雌性恒河猴月經周期異常與腸道微生物的相關性研究

謝明學 趙宸 顏宇宸 彭正華 李嬌春 譚銀珍 王學付 張朝武 楊武 趙遠

[摘要]?目的?以健康雌性育齡期恒河猴為研究對象，采用16S?rRNA?宏基因組方法探討雌性恒河猴月經周期異常與腸道微生物組成的相關性。方法?將27只健康雌性恒河猴分為月經規律和不規律兩組，分別采集兩組實驗猴卵泡期（follicular?phase，FP）、排卵期（ovulatory?period，OP）和黃體期（luteal?phase，LP）糞便樣品，對16S?rRNA?基因的V3～V4高變區測序，分析比較兩組實驗猴月經周期腸道菌群結構及多樣性。結果?在門水平，規律組和不規律組獼猴在卵泡期、黃體期和排卵期?3個不同時期均以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要菌群，占比總和超過98%；在屬水平以普雷沃菌屬_9（Prevotella_9）、瘤胃球菌（Ruminococcaceae_UCG-002）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃菌屬_2（Prevotella_2）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、瘤胃球菌_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）、鏈球菌屬（Streptococcus）、布勞特菌屬（Blautia）、普雷沃菌屬_NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31_group）、理研菌屬（Rikenellaceae_RC9_gut_group）為主；在黃體期規律組厚壁菌門（Firmicutes）占比高于不規律組，而擬桿菌門（Bacteroidetes）剛好相反。規律組3個階段，螺旋體門（Spirochaetes）均高于不規律組（P<0.05）。結論?月經周期規律與月經周期不規律的兩組獼猴腸道微生物組成存在一定差異，為研究腸道細菌與排卵障礙提供一定的參考依據。

[關鍵詞]?恒河猴；月經周期；腸道微生物；宏基因組

[中圖分類號]?R37??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.17.001

Study?on?the?correlation?between?abnormal?menstrual?cycle?and?intestinal?microbiome?in?female?rhesus?monkeys

XIE?Minxue1，?ZHAO?Chen1，?YAN?Yuchen1，?PEN?Zhenghua1，?LI?Jiaochun1，?TAN?Yinzhen1，?WANG?Xuefu1，?ZHANG?Chaowu1，?YANG?Wu1，?ZHAO?Yuan2

1.Department?of?Production，?Institute?of?Medical?Biology，?Chinese?Academy?of?Medical?Sciences?Peking?Union?Medical?College，?Kunming?650118，?Yunnan，?China;?2.Laboratory?Animal?Department，?Institute?of?Medical?Biology，?Chinese?Academy?of?Medical?Sciences?Peking?Union?Medical?College，?Kunming?650118，Yunnan?，?China

[Abstract]?Objective?Using?healthy?female?reproductive-age?rhesus?macaques?as?the?research?subjects，?we?explored?the?correlation?between?menstrual?cycle?abnormalities?and?gut?microbiota?composition?by?using?16S?rRNA?metagenomic?sequencing.?Methods?Twenty-seven?healthy?female?rhesus?macaques?were?divided?into?regular?menstrual??and?irregular?menstrual?groups.?Fecal?samples?were?collected?at?follicular?phase?（FP），?ovulation?phase?（OP）?and?luteal?phase?（LP）?of?the?two?groups.?The?structure?and?diversity?of?bacterial?flora?in?different?physiological?periods?were?analyzed?and?compared?between?the?two?groups.?Results?At?the?phylum?level，?Firmicutes，?Bacteroidetes，?and?Proteobacteria?dominated?the?sample?flora?in?the?follicular，?luteal，?and?ovulatory?phases?of?the?rhesus?macaques?in?both?the?regular?and?irregular?groups，?with?a?combined?percentage?of?more?than?98%.?At?the?genus?level，?the?genus?Prevotella_9，?Ruminococcaceae_UCG-002，?Lactobacillus，?Prevotella_2，?Phascolarctobacterium，?Ruminococcaceae_UCG-005，?Streptococcus，?Blautia，?Prevotellaceae_NK3B31_group，?Rikenellaceae_?RC9_gut_group?were?dominant.?In?the?luteal?phase?the?percentage?of?Firmicutes?was?higher?in?the?regular?group?than?in?the?irregular?group，?while?the?opposite?was?true?for?Bacteroidetes.?Spirochaetes?were?higher?in?the?regular?group?than?in?the?irregular?group?at?all?3?stages?（P<0.05）.?Conclusion?There?were?some?differences?in?intestinal?microbial?composition?between?the?two?groups?of?macaques?with?regular?and?irregular?menstrual?cycles，?which?provided?some?reference?for?the?study?of?intestinal?bacteria?and?ovulation?disorders.

