?煙草花葉病毒（TMV）免疫誘抗劑的制備與驗證?

摘要：為了制備煙草花葉病毒（TMV）免疫誘抗劑，研究采用殼寡糖、高錳酸鉀、內生真菌發酵液、紫外線、銀杏葉提取物等試劑處理，篩選出TMV弱毒/無毒株系制備的最優方法，并在室內開展免疫激活效應。結果表明：紫外線、0.1%高錳酸鉀溶液、內生真菌發酵液16倍濃縮液、100 μg/mL殼寡糖溶液對TMV表現出良好的鈍化效果，鈍化液對TMV有較高的抑制率。鈍化TMV能引起煙草多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）5種防御酶活性顯著升高，從而提高煙株對TMV感染的抗性。煙苗和大田煙葉TMV防控試驗也證明鈍化TMV在煙葉生產中可以作為TMV免疫誘抗劑使用，提高煙株的TMV免疫力和抵抗力。

關鍵詞：TMV；免疫誘抗劑；鈍化；防御酶；防控效果

中圖分類號：S432.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）04-0072-05

Development and Verification of Immunity Inducers Against Tobacco Mosaic Virus （TMV）

ZHOU Xiang-ping1，DENG Zheng-yu1，XU Qing-xiao1，ZHOU Li1，GUO Jun1，PAN Xian-jiang1，LI Cai-hua1，YUAN Zhi-hui2，3

（1. Yongzhou Company of Hunan Tobacco Company， Yongzhou 425000， PRC; 2. College of Chemistry and Bioengineering，"Hunan University of Science and Engineering， Yongzhou 425199， PRC; 3. Hunan Provincial Engineering"Research Center for Ginkgo Biloba， Yongzhou 425199， PRC）

Abstract：To develop immunity inducers against tobacco mosaic virus （TMV）， chitosan oligosaccharide， potassium permanganate （0.1% solution）， endophytic fungi fermentation broth （16-fold concentrated solution）， ultraviolet （UV） rays， Ginkgo biloba extract， and other reagents were employed to ascertain the optimal method for cultivating attenuated/nontoxic strains of TMV. Subsequently， the immunity-activating effect of the developed inducer was evaluated in controlled indoor conditions. The results showed that UV rays， 0.1% potassium permanganate solution， 16-fold concentrated solution of endophytic fungi fermentation broth， and 100 μg/mL chitosan oligosaccharide solution exhibited pronounced passivation effect on TMV， leading to a substantial reduction in TMV activity. Furthermore， the passivation of TMV significantly increased the activities of five defense enzymes， namely polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， phenylalanine ammonia lyase （PAL） and catalase （CAT）， thus improving the resistance of tobacco plants against TMV infection. The prevention and control experiments on TMV-infected tobacco seedlings and field-grown tobacco leaves proved that passivated TMV can be used as the immunity inducer in tobacco production to improve the immunity and resistance of tobacco plants against TMV.

Key words： tobacco mosaic virus （TMV）; immunity inducer; passivation; defense enzyme; prevention and control effect

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬的代表種，是研究最廣泛的病毒之一。TMV有非常多的寄主，可侵染包括30個科的310多種植物[1]，其中包含多種重要經濟作物，危害較為嚴重，目前尚無有效防治措施[2]。利用植物免疫誘抗劑控制農作物病蟲害是植物保護的新思路、新途徑[3-4]，目前尚沒有直接利用煙草花葉病毒顆粒對該病害進行免疫抗性誘導的研究，因此開展TMV免疫誘抗劑的制備研究具有十分重要的意義。

