類風濕關節炎中醫實驗動物模型研究進展*

張文瑞，楊爽，呂新亮

內蒙古自治區中醫醫院風濕科，內蒙古 呼和浩特 010000

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性、對稱性多關節炎為主要表現的進行性、侵襲性的自身免疫性疾病［1-3］。RA導致的滑膜炎持久反復發作，破壞關節軟骨及骨質，最終導致關節畸形及功能障礙，因此該病具有很高的致畸率［4-6］。RA屬于中醫“痹證”“鶴膝風”等范疇，中醫藥治療具有辨證論治、審證求因的特點，以其多途徑、多靶點、整合效應的優勢在RA的治療中發揮著日益重要的作用［7-11］，但中醫藥治療RA多缺乏明確的作用機制。動物模型作為實驗研究的基出，對開展疾病的發病機制及治療機制研究有著重要的意義。人體和疾病存在復雜性和不可控性，臨床證候研究中存在許多未知因素。若要開展證候形成機制及中藥作用機制的科學性研究，就必須構建具有中醫屬性的動物模型。本文擬對近年RA中醫證型動物模型進行綜述，以期為未來更全面的中醫證型動物模型提供參考。

1 中醫證型動物模型

徐成林等［12］結合新疆高寒地區的特點，模擬自然界的風寒濕環境，對健康家兔的后肢進行風寒濕痹證造模。造模選擇在冬季進行，將家兔后腿放入環境海綿的造模箱孔內，打開噴霧、水源，調節室溫控制在（7±2）℃；相對濕度為95%，風力5～6級，每天持續刺激造模部位5 h，持續刺激5天。造模后關節組織的滑膜細胞增生活躍、胞漿內含大量溶酶體、滑膜下有嗜酸性細胞浸潤、成纖維細胞活躍，與未造模的前腿有著顯著差異。但該實驗建立的動物模型為單純性關節炎模型，與人RA表現、客觀指標及病理變化存在一定的差異。

2 病證結合動物模型

模擬自然環境進行造模只能使模型在病因學上與人類相似，如何使模型的發病機制、發病過程、臨床癥狀、免疫特點與人類相似是建立RA中醫動物模型需解決的關鍵問題。病證結合的動物模型既有西醫疾病的診斷特征，又有中醫證候的病因病機及不同表現，成為目前RA中醫動物模型建立的首選方法［13-14］。RA國際中醫臨床指南［15］及RA病證結合診療指南［16］將RA辨證為風濕痹阻證、寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、痰瘀痹阻證、瘀血阻絡證、氣血兩虛證、肝腎不足證、氣陰兩虛證。目前多見的造模證型也是圍繞以上證型開展。而RA模型的建立多選擇佐劑型關節炎模型（adjuvant arthritis，AA）及膠原型關節炎模型（collageninduced arthritis，CIA）［17-20］。

3 RA模型

3.1 AA模型 AA大鼠造模方法是將含減毒卡介苗的弗氏佐劑注射至足趾關節皮下，導致局部免疫炎癥反應，形成免疫復合物，刺激T細胞激活、分化、增殖，模擬RA免疫炎癥病理變化反應過程，發揮特異性免疫反應效應。AA模型發病過程同時涉及細胞免疫反應及體液免疫反應，累及部位不僅限于關節，同時可見心、肺、免疫器官等多系統受累表現，臨床、病理等方面與RA極為相似［21-23］。劉磊等［24］研究發現，AA大鼠同時也存在血小板病變。劉琪等［25］研究發現，AA模型同時受到性別的影響，雌性SD大鼠體質量下降程度高于雄性SD大鼠；而踝關節病理評分、脾臟評分均高于雄鼠。

3.2 ClA模型 1977年Trentham等首先建立了Ⅱ型膠原誘導性關節炎模型［26］。該模型的兩個重要特征是破壞耐受性及產生自身和膠原自身抗體，因其在免疫機制、關節病理改變、臨床表現和實驗室指標上與人類RA最為相似［27-28］，CIA成為RA研究的金標準［29-30］。CIA模型還具有操作簡單、病變持續時間較長、滑膜增生及軟骨破壞等繼發性病變特征明顯、造模成功率高等特點，因此CIA在科研實驗中被廣泛應用［31-32］。

