超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜測定三七中九種真菌毒素

程龍 李云飛 吳思超 趙風情 張國帥 何友艷 陶蕾 王英

摘要：建立一種三七中9種真菌毒素的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜篩查與確證方法，快速篩查三七中9種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A）的殘留量。色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇水溶液為流動相進行梯度洗脫，正離子掃描，基質匹配外標法定量。結果表明，9種真菌毒素分別在0.1～100.0、5.0～1 000.0、0.5～500.0 μg/L 濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.990 00，方法定量限為0.3～15.0 μg/kg，在高、中、低3個濃度加標水平下，回收率為71.22%～98.57%，相對標準偏差為2.31%～ 6.72%。該方法在沒有對照品的情況下，可與質譜數據庫中一級、二級質譜的精確質量數和碎片離子信息等進行匹配，降低了試驗成本，具有簡便、快速、高效、準確等優點，適用于三七中真菌毒素殘留的快速篩查和測定。

關鍵詞：超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜；三七；真菌毒素

中圖分類號：R917? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）06-0187-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.030 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of nine mycotoxins in Panax notoginseng by ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry

CHENG Long1，LI Yun-fei2，WU Si-chao3，ZHAO Feng-qing2，ZHANG Guo-shuai2，

HE You-yan2，TAO Lei2，WANG Ying2

（1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China；2. Technology Center of Kunming Customs， Kunming? 650208， China；3.Technology Center of Huangpu Customs， Dongguan? 523071， Guangdong， China）

Abstract： An ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry screening and confirmation method was established for 9 types of mycotoxins in Panax notoginseng. The residual levels of 9 types of mycotoxins （Aflatoxin B1、Aflatoxin B2、Aflatoxin G1、Aflatoxin G2、Fumonitoxin B1、Fumonitoxin B2、Deoxynivalenol、Zearalenone、Ochratoxin A） in Panax notoginseng were quickly screened. The chromatographic column was Phenomenex Kinetex C18 （100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）， and gradient elution was performed using 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1% formic acid methanol solution as mobile phases. Positive ion scanning and the matrix matching external standard method were used for quantification. The results showed that 9 types of mycotoxins had good linear relationships within the concentration ranges of 0.1～100.0， 5.0～1 000.0， and 0.5～500.0 μg/L， respectively，the correlation coefficients were all greater than 0.990 00， and the quantitative limit of the method was 0.3～15.0 μg/kg. At three spiked levels of high， medium， and low concentrations， the recovery rate was 71.22%～98.57%， and the relative standard deviation was 2.31%～6.72%. This method could match the precise mass numbers and fragment ion information of primary and secondary mass spectra in the mass spectrometry database without reference materials， reducing experimental costs. It had the advantages of simplicity， rapidness， efficiency， and accuracy， and was suitable for the rapid screening and determination of mycotoxins residues in Panax notoginseng.

Key words： ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry； Panax notoginseng； mycotoxins

三七為五加科植物三七［Panax notoginseng （Burk.） F.H.Chen］的干燥根，是中國傳統的名貴中藥材，同時也是保健食品，具有活血化瘀、抗炎、抗腫瘤、降血脂、增強免疫力等功效［1-4］。中藥在種植、采集、炮制加工、運輸儲存的過程中，在一定的溫濕度條件下容易發生霉變，進而產生真菌毒素［5，6］。攝入被真菌毒素污染的中藥材可能會導致急、慢性中毒，甚至有致癌、致畸形、致突變的危害［7，8］。中藥中研究較多的真菌毒素為黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素、玉米赤霉烯酮等。

