核桃晚霜危害特性及影響機制研究進展

張綏林　李洋　李琰　張赟齊　齊建勛　侯智霞

摘要：早春晚霜凍害的發生給我國核桃生產帶來嚴峻的考驗，嚴重影響核桃生長發育、產量及收益。為明確我國核桃晚霜危害特性及影響機制，綜述了核桃受晚霜危害程度的影響因素及其在響應低溫脅迫時生理生化指標變化和分子機制。分析發現，關于生理變化相關的研究集中在細胞膜系統（相對電導率）、抗氧化系統（丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化物酶及過氧化氫酶）和滲透調節物質（可溶性糖、可溶性蛋白質及脯氨酸）3個方面，JrPAL、JrJAZ、JrGRAS、JrICE1、JrCBF/JrDREB1、JrCOR、JrWRKY、JrDHN、JrGST 和JrPUB 等基因的表達量受到低溫脅迫的誘導。對未來的研究方向進行了展望，為進一步挖掘核桃應對晚霜危害的響應機制及采取有效的生產措施提供了科學依據。

關鍵詞：核桃；晚霜危害；低溫脅迫；影響因素；機理

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0952

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）04001809

核桃（Juglans regia L.）是胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans L.）落葉喬木，也是世界四大干果之一。核桃生長適宜的年平均溫度為9～16 ℃，極端低溫不低于-25 ℃ ，極端高溫不超過35～38 ℃[1]。我國北方地區核桃的花期一般在4—5月[2]。‘薄殼山核桃的生物學零度為10 ℃，從萌芽到果實成熟需要有效積溫3 300 ℃以上，雌雄花從花芽萌動至終花期期間≥10 ℃有效積溫在458.0～579.7 ℃有利于‘薄殼山核桃開花[2]。晚霜又稱“倒春寒”，當早春溫度較高且持續時間較長，外界環境溫度突然≤0 ℃時，晚霜就會發生[3]。晚霜危害多發生在核桃的花期至幼果發育早期，通常情況下，外界溫度高于0 ℃的晚霜凍害會導致核桃幼葉發黑，但不會對已經展葉的幼莖造成傷害；然而，外界溫度低于0 ℃的晚霜凍害會導致核桃嫩芽、花器官、幼莖等受凍部位發黑、萎蔫，甚至脫落[3]。近年來，我國北方核桃產區春季晚霜頻發，其發生時間往往與核桃花期和幼果期相遇，導致相關器官受害，嚴重時直接影響核桃的產量和經濟效益[45]。核桃新梢耐受低溫臨界值為-2～-4 ℃，花、幼果耐受低溫臨界值為-1 ℃[6]。此外，核桃受晚霜危害程度與低溫持續時間有關，低溫持續時間越長，核桃受害程度越重[3]。不同地區核桃受晚霜危害的程度通常用該年核桃損失的產量進行評估，一般認為產量損失<10% 為輕度凍害，≥10% 且<30% 為中度凍害，≥30% 且<60% 為重度凍害，≥60% 為危重凍害[7]。目前，晚霜危害對于核桃芽、花等器官的影響以及核桃對造成低溫傷害的響應機制尚不明確，這將嚴重影響抗（避）晚霜核桃種質科學選育的效率，也不利于核桃應對晚霜危害有效措施的研發。因此，本研究從我國核桃產區晚霜危害的影響因素出發，通過對細胞膜系統、抗氧化系統、滲透調節物質等生理生化特性的變化進行分析，結合低溫環境下相關基因的表達，對核桃響應晚霜危害的分子機制進行了綜述，有助于了解核桃應對晚霜的響應機制，指導核桃產業的生產實踐活動，實現增產增收，為我國核桃產業帶來一定的經濟效益。

