高效液相色譜法與膠體金快速定量法測定玉米中嘔吐毒素的對比

盧慧勇

摘要：使用高效液相色譜法與膠體金快速定量法分別檢測28個玉米樣品的嘔吐毒素含量，比較發現兩種方法的檢測結果符合率達96.4%；通過在空白基質中加標分別使用兩種方法檢測對比兩種方法檢測的準確度均符合國標要求；與高效液相色譜法相比，膠體金快速定量法簡單、快捷，定性相符率高，可以滿足實驗要求；當樣本量比較大時，可用膠體金快速定量法作為初篩，再用高效液相色譜法進一步檢測，可達到降本提效的目的。

關鍵詞：玉米；嘔吐毒素；高效液相；膠體金

中圖分類號：TS210.7 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240118

Comparison of high performance liquid chromatography and colloidal gold rapid quantitative method for the determination of vomitoxin in corn

Lu Huiyong

（ China grain storage （Shanxi） Quality Inspection Center Co.， LTD.， Taiyuan， Shanxi 030000 ）

Abstract： The content of vomitoxin in 28 corn samples was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） and colloidal gold rapid quantitative method. The coincidence rate of the two methods was 96.4%. The accuracy of the two methods met the requirements of the national standard by adding marks to the blank matrix. Compared with high performance liquid chromatography （HPLC）， the colloidal gold rapid quantitative method is simple， fast， and has high qualitatively consistent rate， which can meet the experimental requirements. When the sample size is relatively large， the colloidal gold rapid quantitative method can be used as the primary screening， and then the high performance liquid chromatography can be used for further detection， which can achieve the purpose of reducing cost and improving efficiency.

Key words： corn； vomitoxin； high performance liquid phase； colloidal gold

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱嘔吐毒素，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌組成，是F鐮刀菌的二級代謝產物，廣泛存在于糧食作物和加工品中[1-2]。嘔吐毒素主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品。人畜攝入了被嘔吐毒素污染的食物或飼料后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀，嚴重時甚至會損害造血系統而造成死亡[3-4]。目前無法避免嘔吐毒素污染糧食作物，而且其在研磨和加工過程中很難被降解，可能對人畜造成潛在的危害[5-6]。

糧食的嘔吐毒素主要產生于田間種植、收貨及儲藏階段，如田間種植階段赤霉病流行，收獲時遭遇陰雨天氣造成的濕度過高，儲藏階段的溫度和濕度管理不善均為導致嘔吐毒素產生的因素。嘔吐毒素的產生與菌株、溫度、濕度、通風及日照等眾多因素有關，其中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為代表的真菌毒素受到社會的廣泛關注，已成為糧食檢測部門出入庫檢驗、抽檢普查的必檢項目之一。

檢測嘔吐毒素的方法有很多種，而且高度靈敏的儀器方法和快速有效的免疫方法正逐步應用于嘔吐毒素檢測，包括嘔吐毒素熒光定量快速檢測法、嘔吐毒素酶聯免疫定量快速檢測法、嘔吐毒素膠體金定量定性快速檢測法、嘔吐毒素免疫親和層析柱檢測法[7-10]。比較經典且已經形成國家標準或行業標準予以實施的檢測方法主要包括同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜法、酶聯免疫吸附篩查法、膠體金快速定量法。

目前，專門的檢測實驗室多采用GB 5009.111—2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》第二法：免疫親和層析凈化高效液相色譜法，糧庫收購一線多采用LS/T 6113—2015《糧油檢驗 糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》。為更好地服務基層糧庫，本實驗擬將兩種方法作對比，考察二者在定性定量方面的符合性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

扦取山西轄區庫存玉米28份，涵蓋不同品種、不同產地、不同收貨年度、不同入庫時間、不同倉房類型等可能對嘔吐毒素在儲存階段產生影響的因素。

1.2 實驗試劑

稀釋緩沖液：CHARM；甲醇中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品（100.7±3.2） μg/mL）：國家糧食與物資儲備局科學研究院；甲醇（色譜純）：天津科密歐實驗試劑有限公司；純凈水（符合GB/T 6682中一級水的要求）：實驗室自制。

