miR.200a通過上調Nrf2對老年糖尿病心肌病大鼠心肌的保護作用

楊曉凈 肖婷 曹晨 鄧向群

摘要 目的： 探討微小RNA.200a（miR.200a）對老年糖尿病大鼠心肌的保護作用及機制。 方法： 采用高脂飲食＋鏈脲菌素（STZ）誘導大鼠糖尿病心肌病模型，分為對照組和STZ組。通過注射攜帶miR.200a腺相關病毒9（AAV9）在心肌內過表達miR.200a，分為對照＋AAV9.control組、對照＋AAV9.miR.200a組、STZ＋AAV9.control組、STZ＋AAV9.miR.200a組，每組8只。體外培養大鼠心肌細胞H9c2，分為對照組（5.5 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.control＋si RNA組（轉染AAV9.control和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.control＋si核因子E2相關因子2（Nrf2）組（轉染AAV9.control和si Nrf2 48 h后使用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a＋siRNA組（轉染AAV9.miR.200a和si RNA 48 h后 用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、 高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf 2組（轉染AAV9.miR.200a和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）。使用酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶同工酶（CK.MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測miR.200a表達水平，蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白表達水平；2′，7′.二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH.DA）染色檢測細胞活性氧（ROS）水平；免疫熒光檢測Nrf2表達。 結果： 與對照組比較，STZ組心肌組織miR.200a表達下調（ P ＜0.05）。與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平升高，SOD水平、血紅素氧化酶1（HO.1）、細胞核Nrf2蛋白、細胞質Nrf2蛋白表達及Nrf2熒光密度降低（ P ＜0.05）。與STZ＋AAV9.control 組比較，STZ＋AAV9.miR.200a組心肌組織LDH、CK.MB、 MDA水平及TUNEL陽性細胞率降低，SOD水平、HO.1、細胞核Nrf2蛋白、細胞質Nrf2蛋白表達及Nrf2熒光密度升高（ P ＜0.05）。高糖處理可降低H9c2細胞存活率，提高ROS、MDA、LDH水平（ P ＜0.05）；在此基礎上轉染miR.200a后上述指標被抑制；同時轉染miR.200a和si Nrf2后，ROS、MDA、LDH升高，細胞存活率降低（ P ＜0.05）。 結論： miR.200a提高Nrf2表達從而減輕高糖誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡，這一效應與Nrf2核易位的促進及下游抗氧化應激信號有關。

關鍵詞 ?糖尿病心肌病；微小RNA.200a；核因子E2相關因子2；氧化應激；大鼠；實驗研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.008

Protective Effect of miR.200a on Myocardium of Elderly Diabetic Cardiomyopathy Rats by Up.regulating Nrf2