1 核桃受晚霜危害程度的影響因素

1.1 核桃產區氣候

晚霜對核桃產量的危害程度受到地理位置的影響。云南、新疆、四川及陜西是我國核桃的主產區，我國北方核桃產區溫度普遍低于南方，發生晚霜的頻率也高于南方核桃產區，尤其是新疆喀什、陜西宜君縣、山西晉中、甘肅成縣等地晚霜發生頻繁，對核桃造成的晚霜危害較嚴重[3]。多年來，我國各地的晚霜多在4月中旬發生，新疆喀什市通常在4月12日左右[8]，2006年晚霜導致喀什大約117 hm2核桃受害[9]，嚴重影響核桃產業的經濟收益。陜西省銅川市晚霜通常在4月上中旬發生，2020年4月10—12日晚霜造成宜君縣核桃受災面積達194.466 7 hm2，經濟損失高達225.06 萬元[4]。陜西省宜君縣2018年發生晚霜凍害的強度大于2020 年，2018 年4 月極端最低溫度為-1.8 ℃，≤0 ℃低溫持續時間為5 h，而2020年沒有晚霜凍害記錄[4]。陜西省藍田縣灞源在4 月上、中、下旬發生霜凍的次數分別為15、7、4次，而灞源正處于山區，可能是因為山區的高海拔和低氣溫導致其霜凍頻率較高[5]。上述說明，陜西省不同產區核桃受晚霜危害程度與當地低溫及其持續時間關系密切。

山西省早實核桃通常于4月初萌動，花芽于4月上中旬萌動。2015年4月13日，山西省蒲縣、汾陽和黎城的最低溫度分別為-4、0和0 ℃，早實核桃產量損失率分別為60%、10%和20%，說明核桃受害程度與所處環境溫度呈反比[6]。同時，晚實核桃產量損失率分別為70%、8%和15%，可能是因為-4 ℃的低溫環境導致晚實核桃頂花芽受凍，當年無法開花結果，而早實核桃受凍后產生的二芽、三芽可以正常萌發結果[6]。2020年清明節前后的晚霜凍害使山西省晉中市太谷地區核桃受凍率高達30%，2018年4月上旬的晚霜凍害導致太谷地區核桃受凍面積達95%以上[10]。2018年4月上旬，甘肅成縣晚霜導致核桃受到不同程度的凍害，其中二郎鎮、王磨鎮、小川鎮、沙扒鎮達到危重凍害程度，陳院鎮、紙坊鎮、索池鄉、蘇園鄉受到嚴重凍害，城關鎮、拋沙鎮受到重度凍害[11]。然而，目前關于晚霜危害發生情況的統計并不完全，對于核桃主產區具體種植地區核桃產量受晚霜凍害影響的統計仍然存在較大缺口。因此，后續研究中詳細統計每個核桃種植地區的晚霜危害特點以及產量、經濟損失等具體情況對于明確我國核桃受晚霜凍害程度具有重要意義。此外，基于不同核桃產區的氣候特點，深入探索各產區核桃能夠承受晚霜危害的臨界值，對于挖掘核桃響應晚霜危害的機制也至關重要。

1.2 核桃品種

晚霜危害通常導致核桃受害器官或整株發育延緩、葉片變黃枯萎、分蘗數減少、結果率降低[12]，甚至導致花苞、幼果和新梢枯死。不同核桃品種物候期各異，導致其受晚霜凍害影響程度不一。山西晉南地區晚霜基本在3月上旬至3月底發生，而‘魯光‘遼寧1號和‘禮品2號在3月18—19日進入萌動期，恰逢晚霜發生時間，上述核桃品種花芽因受凍而變黑、干枯、脫落，影響當年核桃產量[13]。‘清香‘上宋6號的雌花盛花期在5月，‘汾核系列‘禮品2號的雌花盛花期在4月底，而山西呂梁核桃產區的晚霜通常于4月上中旬發生，上述核桃品種可以有效避開晚霜凍害的影響[14]。美國核桃品種‘強特勒‘土萊爾和‘美國黑核桃在甘肅成縣萌芽較晚，恰能避開4月上旬的晚霜凍害[15]。當核桃的物候期避開晚霜發生日期時，其受晚霜凍害影響較小，也稱為避晚霜品種，可以為抗（避）晚霜核桃品種的選育提供參考。選育抗（避）晚霜品種是解決核桃受晚霜凍害影響最直接的途徑。因此，可以基于對不同品種抗性和核桃物候期的觀察，并結合雜交育種或無融合生殖的手段，選育可以有效抗（避）晚霜危害的優質子代或新品種。

