絞股藍(lán)多糖提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能

王欣雨 金鑫 杜倩笙 唐非臺(tái) 劉可可 董胤余 王曉麗

摘要：研究不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］多糖（GPP）對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響，探討GPP對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其可能的作用機(jī)制。采用中性紅法、Griess法、CCK8法、ELISA法和熒光定量PCR法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、增殖、細(xì)胞因子（NO、LDH、TNF-α、IL-1β）的分泌量、CaM和GSα基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，GPP激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，隨著GPP濃度的增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，當(dāng)GPP濃度為50.0、100.0、200.0 μg/mL時(shí)，吸光度與空白對照處理相比差異顯著；GPP刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，吞噬能力強(qiáng)于空白對照處理，GPP濃度為200.0 μg/mL時(shí)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力最強(qiáng)；GPP促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌；GPP上調(diào)CaM和GSα基因的表達(dá)，GPP濃度為100.0、25.0 μg/mL時(shí)CaM、GSα基因表達(dá)量分別達(dá)到最高。

關(guān)鍵詞：絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］多糖（GPP）；巨噬細(xì)胞；吞噬作用；免疫功能；小鼠；腹腔

中圖分類號(hào)：S852.1；S859.7? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0151-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.024 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Gynostemma pentaphyllum polysaccharides enhance the immunologic function of mouse peritoneal macrophages

WANG Xin-yu， JIN Xin， DU Qian-sheng， TANG Fei-tai， LIU Ke-ke， DONG Yin-yu， WANG Xiao-li

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530005， China）

Abstract： In order to investigate the effects of different concentrations （12.5， 25.0， 50.0， 100.0， 200.0 μg/mL） of Gynostemma pentaphyllum polysaccharides （GPP） on mouse peritoneal macrophages， and to explore the regulatory effect of GPP on immunologic function and its possible mechanisms， the neutral red method， Griess method， CCK8 method， ELISA method， and fluorescence quantitative PCR method to detect the phagocytic ability， proliferation， the secretion of cytokines（NO，LDH，TNF-α，IL-1β）， and CaM， and GSα gene expression level of mouse peritoneal macrophages. The results showed that GPP activated mouse peritoneal macrophages， and the proliferation ability of mouse peritoneal macrophages increased with the increase of GPP concentration. When the GPP concentration was 50.0， 100.0， and 200.0 μg/mL， the absorbance showed significant differences compared to the blank control treatment；after GPP stimulation， the phagocytic ability of mouse peritoneal macrophages was stronger than that of the blank control treatment. When the GPP concentration was 200.0 μg/mL， the phagocytic ability of mouse peritoneal macrophages was the strongest；GPP promoted the secretion of NO，LDH，TNF-α， and IL-1β in mouse peritoneal macrophages； GPP upregulated CaM and GSα gene expressions. When the GPP concentration was 100.0 and 25.0 μg/mL， CaM and GSα gene expression levels had reached their highest levels respectively.

Key words： Gynostemma pentaphyllum polysaccharides （GPP）； macrophages； phagocytosis； immunologic function；mouse；peritoneum

絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］ 是一種多年生藥用草本植物，葫蘆科，又稱七葉膽、七葉參、甘茶蔓［1］。絞股藍(lán)是一種傳統(tǒng)的名貴中藥，具有降低膽固醇和甘油三酯水平、生津、調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫力、治療胃炎、減輕慢性支氣管炎和哮喘等功效［2，3］。絞股藍(lán)含有多種生物活性成分，絞股藍(lán)多糖（Gynostemma pentaphyllum polysaccharides，GPP）就是其中之一。近年來，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明絞股藍(lán)多糖有降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，具有降低血糖、抗炎、抗癌、保護(hù)肝臟、低毒、抗胃潰瘍、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化活性和治療高脂血癥的作用［4，5］。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種重要免疫細(xì)胞，它存在于機(jī)體的幾乎所有組織中，是宿主防御外來病原體入侵和抵抗癌細(xì)胞生長的第一道防線，具有很強(qiáng)的吞噬功能及抗原提呈作用，在特異性免疫和非特異免疫中都發(fā)揮作用［6］。已有大量研究證實(shí)，從自然資源中分離出來的多種多糖物質(zhì)對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的一個(gè)重要機(jī)制就是它們影響了巨噬細(xì)胞的免疫功能［7，8］，然而關(guān)于絞股藍(lán)多糖對于巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制還鮮有報(bào)道。本研究為探索不同濃度絞股藍(lán)多糖（GPP）對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響，觀察了GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬、增殖能力的影響，以及對細(xì)胞因子（NO、LDH、TNF-α、IL-1β）分泌量和CaM、GSα基因表達(dá)的影響，為絞股藍(lán)多糖的新型抗炎及免疫調(diào)節(jié)的藥物開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與腹腔巨噬細(xì)胞的制備

