革胡子鲇生長激素基因表達定量PCR分析的引物設計與評估

基金項目：國家自然科學基金（31672264）；天津市淡水養殖產業體系創新團隊建設項目（ITTFRSA2021000）。

作者簡介：藍一（1999-），男，碩士研究生，研究方向：水產增養殖、水產遺傳與育種。E-mail：layi3018@163.com。

通訊作者：王茜（1971-），女，博士，教授，研究方向：水產增養殖、水產遺傳與育種。E-mail：wqgt1999@163.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.002

摘" 要：以革胡子鲇（Clarias gariepinus）為試驗對象，對其生長激素（GH）基因進行熒光定量PCR（qPCR）的引物設計與評估。將合成的5對引物通過常規PCR電泳結果選擇出符合條件的GHF-GHR引物，并進行qPCR引物的評估。結果顯示：擴增GH基因片段的引物GHF-GHR擴增時熔解曲線為單一峰，說明引物具有良好的特異性；通過標準曲線得出GHF-GHR引物的擴增效率為93.3%，標準曲線的R2值為0.982，說明引物的擴增效率良好。上述結果說明GHF-GHR引物能用于待檢樣本的GH基因表達的qPCR分析。

關鍵詞：革胡子鲇（Clarias gariepinus）；生長激素基因；引物設計；熒光定量PCR；評估

革胡子鲇（Clarias gariepinus）隸屬于鲇形目（Siluriforms），胡子鲇科（Clariidae），胡子鲇屬（Clarias），原產于非洲尼羅河流域，1981年作為水產養殖品種引入中國，其屬于底層魚類，具有營養豐富、易繁殖、抗病力強、耐低氧、適應性強等特點，在水產養殖中具有重要的經濟價值。為了進一步提高其生產效率，深入了解影響其生長的遺傳因素具有重要的意義。生長激素（grown hormone，GH）是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白激素，是一種具有廣泛生理功能的生長調節素，魚類生長激素（fish grown hormone，fGH）是魚類腦垂體合成和分泌的一種分子量在22 KD左右的蛋白多肽，具有廣泛的生理作用。Duan等通過測量和觀察14 對大小匹配的GH 轉基因和非轉基因鯉（Cyprinus carpio）的血清 GH 水平和行為影響，發現GH轉基因促進了GH的表達，從而提高了鯉競爭和獲取食物資源的能力；Deng等為探究金鼓魚（Scatophagus argus）具有典型的雌雄生長二態性的原因，使用qRT-PCR分析顯示，雌性在6、18、30個月時的腦垂體GH水平比雄性更高，表明雌雄生長二態性可能歸因于金鼓魚中腦垂體的GH水平。

實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）是在PCR反應過程中對擴增產物進行實時分析和檢測，是一種準確檢測基因表達水平的強大工具，可以揭示與生長和發育相關的調控途徑。 qPCR目前已成為檢測不同樣品間基因表達水平差異比較權威性的方法，在水產動物中該方法也已被廣泛應用，馬細蘭等應用qPCR法檢測30、60、80、110、140日齡雄尼羅羅非魚（Oreochromis nilotica）肝臟GHR1和GHR2基因的表達；徐麗華等分別以23 ℃常溫對照組和6 ℃低溫待測組的鯉（Cyprinus carpio）腦組織cDNA為模板，以18S rRNA為內參基因，檢測26個候選基因的相對表達量；Jean-René等采用實時定量RT-qPCR與細胞培養相結合的方法，對傳染性鮭魚貧血癥（ISAV）進行診斷分析；Guo等應用qPCR和重組酶介導等溫核酸擴增技術（real-time RAA）分別檢測大口黑鱸病毒（LMBV）的敏感性和特異性，結果表明qPCR更適合在實驗室中對LMBV進行定量分析和準確檢測。

開發和評估革胡子鲇GH基因的qPCR引物是闡明該物種生長調控分子機制的關鍵一步，通過準確量化GH基因表達水平，我們可以確定與生長性狀相關的遺傳標記，促進選擇性育種項目，提高生長性能和抗病能力，然而目前革胡子鲇GH基因的qPCR引物鮮有研究。本研究采用生物信息學的方法，應用適宜的分子生物學軟件和技術，擬獲得革胡子鲇GH基因qPCR的相關引物，旨在為今后革胡子鲇GH基因表達分析以及進一步探討高密度養殖條件下革胡子鲇快速生長的機理奠定基礎，為可持續水產養殖生產的發展提供引物資料。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

