骨科MRSA感染危險(xiǎn)因素分析及毒力耐藥基因檢測(cè)

蔡麗美 曹銀新

【摘要】 目的 探討骨科耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染危險(xiǎn)因素，檢測(cè)毒力、耐藥基因。方法 從2021年1月—2023年2月梅州市第二中醫(yī)醫(yī)院與梅州市中醫(yī)醫(yī)院骨科住院患者中，選取100例感染MRSA與100例感染甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive staphylococcus aureu，MSSA）的病例。收集2組患者的一般資料以及臨床資料，進(jìn)行單因素方差分析。將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，得出MRSA的感染危險(xiǎn)因素。對(duì)2組患者所有菌株進(jìn)行毒力、耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果 單因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組患者在年齡、基礎(chǔ)疾病數(shù)量、侵入性操作數(shù)量、確診前住院時(shí)間、抗感染藥物應(yīng)用數(shù)量和抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，年齡≥65歲、侵入性操作數(shù)量、抗感染藥物應(yīng)用數(shù)量≥2種、抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間≥7 d是MRSA感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MRSA組患者的細(xì)胞毒素毒力基因[α-溶血素（hla）、殺白細(xì)胞素（pvl）]、超抗原毒力基因[腸毒素（asea）、表皮剝脫素（eta）、中毒性休克綜合征毒素（tsst-1）]和耐藥基因mecA的陽(yáng)性檢出率均高于MSSA組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 對(duì)于高齡、接收侵入性操作多、抗菌藥物暴露多、應(yīng)用久的骨科住院患者，應(yīng)高度關(guān)注其MRSA的感染風(fēng)險(xiǎn)，早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，為患者爭(zhēng)取理想預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】 骨科；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；耐藥性

文章編號(hào)：1672-1721（2024）10-0092-04? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)：R446.5

金黃色葡萄球菌于1878年首次被Alexander Ogston發(fā)現(xiàn)，它是一種對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的致病菌，可引起人體各處感染，比如軟組織感染、骨髓炎、肺炎、菌血癥等，病死率約為80%[1]。青霉素在20世紀(jì)40年代被廣泛用于臨床后，產(chǎn)生了抗青霉素的菌株。到了20世紀(jì)60年代，大約80%的金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素產(chǎn)生了耐藥性[2]，給治療帶來(lái)了更多挑戰(zhàn)。美國(guó)超過(guò)50%被分離出的金黃色葡萄球菌為MRSA[3]。MRSA是當(dāng)前國(guó)內(nèi)醫(yī)院較常見(jiàn)的一種耐藥細(xì)菌，Meta分析顯示，MRSA的病死率明顯高于MSSA（OR=1.93，P=0.001）[4]。與MSSA相比，MRSA的感染會(huì)增加患者住院時(shí)間及治療費(fèi)用。了解MRSA的危險(xiǎn)因素并制定有效的防治方案，是目前臨床上最主要的控制方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2021年1月—2023年2月梅州市第二中醫(yī)醫(yī)院與梅州市中醫(yī)醫(yī)院骨科住院患者中，選取100例感染MRSA與100例感染MSSA的病例，分為MRSA組與MSSA組。MRSA組男性55例，女性45例；年齡19～79歲，平均（54.82±5.41）歲。MSSA組男性52例，女性48例，年齡18～78歲，平均（52.91±6.69）歲。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：入院48 h后發(fā)生感染或有植入物1年內(nèi)的感染；感染部位標(biāo)本進(jìn)行微生物培養(yǎng)鑒定為首次分離出MRSA菌株或MSSA菌株。

排除標(biāo)準(zhǔn)：微生物培養(yǎng)呈陽(yáng)性，但沒(méi)有局部或全身癥狀感染者；由外院轉(zhuǎn)入，收治時(shí)已發(fā)生感染者；臨床資料不全者；妊娠或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

對(duì)所采集的菌株進(jìn)行分離、鑒別，以常規(guī)方法與儀器檢驗(yàn)相結(jié)合的方式進(jìn)行鑒定。（1）常規(guī)方法。依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版[5]，菌株涂片革蘭染色呈陽(yáng)性，呈圓形、葡萄狀排列，觸酶、血漿凝固酶陽(yáng)性，而發(fā)酵甘露醇和β-溶血環(huán)判定為金黃色葡萄球菌。（2）儀器檢驗(yàn)。采用Vitek-2compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒別系統(tǒng)。MRSA鑒別，以肉湯微量稀釋方法進(jìn)行檢測(cè)，用頭孢西丁法測(cè)定金黃色葡萄球菌苯唑西林耐藥性。在33～35 ℃條件下，以質(zhì)量濃度為4 μg/mL的頭孢西丁作為試驗(yàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，按標(biāo)準(zhǔn)的肉湯稀釋方法培養(yǎng)細(xì)菌，16～20 h。最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）＞4 μg/mL判定為MRSA，MIC＜4 μg/mL為MSSA。