SPF級(jí)健康昆明系小白鼠（許可證編號(hào)：SYXK桂2014-0001）70只，4～5周齡，體重（18±1）g，雌雄各占50%，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后將小鼠處死，使用75%乙醇浸泡消毒，腹腔注入5 mL PBS緩沖液，輕揉腹部1～2 min后收集腹腔液，1 000 r/min離心 5 min，棄上清液收集巨噬細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)>95%，用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109個(gè)/L。以每孔100 μL加樣于96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，即得純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2 試驗(yàn)分組

1）空白對照組：培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，不加脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）和GPP。

2）LPS處理（陽性對照）：以含10.0 μg/mL LPS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

3）GPP處理：分成5個(gè)梯度組，GPP濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL。

1.3 巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測

每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加入0.1%中性紅溶液100 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，用PBS洗3次，每孔加入100 μL細(xì)胞溶解液，4 ℃冰箱過夜，待細(xì)胞溶解后在酶標(biāo)儀492 nm處測定吸光度（A）［9］。

1.4 巨噬細(xì)胞增殖檢測

每組細(xì)胞6復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后取出培養(yǎng)板，在酶標(biāo)儀492 nm處測定吸光度［10］。

1.5 巨噬細(xì)胞NO含量檢測

每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，按照Griess法繪制亞硝酸鹽與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取上清液檢測NO分泌情況，在酶標(biāo)儀540 nm波長處測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各處理組培養(yǎng)液中上清液的NO含量［11］。

1.6 巨噬細(xì)胞LDH、TNF-α、IL-1β含量檢測

每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸取上清液，以雙抗夾心ELISA法測定培養(yǎng)上清液中LDH、TNF-α和IL-1β的含量，操作步驟按檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.7 巨噬細(xì)胞CaM、GSα基因的表達(dá)

根據(jù)TransZol說明書提取巨噬細(xì)胞總RNA。通過吸光度比（260 nm/280 nm）評(píng)估RNA的數(shù)量和質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）合成互補(bǔ)DNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。使用CFX96TM實(shí)時(shí)系統(tǒng)（美國BIO-RAD）通過定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）評(píng)估基因表達(dá)。qPCR引物參照Davis等［12］、郭文瑞等［13］的文獻(xiàn)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，β-肌動(dòng)蛋白管家基因被用作qPCR反應(yīng)的內(nèi)部對照，如表1所示。采用以2-△△ct分析法進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析法（ANOVA），應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

采用中性紅吞噬法對不同濃度GPP處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。LPS處理和GPP處理的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力均有所增加，LPS處理與空白對照處理相比吸光度差異顯著（P<0.05）。GPP濃度為200.0 μg/mL時(shí)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力最強(qiáng)，其吸光度與空白對照處理及其他GPP處理相比差異顯著（P<0.05），濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的GPP處理間吸光度無顯著差異，且不同濃度的GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力無明顯的量效關(guān)系。

2.2 GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響

為了探究不同濃度GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響，本研究用CCK8測定巨噬細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如表3所示。LPS處理和不同濃度的GPP處理均可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，且隨著GPP濃度的增加，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。其中LPS處理與空白對照處理相比吸光度差異顯著（P<0.05）；當(dāng)GPP的濃度為50.0、100.0、200.0 μg/mL時(shí)，吸光度與空白對照處理相比差異顯著（P<0.05），但這3個(gè)處理間差異不顯著。