本試驗用魚革胡子鲇取自天津市德仁農業發展有限公司，養殖密度約65 kg/m3，平均體質量（66.43±17.28） g，平均體長（18.54±1.92）cm。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 引物設計" 本試驗中待檢目標基因為GH。GH基因擴增引物根據本實驗室克隆的革胡子鯰GH全長cDNA（GenBank檢索號：FJ823972）應用Primer 5.0設計。滿足qPCR擴增基本要求的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2" RNA的提取與反轉錄" 應用Trizol試劑提取革胡子鲇腦垂體的總RNA，選擇完整性較好的RNA在核酸蛋白測定儀檢測RNA的純度和濃度，以確定反轉錄所需RNA的量，應用cDNA第一條鏈合成試劑盒，分別用Oligo dT引物和random引物進行反轉錄過程。

1.2.3" 引物的常規PCR分析" 應用Primer 5.0軟件設計并選擇出5對擴增GH基因片段的引物，用常規PCR進行檢測，每對引物分別用上述反轉錄得到的cDNA（稀釋10倍）為模板進行常規PCR分析。

1.2.4" 引物的qPCR評估" 根據常規PCR的電泳檢測結果，并結合引物序列的Tm值，從中選擇出適宜的引物，對其進行qPCR評估。根據常規PCR檢測選擇退火溫度，設定58、60、62 ℃三個溫度梯度進行qPCR檢驗，反應結束后觀察熔解曲線分析引物的特異性以及依據Ct值選擇最終制定標準曲線的引物。（分別將cDNA稀釋10倍、50倍、100倍進行熔解曲線和Ct值的分析，最終選擇適合制定標準曲線的cDNA的初始濃度，采用10倍稀釋法構建標準曲線）

2" 結果與分析

2.1" 總RNA分離結果及引物常規PCR分析

8個個體的腦垂體的總RNA電泳結果見圖1，腦垂體總RNA的OD260/OD280值在1.80～2.00范圍內，可以進行后續試驗。常規PCR法擴增GH目標基因結果見圖2，電泳檢測結果顯示所有引物的擴增產物均呈現單一的帶紋。

M為DNA Marker2000，1-8號分別為垂體1-垂體8

M為DNA Marker2000；1和2，3和4，5和6，7和8，9和10分別用引物GHF1-GHR1、GHF2-GHR2、GHF3-GHR3、GHF4-GHR4、GHF-GHR擴增GH目標基因片段結果

2.2" Ct值的檢測、cDNA稀釋倍數選擇以及熔解曲線分析

根據qPCR要求，引物在擴增時的Ct值lt;25時才能對引物進行擴增效率分析。其中GHF-GHR引物擴增的Ct值符合要求，且熔解曲線為單一的峰值，表明引物的特異性強，故對其進行后續qPCR擴增效率的分析。以稀釋10倍、50倍、100倍的cDNA為模板，GHF-GHR為引物進行擴增得到的Ct值分別為14.98、17.52、19.39，故選擇稀釋10倍的cDNA為模板進行后續操作。

2.3" 退火溫度的優化

根據常規PCR檢測，選取58、60、62 ℃三個溫度梯度進行退火溫度的分析，由表2可知，三個溫度梯度下的GHF-GHR的Ct值差異。并且GHF-GHR引物在58、60、62 ℃三個溫度梯度下的熔解曲線均為單一峰，說明引物的特異性良好。根據擴增得到的Ct值綜合考慮最終選擇62 ℃為退火溫度進行后續GH目標基因標準曲線的繪制。圖3為GHF-GHR引物擴增的GH基因在58、60、62 ℃三個退火溫度下的熔解曲線圖。

曲線上有◆者、有X者和無標注者分別為GHF-GHF引物在58、60、62 ℃三個退火溫度下擴增GH基因得到的熔解曲線圖3" GHF-GHF引物在58、60、62 ℃三個退火溫度下擴增GH基因得到的熔解曲線