CIA模型常用牛Ⅱ型膠原蛋白（calf Ⅱ collagen，CⅡ）分別與不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）或完全弗氏佐劑混合（complete Freund's adjuvant，CFA）乳化以制備［33-34］。筆者通過查閱文獻發現，完全弗氏佐劑應用更為廣泛。但郭帥［35］比較CⅡ聯合兩種佐劑制備CIA大鼠模型發現，CⅡ+IFA模型不良反應更小，更適合作為大量復制的CIA動物模型。制備CIA模型時需先將CⅡ與等體積的IFA或CFA在4 ℃無菌條件下充分混勻乳化，配制溶液濃度為1 g/L（即1 mL溶劑含有CⅡ 1 mg），隨后對造模動物進行皮內免疫注射，選擇多個位置多次少量注射，總量約為200 μL，此為初次免疫；7天后以同樣方案于不同部位100 μL加強免疫1次［36］。

3.3 病證結合模型

3.3.1 風、寒、濕痹病證結合動物模型 《素問·痹論》篇云：“痹之安生？風、寒、濕三氣雜至，合而為痹也?！憋L、寒、濕是導致痹證的重要因素。呂愛平等［37］采用冷水游泳聯合Ⅱ型膠原建立風寒濕痹大鼠模型。首先將大鼠放入15 ℃的冷水中游泳7 min，每日1次，連續7天，隨后取1.5 mg/mL的Ⅱ型膠原粗提取物的乳化混合物0.125 mL于大鼠尾部、踝部多處皮內注射，每只動物注射1次，含Ⅱ型膠原粗提取物約0.18 mg。造模動物病理變化呈滑膜受損期和軟骨損傷期，45天后造模關節病理可見大量成纖維細胞，甚至出現軟骨下骨細胞變性、壞死。

肖長虹等［38］認為，呂氏造模方法僅有炎癥浸潤程度的病理觀察，而未對臨床表現的差異進行報道。其用0.1 mL冰醋溶解2 mg/mL的Ⅱ型膠原，與等體積的IFA混合后再加入3 mg/mL卡介苗研磨、乳化成膠原，每只大鼠于尾部、頸背部皮內多點注射膠原共500 μg；7天后再于尾根部及背部皮內注射膠原200 μg進行加強免疫。大鼠從接受第1次膠原注射開始，每天于造模箱中接受風、寒、濕刺激1次，每次1 h，刺激條件為風速18 m/s，相對濕度100%，溫度7～10 ℃，共刺激9天。第7～9天時每只鼠雙后肢踝關節以下均勻涂抹纖維素糊各30 μg（含葡萄球菌腸毒素B 5 μg），即每只鼠每次外涂SEB 10 μg，再進行風、寒、濕刺激。造模后模型組炎癥積分顯著增加，炎癥關節表面溫度顯著降低，與中醫證型的臨床表現類似。

魏艷霞［39］在前期研究中制作了規范、可控的風、寒、濕造模裝置——人工智能氣候箱，并明確優化了風、寒、濕刺激條件及刺激時間。其選用SPF級雄性大鼠放入特制的人工氣候造模箱（上海汗諾PRX-150B）中接受風、寒、濕刺激14天，每天1次，每次4 h，條件為風速5 m/s，濕度90%～95%，溫度0～2 ℃。第15天大鼠尾根部皮下注射0.1 mL含200 μg熱滅活菌結核桿菌（Mtb）的CFA誘導佐劑型關節炎（adjuvantinduced arthritis，AIA）模型，繼續風寒濕刺激30天。造模成功后大鼠出現精神萎靡、畏寒喜暖、飲食飲水量減少、大便質稀，耳緣有風濕結節、舌質紫黯、舌底絡脈曲張、尾根部潰爛等。與RA的AIA大鼠模型相比，受風、寒、濕刺激的大鼠足腫脹容積明顯增加，平均發病時間提前，病理程度明顯加重，實驗后期殘疾率明顯上升。

朱興旺［40］認為，目前風、寒、濕痹模型多集中在模型與人類RA病理過程、寒痹證的相似相符程度及中藥方證研究上，而較少關注風、寒、濕等外界環境的致病實質及其激發、加劇關節炎的致病機制。因此朱興旺的研究以CIA大鼠為基出，探討風、寒、濕對中醫證候的影響及致病實質。實驗選擇SPF級SD大鼠，每只大鼠于尾根部注射0.2 mL雞Ⅱ型膠原+CFA乳劑做首次免疫；第7天加強免疫。于加強免疫后接受人工氣候箱風、寒、濕干預，條件為：溫度8 ℃，濕度90%，風速5 m/s，每天2次，每次2 h，共64 h。造模后大鼠AI值于首次免疫后28天左右時達到峰值，紅腫消退率與普通模型組無差異。風、寒、濕組大鼠踝關節基本無組織腫脹，有較明顯的骨侵襲，但仍有關節間隙。朱興旺［40］認為，受風、寒、濕環境刺激的CIA大鼠未能模擬出人類RA寒痹證型的證候特點。