研究以制備植物免疫誘抗劑為目的，用殼寡糖、高錳酸鉀、內生真菌發酵液、紫外線、銀杏葉提取物作為TMV鈍化劑，篩選出TMV弱毒/無毒株系制備的最優方法，在室內開展免疫激活效應及防控效果驗證；同時通過測定TMV弱毒/無毒株系處理植株的多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化氫酶（CAT）的活性，開展TMV弱毒/無毒株系對煙草的免疫激活效應機理研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼寡糖、銀杏葉提取物購自麥克林公司，多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解酸酶（PAL）和丙二醛（MDA）的活性檢測試劑盒購自索萊寶公司，內生真菌發酵液為自制的銀杏內生球黑孢菌發酵液[5]，湘煙5號種苗由湖南煙草公司提供，2%氨基寡糖素水劑、2%香菇多糖水劑、0.06%甾烯醇微乳劑、8%辛菌胺醋酸鹽水劑、3%超敏蛋白微粒劑、20%嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑、6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑從農資市場購買。試驗于2023年4—7月在湖南科技學院作物病蟲害防控實驗基地進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 TMV的提取與活性檢測 TMV顆粒的提取參照Gooding等[6]的方法，并略作修改。稱取新鮮病葉（去主、側葉脈），按w/v＝1∶2加入0.02 mol/L、 pH值7.4的 PBS，勻漿（加入石英砂和液氮研磨20 min）；4層紗布過濾，得初提液；每100 mL初提液中加入8 mL正丁醇，磁力攪拌15 min；4 ℃、10 000"r/min離心30 min，留上清液；每100 mL上清液中分別加入4 g聚乙二醇（PEG，分子量 6 000 Da）和氯化鈉，磁力攪拌使其充分溶解，靜置1 h；4 ℃、10 000 r/min離心20 min，留沉淀；按每100 mL原液所得的沉淀加入20 mL PBS（0.01 mol/L，pH值7.4）懸浮沉淀，4 ℃下過夜；4 ℃、10 000 r/min離心15 min，留上清液；每100 mL上清液中分別加入4 g聚乙二醇和氯化鈉，磁力攪拌使其充分溶解，靜置1 h；

4 ℃、10 000 r/min離心15 min，留沉淀；按每100 mL

原液用2 mL PBS（0.01 mol/L，pH值7.4）將沉淀溶解，4 ℃下過夜；4 ℃、10 000 r/min離心20 min，留上清液，乳白色病毒懸浮液即為粗提純的 TMV；將粗提純的TMV稀釋至適宜濃度，測其紫外吸收光譜，根據其在260 nm處光譜吸收值，按照公式（1）計算病毒濃度（mg/mL），并將粗提純的TMV分裝于滅菌后的小離心管中，加入30%甘油，-80 ℃保存。

病毒濃度= （A260×稀釋倍數）/3.1 " "（1）

用稀釋好的粗提純TMV懸浮液以石英砂摩擦的方式接種于心葉煙上，5ｄ后觀察出現的枯斑，檢測其感染活性。

1.2.2 TMV的鈍化與鈍化效果檢測 鈍化劑：100、300、500 μg/mL的殼寡糖溶液，內生真菌發酵液的原液、16倍濃縮液，0.1%高錳酸鉀，100、500、1 000

μg/mL的銀杏葉提取物溶液。TMV鈍化處理：分別取等體積的鈍化劑與240 μg/mL的病毒溶液按1∶1等比例混合成不同的鈍化TMV溶液。陰性對照溶液：取與鈍化劑相同體積pH值7.4、0.1 mol/L PBS緩沖液與240 μg/mL病毒溶液按1∶1等比例混合。TMV鈍化效果檢測：將鈍化TMV溶液于25 ℃分別置30、60、120 min后，取等量TMV鈍化溶液摩擦接種于心葉煙左右半葉上，每個處理接種3片葉；取與TMV鈍化溶液等量的陰性對照溶液，按相同的方法接種3片葉；待出現明顯枯斑后，記錄枯斑數，取平均值，按公式（2）計算抑制率。

紫外線鈍化處理與鈍化效果檢測：將終濃度為240 μg/mL的病毒溶液置于紫外燈下30 cm處分別照射30、60、120 min后，按上述方式接種心葉煙，并按公式（2）計算抑制率。

抑制率（%）=（1-處理葉片枯斑數/對照葉片枯斑數）×100" " " " " " " " " " " " （2）

1.2.3 鈍化TMV誘導煙草防御酶系的變化測試 根據1.2.2的結果選取抑制效果良好的TMV鈍化液葉面噴施誘導處理供試植株上部2個葉片，以相同方法噴施清水、活性TMV溶液誘導處理分別為陰性和陽性對照。采集誘導處理24 h后的供試煙草植株葉片，分別測定多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化氫酶（CAT）的活性。測定方法按相關活性檢測試劑盒說明書進行。