1.3 實驗儀器設備

Charm型真菌毒素定量檢測系統（包含渦旋振蕩器、離心機、孵育器、讀數儀）：中檢環貿生物技術（北京）有限公司；3310型盤式保水磨：瑞典波通儀器有限公司；VX-III型多管渦旋振蕩器：安簡（北京）科技有限公司；YP502N型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；Agilent 1260 II型液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；3100型錘式旋風磨：瑞典波通儀器有限公司；HX-01溶劑過濾器（帶無油真空泵）：天津華鑫儀器有限公司；ZD-9624型搖床：常州易晨儀器制造有限公司；QL-866型渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；NDK-12W型水浴氮吹儀：上海皓莊儀器有限公司；Milli-Q direct8型純水/超純水一體化系統：南京金穗分析技術有限公司。

1.4 膠體金快速定量法

1.4.1 樣品處理

將原始樣品充分混勻，分取有代表性的樣品500 g，除去雜質后，用盤式保水磨（出粉過20目篩）粉碎，充分混勻，用分樣器縮分至200 g備用。準確稱取10.00 g試樣于100 mL離心管中，加入50.0 mL純凈水，旋緊離心管蓋，渦旋振蕩器上以2 000 r/min振蕩1.5 min后取出，靜置1～2 min后取1 000 μL上清液于1.5 mL離心管中， 4 000 r/min離心1 min。取離心后的上清液100 μL于另一個1.5 mL離心管中，加入1.0 mL稀釋緩沖液，充分混勻待測。

1.4.2 檢測方法

將孵育器預熱到45 ℃后，放入檢測條備用。準確移取300 μL待測溶液，加入檢測條加樣孔中，關閉加樣孔，在孵育器中孵育5 min，取出檢測條觀察一條C線（質控線）和兩條T線（檢測線）顯色情況。在確定質控線和檢測線正常顯色的情況下，選擇讀數儀的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測頻道并設定基質為00（MATRIX 00），將檢測條塞入讀數槽，開始樣品測定，讀數儀自動顯示脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。為不影響檢測結果，建議單個檢測條在15 s內完成讀數。

1.5 免疫親和層析凈化高效液相色譜法

1.5.1 樣品處理

將原始樣品充分混勻，分取有代表性的樣品1 kg，用錘式旋風磨（出粉過30目篩）粉碎，再次充分混勻，用分樣器縮分至200 g備用。準確稱取25.00 g試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL純凈水，旋緊瓶塞，置于搖床上。將搖床調節至230 r/min，振蕩20 min后靜置1～2 min，先用中速定性濾紙過濾，再用玻璃纖維濾紙過濾。收集濾液2 mL過免疫親和柱，保持每秒1～2滴的速度，直至空氣進入親和柱中，用水淋洗免疫親和柱2次，每次10 mL，保持每秒1～2滴的速度，直至空氣進入免疫親和柱，棄去全部濾液，抽干免疫親和柱，用2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，保持每秒1～2滴的速度。收集全部洗脫液至5 mL試管中，在50 ℃～60 ℃水浴中氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）定容，渦旋30 s溶解殘留物，充分混勻后過0.22 μm濾膜，收集濾液于進樣小瓶中以備進樣。

1.5.2 色譜條件

色譜柱為C18柱長150 mm，內徑4.6 mm，填料粒徑5 μm；流動相：甲醇—水（V甲醇∶V水= 20∶80）；紫外檢測器，檢測波長218 nm；流速0.8 mL/min；進樣體積50 μL；柱溫35 ℃。

1.5.3 標準曲線制作

配置10.07 μg/mL的標準儲備液：取購置的標準溶液（100.7 μg/mL，不確定度3.2 μg/mL）500 μL于5 mL容量瓶中，用初始流動相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀釋并定容到5 mL，渦旋振蕩10～15 s，充分混勻備用。

配置標準工作液：分別取10.07 μg/mL的標準儲備液10、20、50、100、200、500 μL，用初始流動相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀釋到1 mL，形成質量濃度為100.7、201.4、503.5、1 007、2 014、5 035 ng/mL的系列標準工作液，并按照1.5.2的色譜條件分別進樣50 μL，上機檢測。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 定性分析

由表1可知，膠體金快速定量法與高效液相色譜法的定性相符率達96.4%，但膠體金快速定量法與高效液相色譜法相比，簡單、快速，對人員能力要求低，可以達到快速定性的目的。