近年來，真菌毒素檢測方法主要包括高效液相色譜法［9］、高效液相色譜-串聯質譜法［10，11］、氣相色譜-串聯質譜法［12］、薄層色譜法［13］，另外酶聯免疫法［14］、膠體金免疫層析法［15］、熒光免疫分析法［16］等也已經應用到中藥真菌毒素的分析檢測中。然而現存的真菌毒素分析方法由于繁瑣的步驟和較低的靈敏度降低了檢測的高效性和可靠性。高效液相色譜-串聯質譜法雖然有較好的選擇性、靈敏度和特異性，但是其分辨率較低，尤其是遇到樣品基質復雜，存在基質干擾時，容易出現假陽性結果。隨著質譜技術逐漸發展成熟，超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜可以在不降低靈敏度的前提下大幅提高分辨率，抗復雜基質干擾能力更強，對目標化合物具有更好的鑒別和確證能力［17-21］。

本研究采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜建立了三七中9種真菌毒素殘留量的快速篩查方法，同時建立了精確質量數譜庫，可以實現在不使用標準品的情況下對已知化合物甚至非目標化合物進行篩查與確證。該方法為解決中藥真菌毒素殘留檢測問題、保障中藥質量提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七藥材購自云南鴻翔一心堂藥業（集團）股份有限公司，云南中醫藥大學藥學院生藥教研室鑒定為五加科植物三七（Panax notoginseng （Burk.） F.H.Chen）；黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2），伏馬毒素混合對照品溶液（伏馬毒素B1、伏馬毒素B2），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對照品溶液，赭曲霉毒素A對照品溶液均購自PRIBO公司；玉米赤霉烯酮購自上海安譜實驗科技股份有限公司（表1）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自美國Sigma公司；甲酸（分析純）購自西隴科學股份有限公司；Oasis HLB固相萃取柱、十八烷基鍵合硅膠（C18）固相萃取柱、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取柱均購自美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

SCIEX X500R型超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用儀［配有電噴霧離子源（ESI）及SCIEX OS數據處理系統］，美國SCIEX公司；Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），美國Phenomenex公司；XPE105型分析天平，瑞士Mettler公司；Milli-Q型純水系統（電阻率為18.2 MΩ·cm），美國Millipore公司；HS501型振蕩器，德國IKA公司；3-30K型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；TurboVap LV型氮吹儀，瑞典Biotage公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品的配制 精密量取上述適量真菌毒素標準品分別置于5 mL棕色容量瓶中，使用甲醇定容，配制質量濃度為10 μg/mL的標準儲備液，置于4 ℃冰箱避光保存；精密量取適量真菌毒素的標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成各目標化合物相應濃度為1 μg/mL混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理 參照2020年版《中華人民共和國藥典：四部》（以下簡稱《中國藥典》）2351真菌毒素測定法［22］，精密稱取三七樣品粉末3 g（精確至0.01 g），過三號篩，置于50 mL離心管中，加入70%甲醇水溶液20 mL，振蕩10 min，9 000 r/min離心? ? ?5 min，精密量取上清液5 mL，緩慢通過處理好的Oasis HLB固相萃取柱，收集洗脫液；隨后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，合并2次洗脫液，用40 ℃氮氣緩慢吹至近干，加入95%甲醇溶液定容至1 mL，通過0.22 μm有機相微孔濾膜，待儀器檢測。

1.3.3 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min，進樣量為10 μL，A為水相流動相，由0.1%甲酸水溶液組成，B為有機相流動相，由0.1%甲酸甲醇水溶液組成。梯度洗脫程序如表2所示。

1.3.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子TOF MS-IDA-10MS/MS掃描模式；毛細管電壓：? ? ? 5 500 V；氣簾氣壓力：207 kPa；霧化氣壓力：345 kPa；輔助加熱氣壓力：379 kPa；離子源溫度：550 ℃；碰撞氣：氮氣（Medium）；一級質譜掃描范圍：100～1 000 m/z；二級質譜掃描范圍：50～800 m/z。