2 核桃受低溫脅迫的生理生化機制

目前，大多研究均從抗寒性的角度評估核桃對低溫脅迫的耐受能力[1617]。解析低溫脅迫對核桃生理生化特性的影響往往從細胞膜系統、抗氧化系統及滲透調節物質3個方面開展（圖1）[10]。

2.1 細胞膜系統

通常情況下，核桃新梢耐受低溫臨界溫度為-2～-4 ℃，葉片、花、幼果耐受低溫臨界溫度為-1 ℃[6]。當環境溫度低于-1 ℃時，核桃花和幼果便會受凍而干枯、脫落；低于-4 ℃時，核桃新梢便會受凍而變黑、干枯。與此同時，細胞膜受到傷害后透性會增大。因此，相對電導率（relativeconductivity， REC）的變化可以反映細胞膜受害程度，進一步說明核桃受晚霜危害程度。當生長季核桃受到4 ℃低溫脅迫時，葉片REC變化不大；而在-4 ℃低溫脅迫時，REC顯著升高[1819]。當新疆核桃‘扎343‘溫185‘新新2號和‘露仁1年生枝條受到≤0 ℃低溫脅迫時，其REC顯著升高[16]。綜上可知，當環境溫度在核桃耐受低溫臨界值內時，REC保持相對穩定，低于臨界值時，REC呈升高趨勢。因此，當早春晚霜危害發生時，可以將REC作為判定核桃受晚霜危害程度的指標，用來評估核桃細胞膜結構和功能受損傷的程度。

2.2 抗氧化系統

當核桃受到≤0 ℃ 低溫脅迫時，活性氧（reactive oxygen species， ROS）生成速率增加，核桃1 年生枝條中丙二醛（malondialdehyde， MDA）大量積累（圖1），造成膜脂過氧化，導致ROS產生與清除之間的動態平衡遭到破壞，從而對核桃造成傷害[20]。當核桃葉片受到≤0 ℃低溫脅迫時，其MDA含量隨著溫度的降低呈上升趨勢[21]。綜上可知，核桃受到≤0 ℃低溫脅迫時，MDA含量增加表明細胞膜受到了嚴重損害。抗寒性越強的核桃品種受到≤0 ℃低溫脅迫時，其體內MDA含量降低。例如，‘魯果12 號枝條MDA 含量顯著低于‘香玲[22]，‘綠嶺葉片中MDA含量顯著低于其他核桃品種[21]，表明‘魯果12號和‘綠嶺受害程度更低。

植物體內常見的抗氧化系統以抗氧化酶為主，主要包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）和過氧化物酶（peroxidase， POD）[20]。SOD、POD和CAT是植物酶促防御體系中重要的保護酶，能防止膜脂過氧化。研究證明，SOD、POD和CAT在低溫脅迫環境中具有特殊的變化規律。目前，SOD、POD、CAT在核桃應對≤0 ℃低溫脅迫中的響應已經受到關注[17-20]。當‘香玲葉片和子房受到≤ 0 ℃低溫脅迫時，隨著溫度的降低（0～-5 ℃），SOD及POD活性先升高后降低，葉片SOD及POD活性在-4 ℃達到峰值，子房SOD 及POD 活性在-3 ℃達到峰值[21]。1 ℃低溫脅迫12 h時，‘哈特雷‘晉龍1號和‘晉龍2號葉片SOD和POD活性升高；隨著低溫脅迫時間的繼續延長，SOD和POD活性呈下降趨勢[23]。‘香玲和‘魯果12號受到≤0 ℃低溫脅迫后，1年生枝條中SOD活性呈“升-降-升-降”的趨勢，CAT活性呈先上升后下降的趨勢[22]。當溫度降至一定程度（耐受低溫臨界溫度）前，核桃體內SOD、POD 和CAT 活性在逐漸升高（圖1）。而當溫度繼續下降時，SOD、POD和CAT活性開始下降。同時，≤0 ℃低溫持續時間達到一定程度時，SOD、POD和CAT活性升高；超過該時間，SOD、POD 和CAT活性便會下降。≤0 ℃低溫脅迫初期，SOD、POD 和CAT 活性的升高有利于核桃清除低溫導致的自由基的積累，保護核桃細胞膜系統，進一步提升核桃的抗寒能力。而溫度的繼續下降及低溫持續時間的延長打破了核桃體內的代謝平衡，SOD、POD 和CAT 活性的下降導致核桃清除自由基的能力顯著下降，導致核桃受到低溫凍害的影響。因此，在生產實踐中，將核桃生長環境溫度控制在一定范圍（高于耐受低溫臨界溫度）也是一種預防晚霜危害的有效措施。這些生理生化特性變化趨勢為準確衡量核桃受晚霜危害程度提供了參考依據，SOD、POD和CAT活性與核桃受晚霜危害的關系及其分子調控機制值得進一步研究與挖掘。