YANG Xiaojing， XIAO Ting， CAO Chen， DENG Xiangqun

Wuhan Third Hospital， Wuhan 430000， Hubei， China

Corresponding Author ?DENG Xiangqun， E.mail： dengxiangqun@hotmail.com

Abstract Objective： To investigate the protective effect of microRNA.200a（miR.200a） on myocardium of elderly diabetic rats and its mechanism. ?Methods： The rats diabetic cardiomyopathy model was induced by high.fat diet＋streptococcin（STZ） and divided into control group and STZ group.miR.200a was overexpressed in myocardium by injecting miR.200a.carrying adeno.associated virus 9（AAV9），which was divided into control＋AAV9.control group，control＋AAV9.miR.200a group，STZ＋AAV9.control group，and STZ＋AAV9.miR.200a group，with 8 rats in each group.The cardiomyocytes H9c2 of rats were cultured in vitro and divided into control group（5.5 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.control＋si RNA group（transfected with AAV9.control and si RNA for 48 h and then cultured with 33 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.control＋si nuclear factor E2.related factor 2（Nrf2） group（ transfected with AAV9.control and si Nrf2 for 48 h and incubated with 33 mmol/L glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.miR.200a＋si RNA group（transfected with AAV9.miR.200a and si RNA for 48 h and incubated with 33 mmol/L ?glucose for 24 h），high glucose＋AAV9.miR.200a＋si ?Nrf2 group（transfected with AAV9.miR.200a and si Nrf2 for 48 h and then incubated with 33 mmol/L glucose for 24 h）.The levels of superoxide dismutase（SOD），creatine kinase isoenzyme（CK.MB），lactate dehydrogenase（LDH），and malondialdehyde（MDA） were detected using enzyme.linked immunosorbent assay（ELISA）.miR.200a expression was detected by real.time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）.The protein expression was detected by immunoblotting.The level of reactive oxygen species（ROS） was detected by staining with 2′，7′.dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH.DA），and Nrf2 expression was detected by immunofluorescence. ?Results： Compared with the control group，miR.200a expression of myocardial tissue downregulated in the STZ group（ P ＜0.05）.Compared with the control＋AAV9.control group，levels of LDH，CK.MB，and MDA in the STZ＋AAV9.control group were significantly higher，and SOD，heme oxidase.1（HO.1），cytosolic Nrf2 protein，cytoplasmic Nrf2 protein expression，and Nrf2 fluorescence density were significantly lower（ P ＜0.05）.Compared with the STZ＋AAV9.control group，levels of LDH，CK.MB，MDA and TUNEL.positive cell rate were significantly lower in the STZ＋AAV9.miR.200a group，and SOD，HO.1，cytosolic Nrf2 protein，cytoplasmic Nrf2 protein expression and Nrf2 fluorescence density were significantly higher（ P ＜0.05）.High.glucose treatment could decrease the survival rate of H9c2 cells and increase the levels of ROS，MDA，and LDH（ P ＜0.05）.The levels of the above indexes were opposite expressed after transfection of miR.200a.The simultaneous transfection of miR.200a and si Nrf2 resulted in the elevation of ROS，MDA，and LDH，and the decrease of cell survival rate（ P ＜0.05）. ?Conclusion： miR.200a enhanced Nrf2 expression to attenuate oxidative stress and apoptosis induced by high glucose，which was related to the promotion of Nrf2 nuclear translocation and its downstream anti.oxidative stress signal pathway.

Keywords ?diabetic cardiomyopathy; microRNA.200a; nuclear factor E2 related factor 2; oxidative stress; rats; experimental study

老年糖尿病性心肌病（elderly diabetic ?cardiomyopathy， EDC）是糖尿病嚴重的并發癥之一，也是老年人的常見病和多發病，以糖尿病病人心臟結構和功能障礙為特征 ?［1］ 。EDC是糖尿病病人死亡的主要原因，目前尚無有效的策略預防糖尿病的發展。EDC的發病機制涉及多因素，如氧化應激、自噬和焦亡等 ?［2］ 。有研究表明，心肌細胞損傷誘發的氧化應激是EDC病理生理過程的主要因素 ?［3］ 。高血糖、游離脂肪酸和糖基化終產物導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度釋放，被認為是EDC心肌結構和功能損傷的關鍵 病理信號 ?［4］ 。因此，減輕氧化應激可能是預防EDC的治療策略。

微小（micro）RNA是高度保守可翻譯后修飾mRNA的單鏈非編碼RNA。miRNA失調與高糖引起的心臟毒性有關 ?［5］ 。一項研究表明，miR.200a通過靶向神經膠質瘤中的叉頭框蛋白A1（FOXA1）抑制腫瘤 ?［6］ 。miR.200a可減輕氧化應激誘導的心肌壞死 ?［7］ 。核因子E2相關因子2（Nrf2）是調節氧化應激的關鍵分子，Nrf2從Keap1釋放并轉移到細胞核以調節抗氧化劑基因，抑制ROS產生 ?［8］ 。有研究表明，miR.200a通過靶向Keap1 mRNA導致Nrf2激活并促進糖尿病病人Keap1 mRNA降解 ?［9］ 。有研究表明，血紅素氧化酶1（heme oxidase.1，HO.1）與糖尿病密切相關，其作為Nrf2的下游基因之一，不僅可催化體內血紅素的降解，而且參與細胞信號傳導、炎癥反應和對抗氧化應激的過程，Nrf2通過調控HO.1表達，在抗氧化應激及抗炎中發揮重要作用 ?［10］ 。鑒于miR.200a具有調節氧化應激的功能，miR.200a在EDC中作用的研究報道較少。本研究通過構建糖尿病心肌病大鼠模型，觀察miR.200a對疾病的影響并探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞系H9c2購自American Type Culture Collection 公司，miR.200a腺相關病毒（AAV9）購自上海典君生物公司，細胞計數（CCK）.8試劑盒購自Solarbio公司，末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、逆轉錄試劑盒購自Roche公司，鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma.Aldrich 公司，二氫乙錠（DHE）購自武漢塞維爾生物有限公司，杜氏改良Eagle培養基（DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBICO公司，超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶同工酶（CK.MB）、丙二醛（MDA）購自上海碧云天公司，所有一抗均購自Abcam公司。