2.4" 標準曲線的建立

根據以上試驗結果選取GHF-GHR為特異性擴增目標基因的引物，以稀釋10倍的cDNA為初始濃度，采用10倍稀釋法，用于構建標準曲線時的擴增模板。從標準曲線圖4可以得知GH目標基因擴增效率為93.3%，且標準曲線的R2=0.982。圖5為GH目標基因的擴增曲線。

A1-C1、A2-C2、A3-C3、A4-C4、A5-C5為分別在cDNA稀釋10-105濃度下的重復組圖4" GH目標基因構建的標準曲線

曲線上無標注者、有▲者、有X者、有◆者和■者分別為以稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍的cDNA為模板擴增得到的擴增曲線圖5" GH目標基因擴增曲線

3" 結論與討論

3.1" RNA檢測及引物的特異性

在運用實時熒光定量PCR方法檢測特異基因表達量的差異時，總RNA的質量是關鍵。RNA降解或污染，都會導致試驗結果的不準確。因此，檢查每個RNA樣品的完整性和純度十分重要，通過瓊脂糖電泳分析時，電泳圖上有明顯的兩條帶（28 s帶和18 s帶），并且28 s/18 s rRNA的帶亮度比在1和2之間，表明其具有良好的完整性，而OD260/OD280在1.8～2.0之間表示RNA樣本純度高，不含蛋白質和其他雜質。本試驗提取的革胡子鲇腦垂體的總RNA符合以上要求，可以進行后續qPCR分析。

qPCR引物的設計應符合以下原則：保證擴增子的長度在75～200 bp，片段越短擴增效率越高；但如果片段小于75 bp，擴增子很難與可能存在的引物二聚體區分，同時要求引物的GC值為50%～60%、Tm值在50～65 ℃之間，避免產生二級結構，還要確保正向和反向引物3’沒有互補配對，以避免引物二聚體形成。熔解曲線是用于評估PCR產物的特異性的一種常用手段，通過觀察熔解曲線，可以確定PCR產物是否單一，或者是否存在非特異性擴增或引物二聚體等問題。特異性的PCR產物會在特定溫度范圍內形成單一的熔解峰。Kokkattunivarthil等為了探究快速診斷南美白對蝦（Litopenarus vannamei）是否感染對蝦傳染性肌肉壞死病（Infectious myonecrosis）的解決方法，根據IMNV基因組序列設計了兩組特異性引物，結果顯示測定的靈敏度為10個病毒拷貝，并觀察熔融曲線顯示單個特定峰以確定該引物的特異性。本試驗采用標準的引物設計原則，并借助生物信息學工具對革胡子鲇生長激素基因序列進行分析，以確保引物的特異性。在引物設計中，我們注重引物的長度、GC含量和互補性，以確保PCR反應的效率和特異性，優化了退火溫度和cDNA濃度，通過PCR實驗對引物的效能進行了評估。結果表明，設計的引物在PCR反應中表現出良好的穩定性，能夠可靠地擴增革胡子鲇生長激素基因。革胡子鲇作為一種重要的經濟魚類，其生長激素基因的表達調控對其生長發育具有重要影響。因此，設計并評估了針對革胡子鲇生長激素基因的引物，對于深入了解其生長調控機制、改良養殖技術具有重要意義，為后續革胡子鲇生長激素基因的研究提供可靠的基礎。