1.3.5 數據庫的建立與定性方法 采用AB SCIEX公司的SCIEX OS軟件建立9種真菌毒素的一級、二級質譜數據庫。將質量濃度為1.0 μg/mL的9種真菌毒素標準品溶液按上述檢測條件進行全掃描，獲得一級高分辨率質譜信息和相對應的保留時間。將對應目標化合物的名稱、CAS號、分子式、母離子精確分子質量、保留時間等基本信息輸入軟件，完成一級質譜數據庫的建立［23］；同時在不同碰撞能量下做Targeted MS/MS二級掃描，得到9種真菌毒素的碎片離子精確質量數（表3），將其導入數據庫相應目標化合物目錄下，完成二級譜庫的建立。

在TOF MS-IDA-10MS/MS模式下對三七樣品的真菌毒素進行篩查確證，依據保留時間、精確質量數偏差與標準溶液獲得的質譜圖進行匹配，若獲得2個或2個以上特征碎片離子匹配，且二級質譜圖質量偏差小于等于0.5×10-6［24］，并且保留時間偏差在? ±2.5%之內，可以判定試樣中含有該種真菌毒素。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇 分別對不同類型的色譜柱進行考察，包括Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Thermo Accucore RP-MS C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）及Waters Atlantis T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱。結果表明Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）對9種真菌毒素均有良好的分離效果，色譜峰峰形對稱尖銳，有較好的響應，因此選擇Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）作為本試驗分析用色譜柱。

2.1.2 流動相的優化 分別考察水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇水溶液、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈水溶液作為流動相對待測物分離的效果。結果表明，0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇水溶液作為流動相時9種真菌毒素溶劑效應最小，分離效果最優，色譜峰峰形最佳；當流動相不加酸時，9種真菌毒素的響應強度偏小，甲酸的加入提高了待測物的離子響應強度；與乙睛相比，使用甲醇作為有機相時，9種真菌毒素在10 min內可以實現完全分離，最終選擇0.1%甲酸水溶液

-0.1%甲酸甲醇水溶液作為流動相，如圖1所示。

2.2 前處理方式的優化

由于大部分真菌毒素是極性化合物，提取時一般選用甲醇、乙腈、水等極性溶劑，本試驗采用甲醇作為提取溶劑，因為甲醇的極性比乙腈強，對大部分真菌毒素提取效果好。為了增加對樣品組織的滲透能力，在甲醇中加入一定比例的水作為提取溶劑，比較20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液和70%甲醇水溶液3種提取溶劑對三七中9種真菌毒素的提取效果。結果表明，70%甲醇水溶液對9種目標物的提取效率最好，回收率均超過70%，因此選擇70%甲醇水溶液為提取溶劑。由于中藥基質成分復雜，必須對其進行凈化處理。以9種真菌毒素回收率為考察依據，分別采用十八烷基鍵合硅膠（C18）固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱和N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取柱對樣品進行凈化處理。試驗結果顯示，回收率最高的為Oasis HLB固相萃取柱，9種真菌毒素回收率均超過70%，因此采用Oasis HLB固相萃取柱對樣品進行凈化處理。

2.3 基質效應考察

取空白甲醇試劑和陰性三七樣品經前處理后的基質溶液，分別配制濃度為10 μg/L的9種真菌毒素的混標溶液，測定9種真菌毒素的信號峰響應強度以評估基質效應，計算公式如下［25］。

[ME=A1-A2A1×100%]? ? （1）

式中，ME為基質效應值；A1為基質中目標化合物的響應強度；A2為純溶劑中目標化合物的響應強度。

當基質效應值小于-20%時表示基質抑制效應，基質效應值為-20%～20%時表示弱基質效應，當基質效應值大于20%時表示基質增強效應［26，27］。結果表明，三七中9種真菌毒素的基質效應值為-74%～46%，其中，伏馬毒素B1、伏馬毒素B2的基質效應值分別為31%、46%，表現為基質增強效應；玉米赤霉烯酮基質抑制效應最強，為-74%，其他目標化合物均表現出不同程度的基質抑制效應，因此本試驗采用基質匹配外標法進行定量分析。