[Key?words]?Rhesus?monkey;?Menstrual?cycle;?Gut?microbes;?Metagenome

人類腸道微生物群是一個高度多樣化的生態系統，在個體之間變化極大[1]。這種微生物群落可能在人類健康和疾病中發揮關鍵作用[2]。越來越多的證據表明，宿主基因、基因表達模式、環境暴露（包括藥物和飲食）和生活方式因素在界定腸道微生物多樣性的界限方面發揮著重要作用[3-4]。研究表明，女性微生物多樣性比男性更高，微生物組成在青春期后出現性別差異，這種差異和多樣性多與其性激素的水平相關關[5-8]。人類微生物組影響女性生殖的每個階段和水平，包括卵巢中的卵泡和卵母細胞成熟、受精和胚胎遷移、植入和整個妊娠，甚至在分娩期間[9]。

非人靈長類動物（non-human?primates，NHP），因為它們在行為、生理和基因方面與人類有許多相似之處經常被用作醫學研究中的動物模型[10-11]。這些相似之處擴展到腸道、皮膚和微生物群，調查表明非人靈長類動物和人類有相似的微生物物種組成[12]。在NHP動物模型中，恒河猴和食蟹猴是使用最廣泛的物種[13]。恒河猴的生理周期全年都有，且它們的生殖周期與人類相似，在性周期、懷孕和產后，它們的激素水平也會發生與人類似的變化[14]。因此，以恒河猴替代人類進行生殖生理和腸道微生物研究有極大優勢。然而，目前對非人靈長類動物腸道微生物種群組成的影響因素的研究主要集中在宿主種類及其系統發育關系、飲食、年齡和性別、社會互動、腸道段差異，健康狀態等[15-18]。大多數研究性激素與微生物變化有關的研究都集中在陰道微生物區系上，但這些報告產生了不一致的數據，其中一些研究表明，在雌性生殖周期的過程中，陰道微生物種群發生了變化，而另一些研究則沒有[19-22]。目前對腸道微生物對生理周期是否有影響知之甚少。另有報道發現，雌性小鼠腸道微生物群在整個發情周期中未發生變化[23-24]。而對于非人靈長類動物月經周期各階段糞便微生物種群的研究未見報道。因此本研究嘗試使用?16S?rRNA?基因擴增子分析比較正常月經周期與異常月經周期恒河猴糞便樣品中微生物組成及功能，以探究月經周期與腸道微生物種群的關系。

1??材料與方法

1.1??實驗動物

健康雌性恒河猴27只，6～12歲，來自中國醫學科學院醫學生物學研究所，生產許可證號：SCXK滇K2020-0005，普通環境單籠飼養，每日自由飲水，飼喂全價顆粒飼料、水果，每日清洗猴籠。實驗前排除國標規定的病毒及腸道致病菌。觀察并記錄實驗猴3次月經周期，最終確定實驗分組。實驗內容經醫學生物學研究所動物實驗倫理審查委員會審查通過（倫理審批號：DWSP201810002），實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2??動物分組

記錄3次月經周期并計算平均值，根據恒河猴正常月經周期25～32d，將月經周期在此范圍內的動物歸為月經規律組（regular?menstrual?cycle，RMC，n=19），將月經周期不在此范圍內的動物歸為月經不規律組（irregular?menstrual?cycle，IMC，n=8）。最終按每1個月經周期中3個時期：卵泡期（follicular?phase，FP）、排卵期（ovulatory?period，OP）、黃體期（luteal?phase，LP）進行分組，即：規律組_卵泡期、規律組_排卵期、規律組_黃體期和不規律組_卵泡期、不規律組_排卵期、不規律組_黃體期。