1.2.2 調(diào)查方法

依據(jù)制定的MRSA風(fēng)險(xiǎn)因子調(diào)查問(wèn)卷，對(duì)MRSA、MSSA病人的基礎(chǔ)及風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行回顧性調(diào)查。本研究將在梅州市第二中醫(yī)醫(yī)院與梅州市中醫(yī)醫(yī)院專業(yè)醫(yī)務(wù)人員的協(xié)助下進(jìn)行。以非匹配病例對(duì)照試驗(yàn)為基礎(chǔ)，探討MRSA醫(yī)院感染的危險(xiǎn)因素。主要收集信息有：（1）一般信息，包括年齡、性別、科室情況、住院號(hào)、入院診斷、標(biāo)本來(lái)源、采集時(shí)間等；（2）危險(xiǎn)因素，包括基本疾病（心腦血管疾病，糖尿病，腫瘤、結(jié)構(gòu)性肺病，肝腎功能不全）、侵入性治療（種類和數(shù)量）、抗生素的使用（暴露時(shí)間和數(shù)量）等。

1.2.3 靶基因檢測(cè)

在0.5 mL離心管內(nèi)預(yù)置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μL，并置入培養(yǎng)菌落，56 ℃水浴2 h，再95 ℃水浴10 min，15 000 r/min離心30 s。取上清液作為基因檢測(cè)模板液，并保存于-20 ℃冰箱中，使用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法進(jìn)行基因檢測(cè)，包括

2種細(xì)胞毒素毒力基因（hla，pvl）、2種超抗原毒力基因

（sea，eta、tsst-1）兩大類5種毒力基因和耐藥基因mecA。取每反應(yīng)體系P1引物1 μL（1.0 μmol/L）、P2引物1 μL（1.0 μmol/L），d NTPs 2 μL（2 mmol/L），10倍緩沖液2 μL[KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO4 8 mmol/L，MgCl2 2 mmol/L，Tris-HCl（pH 9.0）10 mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%]，Taq DNApol 1 U（不計(jì)體積），組成靶基因的PCR擴(kuò)增體系，加入模板液5 μL，超純水9 μL。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)按照以下步驟實(shí)施：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 30 s—55 ℃ 30 s—72 ℃ 60 s，共循環(huán)35個(gè)周期，在72 ℃下延長(zhǎng)至

5 min。試劑盒購(gòu)自無(wú)錫克隆遺傳技術(shù)研究所。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s表示，行t檢驗(yàn)，危險(xiǎn)因素使用多因素Logistic回歸分析，耐藥性數(shù)據(jù)用構(gòu)成比表示，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MRSA與MSSA感染的單因素分析

單因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組患者在年齡、基礎(chǔ)疾病數(shù)量、侵入性操作數(shù)量、確診前住院時(shí)間、抗感染藥物應(yīng)用數(shù)量和抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2組其他方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 MRSA感染的非條件Logistic多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，MRSA感染作為因變量，納入Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，年齡≥65歲、侵入性操作數(shù)量、抗感染藥物應(yīng)用數(shù)量≥2種、抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間≥7 d是MRSA感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

2.3 毒力及耐藥基因檢測(cè)

MRSA組患者的細(xì)胞毒素毒力基因（hla、pvl）、超抗原毒力基因（sea、eta、tsst-1）和耐藥基因mecA的陽(yáng)性檢出率均高于MSS組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

MRSA是一種常見(jiàn)的臨床傳染病，是全球公共衛(wèi)生范圍內(nèi)一個(gè)重大的治療難題。MRSA可分成兩大類型，即社區(qū)獲得性MRSA（community-acquired MRSA，

CA-MRSA）、醫(yī)院獲得性MRSA（hospital-acquired MRSA，HA-MRSA）。HA-MRSA的感染一般會(huì)因?yàn)椴≡w基因和耐藥基因的表達(dá)而產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性[6]。MRSA的發(fā)病趨勢(shì)、抗生素耐藥性的差異，以及CA-MRSA、HA-MRSA等感染的出現(xiàn)都會(huì)對(duì)抗生素的應(yīng)用和治療效果產(chǎn)生一定的影響。盡管近年來(lái)不斷有新的抗感染藥物被引進(jìn)，但MRSA依然是難治性耐藥細(xì)菌ESKAPE（糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，綠膿桿菌，腸桿菌）病原體的重要組成部分[7]。新的抗MRSA毒株活性和不易產(chǎn)生抗藥性的藥品開發(fā)日益受到重視。