3.3.2 風濕熱痹病證結合動物模型 肖長虹等［38］建造風、濕、熱痹病證結合動物模型與風、寒、濕痹模型相似，即接受膠原免疫刺激后在造模箱中接受風濕熱造模刺激。條件為：風速18 m/s，相對濕度100%，溫度36～38 ℃，刺激9天。7～9天時同樣予纖維素糊各30 μg（含葡萄球菌腸毒素B5 μg）于雙后肢踝關節以下，再予風、濕、熱刺激。造模結束后模型動物炎癥關節99mTc含量顯著增加，炎癥關節表面溫度升高。

梁江洪等［41］使用0.1 mL/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原蛋白，配置成4 mg/L的溶液，再按1∶1體積與弗氏不完全佐劑混合、振蕩并充分乳化，制成CⅡ乳劑。選擇SPF級雌性Wistar大鼠，于頸、背、尾部多點皮內注射CⅡ乳劑0.25 mL致炎，并于7天后按上述方法再次免疫。大鼠于首次免疫后開始在自制造模箱內接受風濕熱刺激，每天1 h，條件為：風速5 m/s，相對濕度90%，溫度（37±1）℃。造模后大鼠關節表面溫差顯著增高、關節炎癥指數及TNF-α、IL-1β顯著升高。

朱興旺等［42］使用SPF級SD大鼠建立風、濕、熱痹模型，每只大鼠于尾根部注射0.2 mL雞Ⅱ型膠原+CFA乳劑做首次免疫；第7天加強免疫。于加強免疫后接受人工氣候箱風、寒、濕干預，條件為：溫度36 ℃，濕度90%，風速5 m/s，每天2次，每次2 h，共64 h。造模結束后大鼠AI值于首次免疫后19～21天時達到峰值，最高為11分，峰值可維持10天左右，紅腫消退率最慢，至觀察期結束時仍能觀察到后肢關節腫脹，AI約為4分。且踝關節有輕度軟組織腫脹、嚴重骨侵襲，關節基本融合，評分較普通模型組顯著增高。該研究結果表明，較長時間的風、濕、熱刺激能使CIA大鼠關節紅腫程度加重，并使其炎癥峰值提前、持續時間延長，結束環境刺激后關節炎癥狀緩慢消退。同時CIA大鼠的基出屬性為熱，風、濕、熱刺激能加重熱證表現，與臨床上熱痹“遇熱加重，遇寒減輕”說法一致，且風濕熱的刺激可以模擬人類RA熱痹發病過程，其致病機理可能與上調HSP-70有關。

3.3.3 內生痰濕病證結合動物模型 周游［43］選擇SPF級雄性DBA/1小鼠，先予高脂飼料連續喂養4周，然后在小鼠尾根部皮下多點注射0.2 mg/只Ⅱ型膠原溶液與等體積CFA混合乳化的CIA佐劑。首次免疫當天記為第1天，第21天以0.1 mg/只劑量于小鼠尾根部皮下多點注射激發免疫。造模后痰濕CIA小鼠身體劇烈顫抖、瞇眼遲鈍不喜動、弓背、大便質稀。與正常組相比，痰濕CIA小鼠肥胖指數差異明顯，關節AI指數增長迅速；關節組織病理可見關節面粗糙、大量的炎性細胞浸潤與融合，血管翳布滿關節間隙。

3.3.4 痰瘀痹阻病證結合動物模型 唐先平［44］使用雌性SPF級SD大鼠建立痰瘀痹阻證動物模型。首先取無水羊毛脂40 mL、液體石蠟60 mL高壓消毒后按8 mg/mL加入滅活卡介苗，制成完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，FCA）。第1周大鼠單日喂飼甘藍，10～15 g/只，雙日灌喂精煉豬油4 mL/只，第8天于每只大鼠右后跖皮下注射0.1 mLFCA，每只動物只注射1次。其后繼續予高脂飼料喂養。造模后大鼠出現體毛無光澤、畏寒蜷縮、懶動、進食減少、時有溏便，舌根部出現厚膩苔和舌質紫暗，并伴有足跖腫脹、近端趾間關節及其他肢體關節腫脹，耳部及尾根部出現紅斑及/或結節。痰瘀痹阻證大鼠出現t-PA上升、PAI下降的趨勢，證明該模型影響到血凝纖溶系統，出現高凝（即血瘀）狀態。