2.2 定量分析

2.2.1 假陽性樣例定量分析

通過分別應用膠體金快速定量法與高效液相色譜法對28份玉米樣品進行檢測發現：在定量方面，膠體金快速定量法出現1例假陽性，占樣品總量的5.6%；此例樣品兩種方法的差值為241 μg/kg，兩種方法的平均值為980 μg/kg，兩種方法的差值占平均值的24.6%。考慮到此例樣品恰好處于國家標準限量臨界值附近和真菌毒素快速檢測儀器自身定量誤差20%（廠家提供），而且樣品總量有限，因此，對于假陽性的出現，是偶然現象，還是方法本身存在的問題，還需要加大樣本量，增加陽性樣品，做進一步研究。

2.2.2 兩種方法定量比較

通過分析兩種方法定量差值占平均值的比例，確定兩種方法定量的偏差（參考脫氧雪腐鐮刀菌烯醇國標檢測方法中對雙實驗差的要求：雙實驗差大于平均值的23%的情況超過5%）。兩種方法定量比較詳見表1。

對于樣品1、2、12、18的定量偏差均超過50%，4個樣品的共同點是均有一種方法的定量值低于或接近國標的定量限（200 μg/kg），其余樣品的定量偏差未見明顯異常。對于是否國標定量限以上，膠體金快速定量方法與高效液相色譜法相比，定量接近，需要加大樣本量，進一步研究；是否國標方法定量限以下，膠體金快速定量方法不能準確定量，且與高效液相色譜法定量值相差較大，需要加大樣本量，進一步研究。

2.3 準確度分析

通過在玉米粉基質中添加量為200、1 000、2 000 μg/kg的嘔吐毒素標準溶液，每個水平含量做3個平行實驗，測定含量平均值與真值相對偏差見表2、表3。

按照GB/T 27404—2008附錄F的要求，真值在10～10 000 μg/kg時，相對標準偏差范圍在-20%～10%，根據表2和表3分析，高效液相色譜法和膠體金快速定量法測定結果的標準偏差均處于國標要求的范圍內，符合準確度要求。

3 討 論

（1） 膠體金快速定量法是嘔吐毒素最簡便的檢測方法，檢測不需要配套儀器，樣品處理簡單，5～10 min就可以看到檢測結果。可以根據質控線（G線）、檢測線（T線），初步確定所測樣本嘔吐毒素含量范圍，能給出具體數值，但是結果準確性不夠，容易產生假陽性和假陰性，價格最低，可作為粗略判斷方法。高效液相色譜方法是以免疫親和柱為分離手段的色譜法，用高效液相色譜儀作為檢測工具的分析方法。該項技術靈敏度高，測定范圍廣泛，采用單克隆免疫技術，可以特效性地將嘔吐毒素和其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，正確性和可靠性強，有國標支持。但檢測成本高，儀器維護成本高。一般作為檢測機構終端判定方法，也有大型企業作為產品質量衛生指標控制方法。

（2） 高效液相色譜法靈敏度高，檢測時間長，對實驗條件有要求，試劑純度要求高，實驗耗材和儀器維護所需成本高，適用于檢測機構出具報告或者在結果存在爭議時作為仲裁方法。在日常糧油檢驗中，本著把好出入庫關的原則，建議在入庫驗收和出庫檢測中優先使用高效液相色譜法。

（3） 膠體金快速定量法在進行測定樣品時無需大型儀器，對實驗條件要求低，無需接觸標準品（陽性），方法簡便快捷，適用于基層糧庫出入庫篩查。與高效液相色譜方法比較，可以在按照要求逐車檢驗的同時，有效地降低檢驗成本。

（4） 通過對28份玉米樣品的嘔吐毒素進行高效液相色譜法和膠體金快速定量法的檢測，其實驗結果顯示：在定性方面，兩種方法的符合率達 96.4%；在定量方面，膠體金快速定量法出現一例假陽性，占樣品總量的3.6%。關于兩種方法定量值的比較，需要加大樣本量，進一步研究。

（5） 在實際工作中，應結合實際情況靈活運用兩種方法，特別是在大型普查時，樣本量比較大，可用膠體金快速定量法作為初篩，再用高效液相色譜法進一步檢測，可達到降本提效的目的。

參 考 文 獻

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