1.2.4 鈍化TMV對溫室育苗池煙苗感染TMV的防控試驗 試驗設噴施1.2.2的結果中效果最好的鈍化TMV溶液以及清水、適當濃度的市售TMV防治藥劑（2%氨基寡糖素水劑、2%香菇多糖水劑、0.06%甾烯醇微乳劑、8%辛菌胺醋酸鹽水劑、3%超敏蛋白微粒劑、20%嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑、6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑）共9個處理，每個處理3個重復，共播種27盤煙苗，以噴清水為對照（CK）。將湘煙5號播種于200孔育苗盤中，間隔一行播種，播種后漂浮于溫室育苗池中，按常規育苗方法進行管理。煙苗長至5葉一心時，分別均勻噴灑鈍化TMV溶液以及清水、適當濃度的TMV防治藥劑至葉面濕潤為止。噴灑藥劑后第3天，采用摩擦接種法接種活性TMV病毒。煙苗出現典型花葉病癥狀后開始結果調查。調查時，清點每盤發病和未發病的煙苗數，按公式（3）計算發病率，按公式（4）計算保護效率。

發病率（%）=發病煙苗數/煙苗總數×100"（3）

保護效率（%）=100%-發病率 " " " " " " " " " " " （4）

1.2.5 鈍化TMV對大田煙草普通花葉病防控試驗 選擇前一年煙草普通花葉病發病嚴重的田塊，按照1.2.4選用的鈍化TMV溶液及TMV防治藥劑和清水對照設9個處理，每處理3個重復，共27個小區，每小區54 m2，栽湘煙5號煙苗50株。于揭膜期、團棵期和旺長期對各小區煙草葉片分別均勻噴灑各處理試驗劑液至葉面濕潤。田間管理按當地生產規范化要求進行。整個試驗過程中農事操作注意先健株后病株，避免農事操作傳毒造成試驗誤差。

TMV發生情況調查：各處理于打頂期調查1次TMV的發生情況，每處理調查20株，病害調查和分級參考國家標準GB/T 23222—2008，按公式（3）計算發病率、公式（4）計算保護效率、公式（5）計算病情指數。

病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）×100" （5）

2 結果與分析

2.1 TMV的濃度和感染活性

提取的TMV經紫外吸收光譜測定其A260=0.214，換算濃度為34.520 mg/mL，加入30%甘油在-80℃冰箱保存后，濃度為24.164 mg/mL。對提取到的TMV經接種檢測，觀察到典型癥狀的TMV感染枯斑形成（圖1），證明其有良好的感染活性。

2.2 TMV鈍化效果

從表1可以看出，紫外線、0.1%高錳酸鉀溶液、內生真菌發酵液16倍濃縮液、100 μg/mL殼寡糖溶液對TMV 有較高的抑制率，表現出良好的鈍化效果，并隨處理時間的增長而增加。其中，紫外線3個處理時間的抑制率均超過99%，以120 min鈍化時間的效果最好，抑制率達到99.85%；其次為內生真菌發酵液16倍濃縮液鈍化120 min處理，抑制率達到96%；0.1%高錳酸鉀溶液鈍化120 min處理，抑制率達到95%；銀杏葉提取物鈍化效果最低。

2.3 鈍化TMV誘導煙草防御酶系的變化

從圖2可以看出，4種處理方法鈍化的TMV對煙草的5種防御酶活性影響與活性TMV感染煙草后引起的防御酶活性變化相當，均與清水對照呈現出顯著的差異，表明鈍化TMV確實可以誘導煙草防御酶的增強表達，提高煙株對TMV感染的抗性。從而也證明鈍化TMV在煙葉生產中可以作為TMV免疫誘抗劑使用，提高煙株的TMV免疫力和抵抗力。

2.4 鈍化TMV對溫室育苗池煙苗普通花葉病的防控效果

從表2可以看出，紫外線120 min鈍化TMV溶液對煙苗上發生的普通花葉病有較好的防治作用，平均防治效果為38.22%，遠高于市售防治藥劑防效的19.17%～23.98%。

2.5 鈍化TMV對大田煙草普通花葉病的防控效果

從表3可以看出，紫外線120 min鈍化TMV的平均病情指數為41.67，低于所有的市售藥劑和對照；防效為32.66%，遠高于所有的市售藥劑。而且在鈍化TMV各重復中，有20%～30%的煙株未出現普通花葉病癥狀，發病煙株的病情級數也多數低于5級。

