高效液相色譜法和氣相色譜法分析肟菌酯原藥的方法比較

陳穎 劉小鋒 陳一萍 廖麗萍 傅洪濤

摘要：建立高效液相色譜法和氣相色譜法，來測定肟菌酯原藥有效成分的定量分析方法比較。用Agilent C18柱，采用甲醇和水為流動相，通過二極管陣列檢測器波長為250 nm；AE.SE-30毛細管柱，以鄰苯二甲酸二環己酯為內標物，FID檢測器分別對肟菌酯有效成分進行定量分析。高效液相色譜法和氣相色譜法的線性相關系數分別為0.999 9、0.999 5，標準偏差分別為0.21、0.19，變異系數分別為0.21%、0.19%，平均回收率分別為99.74%和99.67%。通過比較，兩種方法都能很好地用于肟菌酯原藥的定量分析。

關鍵詞：高效液相色譜；氣相色譜；肟菌酯

中圖分類號：TQ450.7 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240117

基金項目：湖南省科技創新計劃重點項目（2022NK2053）。

Comparison of methods for original drug of trifloxystrobin by HPLC and GC

Chen Ying， Liu Xiaofeng， Chen Yiping， Liao Liping， Fu Hongtao

（ 1. National Engineering Research Center for Agriculturals， Hunan Research Institute of Chemical Industry Co.， Changsha， Hunan 410014； 2. Supervision and Inspection Authorization Station of Chemical fertilizer and Pesticide Quality in Hunan， Changsha， Hunan 410014 ）

Abstract： Comparison of methods for quantitative analysis of the active ingredients of trifloxystrobin was determined by HPLC and gas chromatography. By a diode array detector wavelength at 250nm and FID detector， the active ingredient of trifloxystrobin was analyzed quantitatively With a Agilent C18 column and a AE.SE-30 Capillary column， using methanol and water as the mobile phase and dicyclohexyl phthalat as the internal standard. The results showed that the linear correlation coefficients of HPLC and gas chromatography were 0.999 9 and 0.999 5， the standard deviations were 0.21 and 0.19， the coefficient of variation was 0.21% and 0.19%， and the average recovery was 99.74% and 99.67% respectively. By comparison， the both methods are good for quantitative analysis of trifloxystrobin.

Key words： HPLC； GC； trifloxystrobin

肟菌酯是由德國拜耳公司開發的新型含氟殺菌劑，是具有殺菌活性的天然抗生素strobilurin A的合成類似物，對半知菌類、子囊菌類、卵菌綱和擔子菌類等具有良好的殺菌活性[1]。肟菌酯[2]殺菌譜廣、活性高、對作物具有治療和保護作用，可有效防治銹病、白粉病、霜霉病、網斑病、稻瘟病等[3-4]。肟菌酯雖然可以有效防治真菌病害，但是不合理地使用引發的殘留會對水生生態系統與土壤產生破壞。研究表明，肟菌酯可誘導蚯蚓產生氧化應激及造成DNA損傷[5]，對蜂類具有較高的毒性風險[6]，且容易通過雨水作用進入水體中累積。肟菌酯代謝產物肟菌酸比母體的毒性更強，更容易通過雨水淋濾造成水體和土壤污染。為了保護人類及動物的安全，全球很多國家建立了肟菌酯在水果、蔬菜中的最大殘留量（MRL）。為了防止肟菌酯殘留造成的影響，必須嚴格遵守農藥制劑的使用范圍和使用方法，避免超過量使用。而控制農藥制劑最有效的方法就是對農藥有效成分的含量檢測。肟菌酯定量檢測方法有很多種， 萬宏劍等[7]采用高效液相色譜，用甲醇—乙腈—水的三元體系來分離測定肟菌酯原藥，線性相關系數為0.999 9，變異系數分別為0.26%，平均回收率為100.3%。江小雪[8]通過氣相色譜儀，用DB-1毛細管柱對肟菌酯原藥進行分離和測定，線性相關系數為0.999 9，變異系數分別為0.13%，平均回收率為99.68%。但是氣相色譜法和液相色譜法的綜合方法比較目前暫沒有報道。本研究擬利用高效液相色譜儀[9]和氣相色譜儀[10]分別對肟菌酯原藥的有效成分進行分離和定量分析，以期為農藥分析工作者提供更多簡便可行的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT液相色譜儀（SPD-M20A光電二極管陣列紫外-可見光檢測器，SIL-20A自動進樣器，N2000 工作站）：日本島津公司；GC-2010plus氣相色譜儀（AOC-20S自動進樣器，帶氫火焰離子化檢測器（FID），GC-2010plus-System Administrator工作站）：日本島津公司；AUY2200電子天平：日本島津公司；AS3120超聲波清洗儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；10 μL微量進樣器：日本島津公司；0.45 μm濾膜：上海安譜實驗科技股份有限公司；肟菌酯標樣（質量分數99.0%）：沈陽化工研究院有限公司；鄰苯二甲酸二環己酯（不含有干擾雜質）：沈陽化工研究院有限公司；肟菌酯原藥：湖南萬家豐有限公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；丙酮（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；水（色譜純）。