1.3??樣品采集

每次觀察月經周期時分別采集實驗猴卵泡期、排卵期、黃體期糞便樣品，糞便的采集在排泄后10min內用無菌棉簽收集后置于冰盒中，迅速轉至實驗室-80℃冰箱凍存待檢。

1.4??樣品測序分析

將每只動物每個時期采集到的糞便樣品提取基因組DNA，用帶有條碼的特異引物擴增16S?rDNA的V3～V4區，引物序列為341F：5-CCTACGGGNGG?CWGCAG-3；806R：5-GGACTACHVGGGTATCTA?cAT-3。擴增產物回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將擴增產物等量混合，連接測序接頭，構建文庫，Hiseq2500?PE250上機測序。對原始數據過濾，組裝、再過濾，獲得有效序列，Uparse?軟件對一致性>97%的序列聚類成為操作分類單位（operational?taxonomic?unit，OTU）。根據OTU數量繪制稀釋曲線，進行Alpha多樣性分析。

1.5??統計學方法

采用?SPSS?23.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，采用Welchs?T檢驗進行兩組間比較；兩個以上分組比較時，使用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行差異分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??月經周期統計

平均月經周期兩組動物差異有統計學意義（t=8.275，P<0.001）。見圖1。

2.2??測序結果與質量分析

根據OTU聚類進行Alpha多樣性分析，計算Sop、Chao1、Shannon、Ace指數。規律組在卵泡期、黃體期和排卵期3個不同時期的Sop、Chao1、Ace指數均高于不規律組，表明月經周期規律的獼猴腸道菌群的多樣性豐富，見圖2。

2.3??各階段腸道微生物組成

在門水平，兩組獼猴在卵泡期、黃體期和排卵期3個不同時期樣本菌群均以厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為主。不規律組在卵泡期、黃體期和排卵期3個不同時期以上3個物種占比總和超過98%，規律組在這3個時期以上3個物種占比總和超過95%。

在屬水平，兩組獼猴在卵泡期、黃體期和排卵期3個不同時期樣本菌群均以普雷沃菌屬_9、瘤胃球菌_UCG-002、乳桿菌屬、普雷沃菌屬_2、考拉桿菌屬、瘤胃球菌_UCG-005、鏈球菌屬、布勞特菌屬、普雷沃菌屬_NK3B31、理研菌屬。

2.4??各階段腸道微生物比較

為了解不同分組之間的物種差異情況，本研究根據OTU豐度信息開展韋恩圖分析。兩組在卵泡期、黃體期和排卵期?3個不同時期組間共有OUT數量分別為703、718和706，而月經期規律組特有OTU均高于不規律組，見圖3。

2.5??差異物種分析

為進一步了解兩組3個不同時期組間物種豐度差異有統計學意義情況。門水平，螺旋體門月經規律組3個階段均高于不規律組（P<0.05），浮霉菌門在卵泡期和黃體期兩個階段規律組明顯高于不規律組（P<0.05）。其他菌門：埃普西隆菌門、圣誕島鹽菌門、軟壁菌門、黏膠球形菌門均在不同階段表現出規律組明顯高于不規律組（P<0.05），見圖4。在屬水平，兩組比較發現，在卵泡期、黃體期和排卵期3個不同時期兩組分別有14、9和10個物種差異有統計學意義（P<0.05），而且絕大多數物種表現出規律組高于不規律組。

2.6??功能分析

根據已知微生物的基因種類和豐度信息，結合京都基因組百科全書（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路信息來預測不同生理期糞便樣品的通路情況，最后進行功能分析。在2級水平月經規律組黃體期在復制和修復、脂質代謝、翻譯、核苷酸代謝、膜運輸、傳染病、細胞群落功能明顯高于不規律組（P<0.05）。其他階段差異無統計學意義，見圖5。

2.6??相關性分析

以網絡圖展示物種與月經周期的Pearson相關性。本研究默認以相關系數絕對值>0.5且P?<0.05為閾值，篩選展示滿足條件的結果，然后挑選相關性強度top20的關系對，繪制網絡圖。結果顯示，月經規律組在門水平與厚壁菌門、軟壁菌門、髕骨菌門等6個菌門呈正相關，而與擬桿菌門、變形菌門、螺旋體門等9個菌門呈負相關；在屬水平與普雷沃菌屬_9、瘤胃球菌_UCG-002、瘤胃球菌_UCG-005等11個菌屬成顯著負相關，與乳桿菌屬、普雷沃菌屬_2、鏈球菌屬等9個菌屬成顯著正相關。月經不規律組在門水平與擬桿菌門、放線菌門呈正相關，與厚壁菌門、軟壁菌門、髕骨菌門等13個菌門呈負相關；屬水平與普雷沃菌屬_9、瘤胃球菌_UCG-002、瘤胃球菌_UCG-005等12個菌屬呈正相關，與乳桿菌屬、普雷沃菌屬_2、鏈球菌屬等8個菌屬呈負相關。