3 討論與結論

研究采用的TMV鈍化方法中，紫外線、0.1%高錳酸鉀溶液、內生真菌發酵液16倍濃縮液、100 μg/mL殼寡糖溶液對TMV 表現出良好的鈍化效果。殼寡糖曾被報道有較好的TMV鈍化效果[7-9]，試驗也得到印證，但仍次于其他3種方法的鈍化效果。不同方法制備的TMV鈍化液中，以紫外線鈍化對TMV抑制率最高，超過99%，紫外線照射120 min鈍化TMV溶液對煙苗和大田煙葉TMV的防治效果遠高于市售防治藥劑，主要原因可能在于鈍化TMV作用煙草細胞后，其表面外殼蛋白誘導煙草產生免疫反應[10]，從而對活性TMV產生較強的抵抗力。

鈍化TMV能引起煙草多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）等5種防御酶活性的顯著升高，提高煙株對TMV感染的抗性。證明鈍化TMV在煙葉生產中可以作為TMV免疫誘抗劑使用，提高煙株的TMV免疫力和抵抗力。

SOD是自然界唯一的以氧自由基為底物的酶，在活性氧代謝中處于重要地位，可以淬滅超氧負離子O2-啟動的一系列自由基連鎖反應所造成的生物毒損傷，為生物體內重要的活性氧自由基清除酶，因此SOD的活性和植物抗病性的關系密切。PAL是植物體內苯丙烷類物質代謝的限速酶，植物苯丙烷類代謝的次生產物——木質素、酚類物質和類黃酮等有拮抗微生物的作用。PPO主要把酚類物質氧化為酮類，而各種酮類參與病原菌和寄主細胞壁的合成及代謝，能與蛋白質等大分子物質形成聚合物，從而將病原菌限制在侵染點，阻止其進一步擴展。PPO還參與木質素的合成。大多數研究認為PAL和PPO與植物的抗病性呈正相關。一般認為，在植物感染病原物的早期生化事件中，SOD活性降低，活性氧積累，膜脂過氧化作用加強，對病原產生不良作用，限制病原菌的擴展，從而起到抗病作用。到后期，伴隨PAL、PPO等酚類代謝關鍵酶活性的增加，SOD活性也增加，清除O2-和OH-對植物的損傷，進一步增強了植物的抗病性。

孟祥紅等[11]研究了殼聚糖對小麥抗性相關酶活性的影響，結果表明，殼聚糖處理降低了苯丙氨酸解氨酶活性；多酚氧化酶活性變化不顯著；顯著提高葉內過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。此結果和我們的研究結果存在一定的差異，可能由于該結果是在沒有進行挑戰接種的情況下獲得的，說明植物的誘導抗病性和單純的誘導性生理反應存在一定差異。李落葉等[12]研究表明低聚糖可以誘導小麥對條銹菌侵染的過敏性壞死反應，并顯著提高了POD、

PAL和PPO的活性。杜昱光等[13]研究表明殼寡糖對TMV的誘導抗病性顯著提高了POD的活性，SOD、PAL和CAT雖有變化但和誘導抗病性無顯著相關。筆者研究結果與該結果有較大差異，出現這種差異的原因有待于進一步研究。

另一個發現是，在課題組前期研究中用于抑制姜青枯病菌的銀杏內生球黑孢菌發酵液在研究中表現出良好的TMV鈍化效果，以及優良的煙草防御酶誘導活性。其TMV誘抗活性是純粹由鈍化TMV誘導引起，還是發酵液中某些未知物質在其中共同起作用也還有待于進一步的研究。

在防控煙苗和大田煙葉感染TMV的驗證性試驗中，鈍化TMV對普通花葉病毒病能夠起到較好的防控作用，顯示出了良好的應用前景，但對于其防控機理有待進一步的研究。

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（責任編輯：謝培庚）

基金項目：湖南省煙草公司永州市公司科技項目（YZ2020KJ05）；湖南省教育廳科學研究項目重點項目（21A0519）；湖南省自然科學基金項目（2023JJ50070，2022JJ30272）

作者簡介：周向平（1979—），男，湖南桃源縣人，高級農藝師，主要從事煙草病害防治研究。

通信作者：袁志輝