2.3 GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響

巨噬細(xì)胞在LPS和GPP處理培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測定NO、LDH、TNF-α和IL-1β的含量，結(jié)果如圖1所示。GPP促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌。GPP處理的NO含量均顯著低于LPS處理（P<0.05），GPP處理的NO含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05），且NO含量隨著GPP濃度的增加而增加。當(dāng)GPP濃度達(dá)25.0 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌的LDH趨于穩(wěn)定，GPP濃度為50.0、100.0 μg/mL時(shí)，LDH含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05）。當(dāng)GPP濃度為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β的含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05），且TNF-α、IL-1β含量隨著GPP濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)100.0 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)與LPS處理的TNF-α、IL-1β含量相當(dāng)，當(dāng)GPP濃度繼續(xù)增加時(shí)，TNF-α、IL-1β含量下降。

2.4 GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CaM、GSα基因表達(dá)的影響

為探究不同濃度GPP對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CaM、GSα基因mRNA表達(dá)的影響，將巨噬細(xì)胞在不同濃度GPP或LPS中培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR法檢測CaM、GSα基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示。GPP和LPS處理均可以顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CaM基因的表達(dá)，GPP處理（25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）的CaM基因表達(dá)量顯著高于空白對照處理（P<0.05），其中GPP濃度為100.0 μg/mL時(shí)CaM基因表達(dá)量達(dá)到最大值，隨著GPP濃度的增加，CaM基因表達(dá)量降低。GPP和LPS處理均可以顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSα基因的表達(dá)（P<0.05），GPP濃度在25.0 μg/mL時(shí)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSα基因的表達(dá)量最高。

3 討論

已有研究表明多糖具有促進(jìn)機(jī)體免疫器官生長、激活免疫細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)、釋放免疫功能因子等免疫調(diào)節(jié)活性，是天然的免疫調(diào)節(jié)劑［14］。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在宿主免疫應(yīng)答和抵抗多種病原體感染中發(fā)揮著重要作用［15］。一方面，它具有抗原提呈、吞噬病原體、分泌多種細(xì)胞因子、激活免疫應(yīng)答等生物活性；另一方面，它會(huì)釋放多種炎癥因子、參與炎癥反應(yīng)、加重炎癥。

多糖主要通過影響巨噬細(xì)胞活性氧和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)［16，17］。細(xì)胞因子是眾所周知的免疫因子，一旦被誘導(dǎo)，可以觸發(fā)免疫系統(tǒng)的疾病反應(yīng)，并有助于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。已有研究表明，茶多糖可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高腹腔巨噬細(xì)胞上調(diào)iNOS、TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平［18］；脹果甘草多糖能增強(qiáng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖率和吞噬能力，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、NO及NOS釋放，上調(diào)iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA水平，從而增強(qiáng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的免疫功能［19］；荊芥多糖可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的胞飲和吞噬活性，促進(jìn)炎癥因子（ROS、PTGS2、iNOS、IL-6、IL-10和TNF-α）和趨化因子（CCL2和CXCL10）的表達(dá)和分泌［20］；玉米須多糖能抑制LPS誘導(dǎo)的ROS和NO積累，減少促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-18）的產(chǎn)生和炎性介質(zhì)（iNOS）的表達(dá)，具有改善炎癥反應(yīng)的作用［21］。此外，滸苔多糖［22］、防風(fēng)多糖［23］、霍山石斛多糖［24］及松花粉硫酸多糖［25］均可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12。而本研究結(jié)果也表明，GPP可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和增殖能力，促進(jìn)NO、IL-1β、TNF-α和LDH的分泌，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能。GPP可以激活巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，但其激活巨噬細(xì)胞的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

CaM和GSα的生理功能已被廣泛研究，CaM參與的生理過程包括酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂和分化、細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞核內(nèi)酶系統(tǒng)和基因表達(dá)等［26］。細(xì)胞內(nèi)CaM含量的變化及其結(jié)構(gòu)和功能的異常與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［27］。G蛋白信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)許多信號(hào)的關(guān)鍵“網(wǎng)關(guān)”［13］，從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)、炎癥介質(zhì)和蛋白酶合成。郭文瑞等［28］發(fā)現(xiàn)牛磺膽酸顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CaM和GSα基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，不同濃度GPP作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，CaM和GSα mRNA水平顯著升高，提示GPP可能通過上調(diào)CaM和GSα的mRNA水平來影響巨噬細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究GPP抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制奠定了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，GPP可刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖，從而提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，GPP促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌，可上調(diào)CaM和GSα基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能。

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