2.3 滲透調節物質

目前，關于核桃受到≤0 ℃低溫脅迫的研究涉及的滲透調節物質有可溶性糖（soluble sugar，SS）、可溶性蛋白（soluble protein， SP）和脯氨酸（proline， Pro），研究證明，SS、SP和Pro含量的變化可以用來鑒定核桃抵御低溫脅迫的能力[17，20]。不同核桃品種受到≤0 ℃低溫脅迫時，其體內SS、SP和Pro含量存在一定的差異[19]。例如，≤0 ℃低溫脅迫下，避晚霜品種‘清香1年生枝條SS和SP含量顯著低于不避晚霜品種‘遼寧1號[20]。抗晚霜品種‘溫185 1年生枝條SS和SP含量顯著高于其他品種，而Pro含量顯著低于其他品種[24]。綜上可知，較高的SS含量有利于清除核桃細胞內自由水含量，較高的Pro含量利于通過提高細胞滲透壓而增加保水能力，較高的SP含量有利于提高核桃抵御≤ 0 ℃低溫脅迫的能力（圖1）。不同核桃品種滲透調節物質含量之間的差異性導致其抵御低溫脅迫的能力存在差異，這對于后續選育抗晚霜核桃新品種具有重要的指導意義。

3 核桃受低溫脅迫的分子機理

隨著分子生物學技術水平的不斷提高，核桃等經濟林木響應低溫脅迫分子機制的研究主要集中在低溫保護物質和調節蛋白因子調控2 個方面[25]。在低溫脅迫下，誘導響應低溫脅迫基因的表達主要通過逆境信號傳導、轉錄及轉錄后調節水平進行（圖2）。

3.1 逆境信號傳導

脫落酸（abscisic acid， ABA）是一種低溫信號傳導分子，ABA信號途徑是植物處于低溫脅迫等逆境反應的核心[26]。WRKY是一類植物特有的抗逆相關轉錄調控因子，已經被證明在植物響應低溫等逆境脅迫中發揮重要作用[27]。5 ℃低溫脅迫下，根系中JrWRKY2 的表達量先上升后下降，處理9 h后達到峰值，而JrWRKY7 在根系中的表達量呈“升-降-升”的趨勢，處理2 h后達到峰值[26]。上述結果說明，JrWRKY 參與核桃受到低溫脅迫的早期響應。外源ABA 使過表達JrWRKY2 和JrWRKY7 的核桃葉片中SOD 和POD 酶活性均顯著高于對照、MDA含量顯著低于對照。此外，5 ℃低溫脅迫下，瞬時轉化JrWRKY2 和JrWRKY7 的核桃葉片Evans藍染色程度最淺，對照組葉片Evans藍染色程度最深[26]。外源ABA 使核桃種子JrWRKY6和JrWRKY53表達量顯著上升[27]。JrWRKY可能通過依賴于ABA的信號傳導途徑參與核桃對低溫脅迫的響應，并提高其抗旱能力。研究表明，對4 ℃核桃苗進行外源ABA 處理后，其葉片JrPAL 表達水平上調，同時低溫也可以誘導JrPAL（pyrabactin resistance 1-like）的表達[28]，推測ABA可能通過調控JrPAL 提高核桃對低溫環境的抵御能力。