1.2 實驗動物及分組

選取老年雄性SD大鼠，18～20周齡。將大鼠隨機分為對照組、STZ組，各16只。STZ組大鼠尾靜脈注射STZ（65 mg/kg）構建糖尿病心肌病模型，對照組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ組大鼠 隨機分成兩組，各8只，分別在注射STZ前1周尾靜脈注射1×10 ?12 ?病毒拷貝量的AAV9.miRscramble（AAV9.control）或AAV9.miR.200a， 作為STZ＋AAV9.control組、STZ＋ AAV9.miR.200a組；對照組大鼠隨機分為兩組，各8只，分別在注射檸檬酸鹽緩沖液的1周前尾靜脈注射 1×10 ?12 病毒拷貝量的AAV9.control或AAV9.miR.200a， 作為對照＋AAV9.control組、對照＋AAV9.miR.200a組。

1.3 細胞培養及分組干預

H9c2細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素.鏈霉素的DMEM培養基中，37 ℃溫度、95%濕度和5% CO 2中培養。H9c2細胞接種至6孔板，每孔1×10 4細胞，常規培養48 h 后，將細胞分為對照組（5.5 mmol/L 葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.control＋si RNA組（轉染AAV9.control和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.control＋si Nrf2組（轉染AAV9.control和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組（轉染AAV9.miR.200a和si RNA 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）、高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf2組（轉染AAV9.miR.200a和si Nrf2 48 h后用33 mmol/L葡萄糖培養24 h）。

1.4 ?逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT.qPCR）

從心臟組織和各組H9c2細胞中提取總RNA。TRIzol（TaKaRa Bio，Inc.）并通過PrimeScript ?TM 轉化為cDNART預混液。使用SYBR Green PCT Master Mix（TaKaRa Bio，Inc.）的Biosystems Prism 7000檢測miR.200a表達水平。

1.5 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測

收集1.2中各組大鼠心肌組織及1.3中各組H9c2細胞，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測心肌組織LDH、CK.MB、MDA、SOD水平及H9c2細胞MDA、LDH水平。

1.6 細胞凋亡檢測

采用TUNEL染色檢測細胞凋亡，在熒光顯微鏡下觀察切片凋亡細胞核占總數百分比，每張切片選取5個隨機區域進行統計分析。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

將大鼠心肌組織按照蛋白提取試劑盒操作說明提取蛋白并定量。將提取后的蛋白進行上樣，電泳、轉膜、封閉后加入一抗。過夜孵育加入二抗后采用電化學發光（ECL）法顯色，檢測HO.1、Nrf2表達。

1.8 免疫熒光染色

大鼠心肌石蠟包埋，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水。抗原100 ℃下修復10 min，切片在37 ℃下用正常山羊血清 （1∶50）滲透并阻斷1 h。切片用Nrf2一抗在4 ℃ 下孵育過夜。將相應的辣根酶標記的IgG在37 ℃孵育1 h，4′6.二脒基.2.苯基吲哚（DAPI）原液在室溫下孵育10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察Nrf2的表達情況。

1.9 CCK.8試劑盒檢測細胞活力

H9c2細胞以每孔5×10 3個細胞密度接種在96孔板中；之后轉染和48 h處理，加入10 μL CCK.8溶液孵育2 h后，450 nm下測定吸光度。

1.10 ROS檢測

37 ℃下通過二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH.DA，10 μmol/L）染色30 min，計算DCFH.DA熒光強度測定H9c2細胞ROS水平。

1.11 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，采用單因素方差分析（one.way ANOVA），組間比較采用SNK. q 檢驗。以 P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR.200a在高糖刺激下表達情況

與0 h比較，高糖刺激H9c2細 胞miR.200a表達水平隨著時間的延長而下降，且12、24、48 h的miR.200a 表 達水平降低（ P ＜0.05）。STZ組心肌組織miR.200a ?表達 水平較對照組下調（ P ＜0.05）。詳見圖1。

2.2 miR.200a減輕糖尿病心肌病大鼠的心肌損傷

與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control 組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平升高，SOD水平降低（ P ＜0.05）。 與STZ＋AAV9.control組比較，STZ＋ AAV9.miR.200a組心肌組織LDH、CK.MB、MDA水平及 TUNEL陽性細胞率降低，SOD水平升高（ P ＜0.05）。 詳見圖2。