3.3.5 血瘀證病證結合動物模型 李茜等［45］認為，RA皮下結節或瘀斑是久病瘀阻經絡，脈絡不通之象，故以雌性SD大鼠在Ⅱ型膠原誘導的CIA關節模型的基出上，結合長期小劑量注射鹽酸腎上腺素和4 ℃冷水應激的方法，建立RA血瘀證動物模型。首先將一定量Ⅱ型膠原蛋白溶解于0.1 mol/L的乙酸中，使其濃度為1 g/L，再與等體積的CFA溶液混合并完全乳化。初次免疫時將此乳化劑按0.75 mL/kg注射于模型組大鼠右側膝關節腔、足跖皮內、背部及尾部，同時以腎上腺素注射液0.1 mg/kg皮下注射大鼠，2 h后置于4 ℃冷水中游泳5 min，連續14天，初次免疫后14天再按0.5 mL/kg劑量再次注射乳化劑于大鼠背部及尾根部皮下以加強免疫。造模后大鼠日漸畏寒喜暖、蜷縮少動、尾爪紫暗、膝關節、足趾、踝關節紅腫、屈伸不利、活動受限，舌質紫暗或見瘀點。造模第4天足趾即出現腫脹，第24天達到高峰，伴血清RF、TNF-α、TX-A2濃度增高；全血黏度及血漿黏度均高于正常組；膝關節軟骨表面不光整，淺表層可見增生纖維化，部分可見裂紋；軟骨全層細胞減少，細胞排列紊亂，分布不均，部分細胞核壞死，部分軟骨陷窩消失；軟骨基質染色淺且不均勻；潮線模糊、不規則，附近有血管穿過，且軟骨組織Mankin's評分較正常組增高。

3.3.6 脾虛證病證結合動物模型 杜中平等［46］采用腹腔注射利血平聯合CIA建立RA脾虛證動物模型。選擇SPF級SD大鼠，給予利血平0.5 mg/（kg·d）腹腔注射［47］，14天后于尾根部皮下注射乳化后的混合物（2 mg/mL牛Ⅱ型膠原加入等容積不完全弗氏佐劑中，使牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL）0.2 mL/只，即 200 μg牛Ⅱ型膠原/只，7天后按0.1 mL/只，即100 μg牛Ⅱ型膠原/只，于尾根部皮下加強免疫1次。造模后大鼠出現精神萎靡，瞇眼，背毛枯疏無光澤，弓背蜷縮，踝關節紅腫，倦怠、懶動，喜聚堆，飲食減少，體質量下降，稀便。大鼠回腸病理示小腸絨毛排列紊亂，數量減少，長短、寬窄不一，被覆上皮可見有多量杯狀細胞，腸腔內可見大量剝脫、退變、壞死的絨毛碎片。壞死組織內見有炎性細胞浸潤，腸腔內可見剝脫。與正常對照組相比，造模組大鼠T細胞增殖能力和LPS刺激后B細胞增殖能力明顯升高，外周血CD4/CD8明顯升高、CD3+細胞、CD4+細胞明顯下降，關節腫脹度與關節病理損傷程度加重，抗Ⅱ型膠原抗體、IL-10水平升高。因此該模型既有明顯的脾虛癥狀，又有RA的特征。

3.3.7 腎虛證病證結合動物模型 趙宏艷等［48］建立羥基脲致腎虛RA大鼠模型及去勢致腎虛RA大鼠模型。具體如下：去勢腎虛組選擇SPF級SD大鼠，摘除雙側卵巢，術后28天于尾根部皮下注射乳化后的混合物（2 mg/mL牛Ⅱ型膠原加入等容積不完全弗氏佐劑中，使牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL）0.2 mL/只，即200 μg牛Ⅱ型膠原/只，7天后按0.1 mL/只，即100 μg牛Ⅱ型膠原/只，于尾根部皮下加強免疫1次。羥基脲腎虛模型予羥基脲375 mg/（kg·d）灌胃，灌胃17天后按上述方法進行CIA模型復制。兩種造模方法均可使大鼠出現關節紅腫、變形、活動減少，弓背蜷縮、體毛枯疏、扎堆及飲食減少、肛周污穢等，與人類腎虛證候相似，且能升高大鼠關節腫脹度，降低IL-6含量、升高IL-10及INF-γ含量，但去勢組INF-γ含量高于羥基脲組。因此趙宏艷等［48］認為去勢法建立的腎虛RA模型優于羥基脲腎虛模型。