JAZ（jasmonate ZIM-domain）蛋白是茉莉酸（jasmonic acid， JA）信號傳導過程中重要的負調控蛋白，在調控植物生長和防御的JA信號傳導中發揮著重要的作用[29]。0.5 ℃低溫處理核桃苗48 h后，JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7 和JrJAZ9 在‘遼寧8號和‘清香葉片中的表達量均顯著升高[29]，即JrJAZ 參與核桃低溫脅迫的響應。赤霉素（gibberellin， GA）合成代謝GRAS家族是存在于植物體內的轉錄調控因子，GRAS在赤霉素信號傳導過程中發揮著重要作用，對低溫脅迫做出響應[30]。對核桃GA信號傳導途徑響應低溫脅迫的研究表明，4 ℃低溫脅迫核桃苗48 h后，JrGRAS53 和JrGRAS56 在不耐低溫核桃品種‘清香中下調，但在耐低溫核桃品種‘遼寧8號中差異不顯著[31]。對早實核桃‘中林1號和晚實核桃‘清香進行外源GA3處理，低質量濃度（50和100 mg·L-1）GA3處理有利于降低核桃受低溫凍害的程度，而高質量濃度（200和300 mg·L-1）GA3處理增加核桃受低溫凍害程度[32]。總之，GA 可能通過上調JrGRAS 而提高核桃抵御低溫脅迫的能力。

3.2 轉錄調控

ICE （inducer of CBF expression） 屬于bHLH（basic helix-loop-helix）轉錄因子，在模式植物擬南芥中，ICE1-CBF （C-repeat binding transcriptionfactor）-COR （cold-related）低溫信號途徑已經比較清晰[33]，為核桃等木本植物響應低溫脅迫機理的研究奠定了基礎。當植物響應低溫脅迫時，ICE1轉錄因子被激活，從而使其下游基因CBF 和COR上調表達，提高植物的抗寒能力[34]。‘清香嫁接苗受4 ℃低溫脅迫48 h后，JrICE1 在其葉片中的表達量顯著升高，表明JrICE1 參與核桃低溫脅迫的響應[35]。隨著4 ℃低溫脅迫時間的延長，JrCOR 在‘香玲花芽中的表達量先上升后下降，并于處理4 h時達到峰值，說明JrCOR 主要在核桃響應低溫脅迫的早期階段發揮作用[36]。雖然目前已經研究了ICE1 和COR 基因家族在核桃受到4 ℃低溫脅迫時的表達模式，但是ICE1、CBF 和COR 在核桃響應低溫脅迫過程中的調控機制仍不清晰。

CBF/DREB1 （C-repeat binding factor/ dehydrationresponsive element binding protein 1）是植物體內低溫信號傳導途徑中研究最廣泛的轉錄因子，CBF/DREB1由低溫誘導產生，有利于增強植物在逆境中的抗性[37]。核桃幼苗受4 ℃ 低溫脅迫后，JfDREB1A 在根系、莖端和葉片中的表達量立即上調。此外，JfDREB1A 在擬南芥中的過表達通過維持細胞膜的穩定性、降低相對電導率和提高SOD、POD 和CAT活性來提高擬南芥的存活率。無性系核桃組培苗受到4 ℃低溫脅迫后，葉片中JrCBF表達量隨著低溫脅迫時間的延長呈“先上升后下降”的趨勢，在8 h時達到峰值，并在24 h時降至對照組的24 倍，進一步說明JrCBF 能夠被低溫誘導[38]。然而，在2和4 ℃低溫脅迫下，‘陽光和‘云新這2個品種的核桃葉片中CBF 表達量沒有顯著差異[39]，與徐麗等[38]的研究存在差異，可能是因為‘陽光和‘云新這2個核桃品種對低溫脅迫的反應并不敏感。綜上，CBF/DREB1 參與了核桃響應低溫脅迫的生物學過程，但其分子機制尚不明確。