2.3 miR.200a激活Nrf2信號

與對照＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.control 組心肌組織HO.1、細胞核Nrf2蛋白、細胞質Nrf2蛋白表達及Nrf2熒光密度降低（ P ＜0.05）。與STZ＋AAV9.control組比較，STZ＋AAV9.miR.200a組心肌組織HO.1、細胞核Nrf2蛋白、細胞質Nrf2蛋白表達及Nrf2熒光密度升高（ P ＜0.05）。詳見圖3。

2.4 miR.200a通過Nrf2發揮對心肌細胞的保護作用

與對照組比較，高糖＋AAV9.control＋si RNA組ROS、MDA、LDH升高，細胞存活率降低（ P ＜0.05）；與高糖＋AAV9.control＋si RNA組比較，高糖＋AAV9.control＋si Nrf2組ROS、MDA、LDH升高，細胞存活率降低（ P ＜0.05），高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組ROS、MDA、LDH降低，細胞存活率升高（ P ＜0.05）；與高糖＋AAV9.miR.200a＋si RNA組比較，高糖＋AAV9.miR.200a ＋si Nrf2組ROS、MDA、LDH升高，細胞存活率降低（ P ＜0.05）。詳見表1、圖4。

3 討 論

高血糖引起的氧化應激是導致糖尿病心肌病的關鍵。STZ誘導的糖尿病大鼠表現為心臟功能障礙，隨著促氧化應激物的積聚和抗氧化物的降低 ?［11］ 。高血糖誘導的氧化應激促進了心肌細胞凋亡，最終導致心臟功能障礙。通過恢復Nrf2、HO.1表達和激活Nrf2核轉錄被證實可顯著減輕高糖誘導的心肌損傷 ?［12］ 。

Nrf2是重要的細胞抗氧化轉錄因子，通過調控下游抗氧化基因表達，對抗氧化應激反應，維持細胞氧化還原穩態 ?［13］ 。本研究結果顯示，心臟Nrf2表達在糖尿病大鼠心肌組織表達明顯減少，Nrf2抑制蛋白HO.1表達減少。Nrf2被廣泛認為是抵抗氧化應激的保護性因素，且已證實糖尿病動物和病人心臟Nrf2表達降低 ?［14］ 。Nrf2一般與細胞質中關聯蛋白1（Keap1）結合，Keap1主要負責Nrf2的泛素化和降解。機體抵抗氧化應激時，Nrf2從Keap1釋放并轉位至細胞核以調節抗氧化劑表達 ?［15］ 。本研究結果顯示，Nrf2在糖尿病心肌病的心臟組織中表達降低，伴隨核異位減少。恢復Nrf2表達可減輕高糖引起的心臟毒性，因此，靶向調控Nrf2可作為治療糖尿病心肌病的一種策略。

miRNA是高度保守的單鏈非編碼RNA，通過調控mRNA參與蛋白的翻譯后修飾。miRNA失調與多種疾病有關，包括高糖誘導的心臟毒性 ?［16］ 。有研究表明，miR.200a通過靶向Keap1 mRNA激 活Nrf2，促進糖尿病腎病病人Keap1 mRNA降解 ?［17］ 。因此，miR.200a 可能在高糖誘導的心肌損傷中發揮了關鍵作用。在糖尿病心肌病大鼠中，通過AAV9過表達miR.200a觀察miR.200a對心肌細胞氧化損傷和凋亡的影響，探討miR.200a在糖尿病心肌病中的作用。本研究結果顯示，miR.200a在糖尿病心肌病大鼠心肌組織中表達降低，過表達miR.200a可減輕糖尿病心肌病大鼠心肌組織及高糖誘導的心肌細胞中心肌損傷標志物水平，增加凋亡細胞及ROS蓄積。miR.200a可激活Nrf2，且沉默Nrf2后miR.200a失去對氧化應激和細胞的保護作用。

綜上所述，miR.200a通過激活Nrf2減輕高糖誘導的氧化應激損傷和細胞死亡，預防糖尿病誘導的心肌損傷。miR.200a補充劑可能作為一種心臟保護劑對抗高糖引起的心臟毒性。

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（收稿日期：2022.02.07）

（本文編輯 薛妮）