本研究著重探討了年齡、基礎(chǔ)疾病、侵入性操作、確診前住院時(shí)間、抗感染藥物的應(yīng)用種類和時(shí)間等危險(xiǎn)因素。老年病人的免疫系統(tǒng)功能下降、抗感染能力下降，以及一些基礎(chǔ)疾病引起的機(jī)體機(jī)能紊亂、細(xì)胞免疫功能下降等，是導(dǎo)致MRSA感染的高危因素。本項(xiàng)目涉及的5種侵入性操作，包括動(dòng)靜脈插管、氣管插管、胃管留置、留置導(dǎo)尿和胸腔引流，均與MRSA感染相關(guān)。多因素分析顯示，隨著侵入性操作次數(shù)的增多，MRSA的檢出增加，可能是由于侵入性手術(shù)操作會(huì)對(duì)人體正常的機(jī)械防護(hù)屏障造成損害。國(guó)內(nèi)外已有相似的研究表明，侵襲性操作是MRSA感染的一個(gè)重要因素[8]。因此在進(jìn)行有創(chuàng)治療時(shí)，要謹(jǐn)慎權(quán)衡利弊，以免增加不必要的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果還表明，不同數(shù)量的抗感染藥物及接觸時(shí)間在MRSA和MASS患者中均有顯著差異，為MRSA感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。40.0%MRSA患者（40例）在治療過(guò)程中應(yīng)用了2種以上的抗感染藥物，而僅有8%的MSSA患者應(yīng)用了2種以上的抗感染藥物。已有研究也有相似的結(jié)果[9]，長(zhǎng)期服用多種類型的抗生素是MRSA感染的危險(xiǎn)因子。再次提醒人們要正確應(yīng)用抗感染藥物，避免濫用抗生素。加強(qiáng)對(duì)抗生素的合理應(yīng)用是防治MRSA的重要措施之一。

單因素分析結(jié)果顯示，MRSA與MSSA患者的暴露因素中，基礎(chǔ)疾病數(shù)量多在2組患者中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但Logistic回歸分析未見(jiàn)顯著性差異。已有研究表明，2種或2種以上的基礎(chǔ)疾病更容易發(fā)生MRSA感染[10]。該研究結(jié)果與本研究的差異很有可能是因?yàn)閷?duì)照組選取差異所致，本研究的對(duì)照組為MASS患者，而之前研究對(duì)照的患者為未感染MRSA人群。因此，基礎(chǔ)疾病數(shù)量作為MRSA感染的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，MRSA與MSSA組在確診前住院時(shí)間≥7 d這一因素中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而多因素分析結(jié)果顯示，該差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)椴≡w分離前治療時(shí)間和抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間這2項(xiàng)因素并不存在相關(guān)性，確診前住院時(shí)間越長(zhǎng)并不意味著抗感染藥物應(yīng)用時(shí)間越長(zhǎng)。

金黃色葡萄球菌細(xì)胞毒素可分為兩大類，一種是溶血素，包括hla、hlb、hld；hlg和hlg-2等；另一種是殺白血細(xì)胞素，包括pvl，lukE，lukM，psm-mec等。與MSSA相比，MRSA組的hla、pvl陽(yáng)性率明顯高，其他研究人員也有相似的發(fā)現(xiàn)。hla是一種具有293個(gè)氨基酸的親水蛋白，具有七聚體結(jié)構(gòu)，神經(jīng)節(jié)苷脂作為膜受體。而在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜中，幾乎都含有神經(jīng)節(jié)苷脂，從理論上講，它會(huì)對(duì)人體的各個(gè)器官造成損害[11]。PVL膜受體是神經(jīng)節(jié)苷脂/卵磷脂，幾乎所有哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上都含有神經(jīng)節(jié)苷脂/卵磷脂。研究人員在兔壞死性肺炎模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肺內(nèi)直接注入純化PVL后，可使肺組織發(fā)生趨化、溶解，對(duì)肺部造成損害。

在超抗原毒性基因方面，超抗原是一種具有免疫干涉作用的毒素。其作用機(jī)制是通過(guò)活化各種免疫細(xì)胞，使機(jī)體分泌大量的白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子、干擾素等，從而引起機(jī)體的免疫機(jī)能失調(diào)，主要表現(xiàn)為發(fā)熱，白細(xì)胞增多或減少，毛細(xì)血管內(nèi)皮受損，嚴(yán)重者還有彌散性血管內(nèi)凝血、中毒性休克綜合征、自身免疫疾病等表現(xiàn)。金黃色葡萄球菌的超抗原是一種有較強(qiáng)的非特異活化功能的特定抗原分子，能夠較高程度地活化特定類型的免疫功能，在不需要抗體提呈的情況下，宿主在第一次感染時(shí)就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，主要表現(xiàn)為食物中毒、中毒性休克綜合征、金黃色葡萄球菌灼熱綜合征，還有一些病癥會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期無(wú)法治愈，比如過(guò)敏性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮膚炎等。TSST-1也會(huì)引起胰島素抵抗和葡萄糖代謝障礙，但是檢測(cè)到的超抗原基因與死亡之間沒(méi)有明顯的關(guān)系。其他國(guó)家的研究也發(fā)現(xiàn)，在金黃色葡萄球菌MRSA中超抗原毒性基因sea、eta和tsst-1的表達(dá)水平明顯增高[12]。

綜上所述，對(duì)于高齡、接收侵入性操作多、抗感染藥物暴露多、應(yīng)用久的骨科住院患者，要高度關(guān)注其MRSA的感染風(fēng)險(xiǎn)，早發(fā)現(xiàn)，早干預(yù)，為患者爭(zhēng)取理想預(yù)后。

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（編輯：郭曉添）