2.4 線性范圍與定量限

采用三七陰性樣品制備基質溶液，配制成一系列濃度的真菌毒素混合標準工作液，以母離子作為定量離子，以各目標化合物色譜峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，外標法定量，以10倍信噪比計算其定量限［28］。結果表明，9種真菌毒素分別在0.1～100.0、5.0～1 000.0、0.5～500.0 μg/L 濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.990 00，定量限為0.3～15.0 μg/kg，可滿足痕量分析檢測要求，試驗結果見表4。

2.5 回收率試驗

采用三七陰性樣品進行加標回收試驗，分別添加高、中、低3種不同水平的目標化合物，每個加標濃度重復測定6次，結果如表5所示，9種真菌毒素的回收率為71.22%～98.57%，相對標準偏差（RSD）為2.31%～6.72%。說明該方法準確度、精密度高，可滿足檢測要求。

2.6 實際樣品的測定

應用數據庫對50份三七樣品進行分析，結果未發現被真菌毒素污染的樣品，下一步將擴大篩查范圍，針對更多的地區和不同品種的三七樣品進行測定。

3 小結

本研究建立了三七中9種真菌毒素的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜快速篩查與確證的方法，并考察了基質效應及方法學評價。本方法快捷簡便、特異性好、靈敏度高、重復性好，可針對性地對真菌毒素進行快速篩查。在沒有對照品的情況下，可與所建質譜數據庫中一級、二級質譜的精確質量數和碎片離子信息等進行匹配，降低了試驗成本。該方法解決了三七真菌毒素的“一站式”檢測問題，可為中藥真菌毒素殘留的快速篩查提供技術參考。本試驗所篩查真菌毒素為9種常見真菌毒素，下一步可以補充完善自建譜庫以實現一次篩查更多種類的毒素，完成真菌毒素的無標準品快速篩查。

參考文獻：

［1］ CASTRO-ACEITUNO V， AHN S， SIMU S Y， et al. Anticancer activity of silver nanoparticles from Panax ginseng fresh leaves in human cancer cells［J］. Biomedicine & pharmacotherapy， 2016， 84：158-165.

［2］ HUAN C， ZHOU Z， YAO J， et al. The antiviral effect of panax notoginseng polysaccharides by inhibiting PRV adsorption and replication in vitro［J］. Molecules， 2022， 27（4）： 1254.

［3］ LIU H， LU X， HU Y， et al. Chemical constituents of Panax ginseng and Panax notoginseng explain why they differ in therapeutic efficacy［J］. Pharmacological research， 2020， 161： 105263.

［4］ 黃依丹， 成嘉欣， 石 穎， 等.近五年三七化學成分、色譜分析、三七提取物和藥理活性的研究進展［J］.中國中藥雜志， 2022， 47（10）： 2584-2596.

［5］ 閔 曼， 潘浣鈺， 李 豐. 中藥中黃曲霉毒素檢測技術的研究進展［J］. 廣東化工， 2021， 48（5）： 223-224.

［6］ 周 恒， 王少敏， 季 申. 中藥中真菌毒素污染的現狀及防控對策［J］.中國食品藥品監管， 2022 （3）： 110-118.

［7］ EL-SAYED R A， JEBUR A B， KANG W， et al. An overview on the major mycotoxins in food products： Characteristics， toxicity， and analysis［J］. Journal of future foods， 2022， 2（2）： 91-102.

［8］ IQBAL S Z. Mycotoxins in food， recent development in food analysis and future challenges： A review［J］. Current opinion in food science， 2021， 42： 237-247.

［9］ 陳予君， 任春明， 張小勇， 等.高效液相色譜法測定糧食中真菌毒素的效果評價［J］. 糧食與食品工業， 2022， 29（2）： 62-67，72.

［10］ 吳基任， 潘 望， 譚高好， 等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定花生及土榨花生油中9種真菌毒素［J］.食品安全質量檢測學報， 2021， 12（10）： 3927-3935.

［11］ 李鳳華， 李作華， 楊 麗， 等. 藥食同源中藥材中16種真菌毒素的測定與分析［J］. 食品工業科技， 2022， 43（9）： 268-275.