3.2" 引物退火溫度的評估分析

引物的退火溫度對于擴增特異性目標序列至關重要：過低的退火溫度可能導致引物與非特異性目標序列結合，從而產生非特異性擴增產物，影響PCR的特異性；反之，過高的退火溫度可能導致引物與模板結合的效率降低，PCR反應的效率下降。引物的GC含量和長度是影響其退火溫度的重要因素：GC含量高的引物在較低的退火溫度下也能形成穩定的引物模板復合物，因此其退火溫度一般較高；相反GC含量低的引物則需要較低的退火溫度才能形成穩定的復合物。劉陽等為了探索巢式PCR非特異性擴增的產生原因及消除方法，分別使用不同退火溫度組合與不同引物濃度組合進行巢式PCR擴增，發現降低引物濃度或提高退火溫度均可一定程度地消除巢式PCR的非特異性擴增；Su等探究一種羅非魚（Oreochromis spp）感染無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的檢測方法，為保證其實驗的特異性和敏感度，對設計的三對特異性引物的退火溫度進行了優化，最終通過Ct值選定三組引物的退火溫度分別為55.8、56.7、60.4 ℃；Hickey等為了快速檢測海水中存在的鰻弧菌（Vibrio anguillarum），開發一種非探針、多重實時熒光定量PCR檢測方法，通過梯度反應優化退火溫度，溫度范圍為60～70 ℃，選定最佳退火溫度為65 ℃，并對PCR的退火和延伸時間進行優化，以5 s為間隔，篩選反應時間為20～50 s，從而確定擴增的最佳時間條件，縮短了反應時間。在本試驗中選取與常規PCR退火溫度相近的三個溫度進行qPCR退火溫度的優化，確定了最適合的退火溫度（62 ℃），以保證引物的特異性和PCR反應的效率。引物的退火溫度評估分析是PCR實驗中一個至關重要的步驟，通過合理選擇退火溫度，可以保證PCR反應的特異性和效率，為后續研究提供了可靠的工具。

3.3" 引物擴增效率的評估分析

引物擴增效率的評估分析在PCR實驗中至關重要，它直接影響著PCR反應的靈敏度和可靠性。擴增曲線是評估引物擴增效率的一個重要指標，通過在不同模板濃度下進行PCR反應，并記錄PCR產物的累積量，可以繪制出擴增曲線，擴增曲線的斜率反映了PCR反應的擴增效率，斜率越大，擴增效率越高。同時，擴增曲線的動態范圍也可以評估PCR反應的靈敏度和線性范圍。在評估引物擴增效率時，還需要考慮反應條件的優化：包括反應體系的組成、引物的濃度和退火溫度等因素都會影響PCR反應的效率，通過系統地優化這些反應條件，可以最大程度地提高引物的擴增效率。蔣路園等對紅豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis）TcERF基因qRT-PCR體系進行構建與優化，根據TcERF基因序列設計、組合出3對引物，從qRT-PCR反應體系、cDNA模板用量和引物用量等方面進行優化，分別篩選出該基因在5 μL小反應體系及10、20 μL常用體系下的最佳組合，結果表明隨著體系的增加，擴增效率也隨之增加。本試驗通過篩選合適的引物片段，優化退火溫度，選擇cDNA稀釋倍數等發現GHF-GHR引物的擴增效率為93.3%（在90%～105%之間），并且標準曲線的R2=0.982（R2值gt;0.980），證明本研究最終篩選的引物能用于待檢樣本GH基因表達的qPCR分析。引物擴增效率的評估分析是PCR實驗中一個關鍵的步驟，通過合理選擇評估指標和優化反應條件，可以有效地評估引物的擴增效率，為可持續水產養殖提供資料參考。

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Primer design and evaluation for quantitative PCR analysis of growth hormone geneexpression in Clarias gariepinus

LAN Yi1， HE Jinghui1， WANG Xiaomei1，2， WANG Qian1，2*

（1. College of Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；2. Key Laboratory of Aquatic- Ecology and Aquaculture of Tianjin， Tianjin 300384， China）

Abstract：This experiment focused on the design and evaluation of primers for growth hormone （GH） gene in Clarias gariepinus using fluorescence quantitative PCR （qPCR）. Five pairs of primers were synthesized， and the GHF-GHR primer pair was selected based on the results of conventional PCR electrophoresis. Subsequently， the GHF-GHR primer pair was evaluated for qPCR. The results indicated that the amplification curve of the GH gene fragment with the GHF-GHR primer pair showed a single peak， demonstrating good specificity of the primers. The amplification efficiency of the GHF-GHR primer pair was determined to be 93.3% based on the standard curve， with an R2 value of 0.982， indicating a high amplification efficiency of the primers. These results suggest that the GHF-GHR primer pair is suitable for qPCR analysis of GH gene expression in the test samples.

Key words：Clarias gariepinus; GH gene; primer design; qPCR; evaluate

（收稿日期：2024-04-13）