3??討論

腸道微生物群影響多種生理功能，生態失調（微生物失衡）可能導致病理綜合征。本研究針對生理期規律與不規律的兩組恒河猴在卵泡期、排卵期、黃體期3個時期糞便中微生物種類進行分析研究。本研究從Alpha多樣性結果分析發現盡管兩組之間無差異有統計學意義，但月經規律的恒河猴腸道微生物多樣性還是高于月經不規律雌猴。

在門水平物種構成方面，兩組動物3個不同時期菌群均以厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為主，占比超過95%，在屬水平上，普雷沃菌屬相對豐度最高，其次是瘤胃球菌、乳桿菌屬和考拉桿菌屬，這一結果與已有文獻報道基本一致[25]。大量研究表明機體激素和微生物可相互影響，性類固醇激素可影響腸道菌群的結構、多樣性、活性、生長，繁殖等從而調控機體代謝活動及健康。有研究通過切除性腺的方法探討激素對89個常見的雜交系小鼠腸道微生物結構的影響，結果表明性類固醇激素可導致腸道菌群的差異，同時，微生物可影響宿主的內分泌[26]。微生物中存在孕酮、雌二醇等生殖激素受體，孕酮、雌二醇等可通過受體介導調節腸道微生物生長，并影響微生物的代謝活動[27-28]。

正常獼猴血清激素水平，雌二醇水平以卵泡期最高，黃體期最低；孕酮以黃體期最高，卵泡期最低[29]。本研究結果顯示規律組黃體期厚壁菌門的占比（53.65%）高于不規律組（49.41%），而擬桿菌門剛好相反，即規律組黃體期占比（40.28%）低于不規律組（46.48%）。屬水平上規律組黃體期乳桿菌屬占比（8.22%）高于不規律組（3.38%），而普雷沃菌屬在規律組黃體期占比（3.64%）低于不規律組（6.10%），而瘤胃球菌規律組（0.52%）顯著高于不規律組（0.25%），該結果與Sasaki等[30]在人類的研究結果一致，普雷沃菌含有與腸道通透性增加有關的黏蛋白降解細菌，而丁酸鹽由瘤胃球菌產生，有利于維持腸道穩態，因為丁酸是腸上皮細胞的能量來源，并且由于黏蛋白的產生，可能會形成微炎癥環境，炎癥已被證明對卵巢卵泡生長和排卵有負面影響，故而可能會導致排卵障礙。通過對各階段腸道微生物比較發現螺旋體門在規律組3個階段均高于不規律組（P<0.05），盡管螺旋體門占比很低（0.5%～2.4%），但研究發現其作為核心菌群似乎只存在于獼猴屬非人靈長類動物腸道中[31-32]。功能預測結果顯示，月經不規律組黃體期在復制和修復、脂質代謝、翻譯、核苷酸代謝、膜運輸、傳染病、細胞群落功能明顯高于規律組（P<0.05）。相關性分析發現規律組與不規律組在門水平和屬水平與物種相關性均有較大差異。盡管目前對相關菌群對宿主所產生的功能還不明確，但實驗分析結果顯示規律月經周期與不規律月經周期兩組獼猴腸道微生物組成存在差異，可能與激素水平相關。

綜上所述，本研究以月經周期規律和不規律恒河猴為研究對象，分析其腸道菌群的多樣性和結構，發現月經周期規律組恒河猴腸道微生物多樣性高于不規律組；在孕酮激素較高的黃體期，月經周期規律組厚壁菌門占比高于不規律組，擬桿菌門占比剛好相反；而在雌二醇較高的卵泡期，月經周期規律組厚壁菌門占比低于不規律組，擬桿菌門占比卻高于不規律組。這項研究證明了月經周期不規則的雌性恒河猴腸道微生物群的差異。特別是，富集的普雷沃菌微生物組和產丁酸細菌比例的降低與排卵障礙有關，這些發現還為排卵障礙提供了潛在的新診斷，并為通過糾正生態失調來治療排卵障礙開辟了新的研究方向。同時，本研究結果顯示規律月經周期與不規律月經周期兩組獼猴腸道微生物組成存在差異，可能與性激素水平相關。然而腸道微生物可能參與了性激素的調節，相反，也可能是性激素改變了微生物的多樣性，其調節機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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