［12］ NA T W， SEO H J， JANG S N， et al. Multi-residue analytical method for detecting pesticides， veterinary drugs， and mycotoxins in feed using liquid- and gas chromatography coupled with mass spectrometry［J］. Journal of chromatography A， 2022， 1676： 463257.

［13］ SOKOLOVI? M， ?IMPRAGA B. Survey of trichothecene mycotoxins in grains and animal feed in Croatia by thin layer chromatography［J］. Food control， 2006， 17（9）： 733-740.

［14］ OPLATOWSKA-STACHOWIAK M， REIRING C， SAJIC N， et al. Development and in-house validation of a rapid and simple to use ELISA for the detection and measurement of the mycotoxin sterigmatocystin［J］. Analytical and bioanalytical chemistry， 2018， 410（12）： 3017-3023.

［15］ ZHAO X， JIN X， LIN Z， et al. Simultaneous rapid detection of aflatoxin B1 and ochratoxin a in spices using lateral flow immuno-chromatographic assay［J］. Foods，2021， 10（11）： 2738.

［16］ LI R，WEN Y， WANG F， et al. Recent advances in immunoassays and biosensors for mycotoxins detection in feedstuffs and foods［J］. Journal of animal science and biotechnology， 2021， 12（1）： 108.

［17］ GAGO-FERRERO P， BLETSOU A A， DAMALAS D E， et al. Wide-scope target screening of >2 000 emerging contaminants in wastewater samples with UPLC-Q-TOF-HRMS/MS and smart evaluation of its performance through the validation of 195 selected representative analytes［J］. Journal of hazardous materials， 2020， 387： 121712.

［18］ ROM?N-HIDALGO C，VILLAR-NAVARRO M，FALC?N-GARC?A G E， et al. Selective， rapid and simultaneous determination of ergosterol and ergocalciferol in mushrooms by UPLC-Q-TOF-MS［J］. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2021， 194： 113748.

［19］ YANG M， LI J， ZHAO C， et al. LC-Q-TOF-MS/MS detection of food flavonoids： Principle， methodology， and applications［J］. Critical reviews in food science and nutrition， 2021.DOI：10.1080/10408398.2021.1993128.

［20］ 林守二， 楊麗娟， 鄭仁錦， 等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜快速篩查蔬菜中18種農藥殘留［J］. 分析科學學報， 2021， 37（3）： 279-286.

［21］ LIN S， ZHANG H， SIMAL-GANDARA J， et al. Investigation of new products of quercetin formed in boiling water via UPLC-Q-TOF-MS-MS analysis［J］. Food chemistry， 2022， 386： 132747.

［22］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部［M］.北京：中國醫藥科技出版社， 2020.384-385.

［23］ 李 帆， 羅金文， 王 峰， 等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查畜禽類產品中50種違禁藥物殘留［J］. 現代食品科技， 2022， 38（6）： 304-311，326.

［24］ 李云飛， 張 薇， 高 燕， 等.超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法測定動源性食品中33種獸藥殘留及質譜庫的建立［J］. 食品安全質量檢測學報， 2021， 12（2）： 629-635.

［25］ ZHOU W， YANG S， WANG P G. Matrix effects and application of matrix effect factor［J］. 2017， 9（23）： 1839-1844.

［26］ 李建勛， 范 蓓， 周 杰， 等.QuEChERS-超高效液相色譜-飛行時間質譜法快速篩查蔬菜中154種農藥殘留［J］. 食品與發酵工業， 2019， 45（19）： 239-250.

［27］ 謝瑜杰， 陳 輝， 彭 濤， 等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜測定牛奶中6種玉米赤霉烯酮類毒素［J］食品科學， 2019， 40（10）： 304-310.

［28］ 李 瑋， 艾連峰， 馬育松， 等.超高效液相色譜-飛行時間質譜測定牛奶中9種真菌毒素［J］. 分析科學學報， 2019， 35（5）： 675-678.