誘導(dǎo)了病程相關(guān)蛋白 PR1 的表達(dá) 增加。茉莉酸生物合成關(guān)鍵酶 AOS（丙二烯氧化 物合酶）和赤霉素合成通路中的 KO（ent-kaurene oxidase，內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶）同樣也在病毒侵染 后積極表達(dá)。乙烯受體 ETR1、油菜素內(nèi)酯合成過 程 的 關(guān) 鍵 限 速 基 因 DET2（DEETIOLATED2）以 及 ABA 響應(yīng)元件結(jié)合因子 ABF4（ABA-responsive elements binding factor 4）在抗感品種中的 mRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)不相同。不同的植物激素通過拮抗 或協(xié)同作用以響應(yīng) BCMV 對(duì)菜豆的影響。

不同抗性的菜豆被 BCMV 侵染后表現(xiàn)出了抗 性分子機(jī)制上的差異，而這些差異可能與 2 個(gè)抗性 菜豆品種不同的遺傳背景以及菜豆品種特異性有 關(guān)。在病毒侵染過程中，植物經(jīng)歷了基因表達(dá)水平 的變化。本研究結(jié)果增加了對(duì) BCMV 侵染菜豆后 的基因表達(dá)水平變化的理解，并為菜豆抗性基因功 能的研究以及菜豆對(duì) BCMV 的防御機(jī)制提供了理 論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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