此外，DHN（dehydrins）、GSTTaul （glutathioneS-transferase）和PUB（U-box）等也在核桃受低溫脅迫時發揮作用。4 ℃低溫脅迫處理核桃幼苗，葉片中JrDHN 的表達量增加，并在處理4 h后達到峰值[40]。6 ℃低溫脅迫下，JrGSTTau1 在核桃葉片中的表達量顯著高于溫度在6 ℃以上的葉片[41]。4 ℃低溫脅迫處理核桃苗48 h后，葉片中JrPUB3（U-box）、JrPUB7、JrPUB9、JrPUB12、JrPUB18、JrPUB20、JrPUB23、JrPUB40 和JrPUB42 的表達量顯著上調，而JrPUB32、JrPUB35 和JrPUB48 的表達量顯著下調[42]。上述結果說明JrDHN、JrGST和JrPUBs 在核桃響應低溫脅迫的過程中發揮著重要作用。

綜上所述，一定程度的低溫脅迫通過誘導低溫脅迫響應相關基因的表達，進而提高核桃抵御低溫脅迫的能力；ICE1、CBF/DREB1、COR、DHN、GST 和PUB 等在低溫脅迫中發揮著重要作用，以上結果不僅有助于更好地從分子水平理解核桃對早春晚霜危害的響應，更有利于繼續開展核桃抗晚霜機制的研究。然而，目前ABA、JA及GA調控核桃響應低溫脅迫的作用機制尚不清楚，WRKY、JAZ及GRAS在核桃響應晚霜危害時的調控網絡仍需進一步解析，在分子水平上對核桃抗晚霜以及相關基因家族提升核桃耐受低溫脅迫的信號通路方面的研究也相對欠缺。因此，后續可以從ABA、JA 及GA 信號傳導途徑出發，基于WRKY、JAZ、GRAS、ICE1-CBF-COR、DHN、GST 和PUB 等基因關聯研究核桃響應晚霜危害的具體分子調控機制。

4 展望

我國核桃主產區集中在云南、新疆、四川、陜西等地，大面積土地的優勢有利于核桃產業增產增收，而近年來頻發的晚霜凍害給我國核桃的生產帶來了嚴峻的考驗。目前，生產上已采取一系列的措施減輕核桃的晚霜危害并逐漸完善，通過選育抗（避）晚霜品種[9]、核桃受害后立即剪去所有受凍新梢的物理防治方法以及噴施赤霉素等激素推遲核桃花芽萌發的化學防治方法[33]降低核桃受害率，提升核桃產量和品質。雖然核桃受到低溫脅迫時生理生化指標及其響應低溫脅迫的分子機制已經取得一定的研究進展，而響應低溫脅迫的相關基因的克隆及其在核桃植株中的功能鑒定等方面還處于起步階段。挖掘核桃抗晚霜的分子響應機制對選育和改良抗晚霜核桃種質資源具有重要的指導意義。目前，使核桃有效避開晚霜凍害的措施主要集中在培育避晚霜凍害的新品種上。關于核桃抗晚霜研究可以從以下方面深入：①挖掘ABA、JA、GA等信號通路在核桃抗晚霜中的分子機制及調控網絡；② 探索ICE、CBF/DREB1、COR 和WRKY 等響應低溫脅迫基因參與核桃抗晚霜的調控機制；③通過對不同品種核桃物候期的觀察，結合雜交育種技術，選育抗（避）晚霜核桃新品種；④基于隨低溫脅迫相關基因的克隆，通過構建核桃的遺傳轉化體系，結合基因編輯技術，培育抗（避）晚霜核桃新品種。

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（責任編輯：胡立霞）

基金項目：北京林業大學熱點追蹤項目（2022BLRD07）；國家重點研發計劃項目（2019YFD1002401）。