目前尚無文獻對RA氣血兩虛證、肝腎不足證、氣陰兩虛證的造模方法進行詳細論述。

4 病病結合動物模型

RA是一種易致殘的自身免疫性疾病，關節反復疼痛及功能障礙不僅影響患者的生理健康，還會影響患者的心理健康［49-50］。研究表明，RA患者抑郁癥的發病率為32.7%～55.4%，但只有11.7%的患者接受了抗抑郁治療［51-52］。我國RA伴發抑郁癥的發病率高達44.7%，高于全球平均水平［53-54］。RA伴發抑郁癥發病機制尚不明確，因此建立一個可靠的動物模型將對研究RA伴發抑郁癥起到重要的作用。

鄭琴［55］認為，RA伴發抑郁癥的病機為肝腎虧虛，以腎虛為要，同時伴有瘀阻脈絡，因此采用膠原誘導聯合慢性輕度不可預見性應激復合孤養制備RA伴發抑郁癥大鼠模型。首先制備CIA大鼠模型。將牛Ⅱ型膠原溶解于乙酸，此溶液與等量的CFA混合，制備成牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL的混合物，并將其充分乳化，取此混合物于大鼠左足底皮下按0.1 mL/只注射，共含Ⅱ型膠原100 ug/只。其后將大鼠單籠孤養飼養7天后，再予21天的慢性不可預知的溫和應激，包括：將大鼠予以夾尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45 ℃環境5 min、晝夜顛倒24 h、水平振蕩30 min（160次/min）、4 ℃冰水游泳5 min的7種方法刺激。大鼠每天接受1種刺激，連續3周。造模后大鼠呆滯少動、飲食減少、體質量明顯減輕。大鼠關節腫脹度、關節炎癥指數明顯高于正常組。大鼠踝關節滑膜形態學見滑膜組織充血、水腫，滑膜細胞排列不規則，可見炎性細胞浸潤及纖維組織增生，有血管翳形成，有軟骨和骨質破壞模型組滑膜組織高度增生、充血、水腫，有豐富的血管翳形成，細胞排列不規則，可見大量炎性細胞浸潤。且伴有5-HT、NA、DA、5-HIAA的降低，證明下丘腦單胺類神經遞質的下降。

石磊［56］認為，細胞因子IL-27、IL-17和IL-10可能在RA伴抑郁癥發病中起了重要的作用［57-58］。同樣他采取在CIA大鼠模型基出上聯合慢性不可預知溫和刺激抑郁癥模型建立RA共病抑郁癥復合模型，并參考改進Fu［59］的CIA造模方法，雌性Wistar大鼠尾根部皮下注射100 mg含4 mg/mL變性分枝桿菌的牛Ⅱ型膠原（用等體積的CFA充分乳化）并壓迫使乳化液充分吸收。在CIA誘導關節炎模型基出上，將大鼠單籠孤養7天后，再給予21天慢性不可預知的溫和刺激。石磊［56］建立抑郁癥的慢性不可預知溫和刺激方法參考改進WANG等［60］的方法：夾尾1 min，禁水、禁食24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°傾斜鼠籠24 h，水平震蕩20 min（頻率80次/分），閃光刺激（頻率3次/分），電擊（電流強度1.0 mA，頻率1次/分）。大鼠每天接受1種刺激，7天為1個周期，連續刺激3個周期。造模后4天大鼠出現始發于后足的對稱性、多關節紅腫，后期可見關節強直、功能障礙，并伴有蜷縮少動，毛發粗糙、無光澤，膽小易驚，體質量減輕，同時出現飲用糖水量減少、曠野試驗刺激水平評分下降，IL-27、IL-17和IL-10水平升高等表現。

5 展望

由目前研究可見，目前RA中醫動物模型研究熱點集中在病證結合動物模型，尤其是風寒濕熱痹證模型［61-63］，但這些動物模型多是單純的西醫的“病”及中醫的“證”的疊加，模型制作方法簡單，并未從本質上探索病和證的關系，也未考慮到遺傳因素及體質因素對中醫證候的影響。且對于造模動物的選擇各家也各執一詞，雖多選擇大鼠CIA模型，但也有對雌雄大鼠的不同選擇體現激素和干預條件耐受性的不同，缺乏統一、明確的標準。

由于RA的復雜性及中醫證型的多樣性，動物模型僅能代表病證的某些方面；隨著研究目的的不同，所需的動物模型也不盡相同。因此還應該進行進一步的探索，以期能建立真正符合中醫證型、體現中醫精髓的RA中醫動物模型。