1.2 液相色譜法

1.2.1 高效液相色譜操作條件

保護柱：4.0 mm×10 mm不銹鋼柱，內填C18的填充物，粒徑5 μm；Agilent C18色譜柱：250 mm×4.6 mm不銹鋼柱，內填C18的填充物，粒徑5 μm；流動相：甲醇—水（V甲醇∶V水=78∶22）；流速： 1.2 mL/min；柱溫箱溫度： 30 ℃；檢測波長： 250 nm；進樣體積： 20 μL。

1.2.2 標準物質的配制

稱取標準物質0.05 g（精確至0.000 1 g）于25 mL的容量瓶中，加甲醇20 mL置于超聲波溶解超聲10 min，冷卻到室溫后用甲醇稀釋至刻度線，混勻。然后用移液管移取上述標準溶液1 mL于25 mL的容量瓶中，用流動相定容。

1.2.3 試樣的配制

稱取試樣物質0.05 g（精確至0.000 1 g）于25 mL的容量瓶中，加甲醇20 mL置于超聲波溶解超聲10 min，冷卻到室溫后用甲醇稀釋至刻度線，混勻。然后用移液管移取上述試樣溶液1 mL于25 mL的容量瓶中，用流動相定容。

1.2.4 測定方法

在1.2.1儀器設定的條件下，待液相色譜儀基線穩定后，連續進多針標樣溶液，待相鄰兩針肟菌酯保留時間與峰面積相對值變化都小于1.0%。然后按照標準、試樣、試樣、標準溶液進行測定。肟菌酯液相色譜圖中的保留時間約為9.1 min，肟菌酯標樣高效液相色譜圖如圖1所示。

式中：W2為試樣肟菌酯原藥的質量分數，%；M1為肟菌酯標準物質的質量，g；A1為標樣溶液中肟菌酯峰面積的平均值；A2為試樣溶液中肟菌酯峰面積的平均值；M2為試樣的質量，g；W1為標樣中肟菌酯的質量分數，%。

1.3 氣相色譜法

1.3.1 氣相色譜操作條件

色譜柱：AE.SE-30 30 m×0.53 mm（id）大口徑毛細管柱（100%甲基聚硅氧烷鍵合型，膜厚1.0 μm）；氣化室溫度：250 ℃；色譜柱溫度：230 ℃；檢測器溫度：250 ℃；總載氣流量（高純氮氣）：318.4 mL/min；氣譜柱流量（高純氮氣）：16.95 mL/min；吹掃流量（高純氮氣）：3.0 mL/min；尾吹流量（高純氮氣）：30.0 mL/min；氫氣流量：40.0 mL/min；空氣流量：400.0 mL/min；分流比：17∶1；進樣體積：1 μL。

1.3.2 內標溶液的配制

稱取約0.7 g（精確至0.000 1 g）內標物鄰苯二甲酸二環己酯于100 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度線，搖勻備用。

1.3.3 標準溶液的配制

稱取肟菌酯標準物質0.05 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用移液管移取1.3.2的內標溶液5 mL于10 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.3.4 試樣溶液的配制

稱取肟菌酯原藥0.05 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用移液管移取1.3.2的內標溶液5 mL于10 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.3.5 測定方法

在1.3.1儀器設定的條件下，待氣相色譜儀基線穩定后，連續進多針標樣溶液，待相鄰2針肟菌酯與內標物保留時間比和峰面積比的相對值變化都小于1.0%。然后按照標準、試樣、試樣、標準溶液進行測定。肟菌酯保留時間約為3.5 min，內標物保留時間約為5.4 min。肟菌酯標樣的氣相色譜圖如圖2所示。

式中：X為試樣肟菌酯原藥的質量分數，%；M1為肟菌酯標準物質的質量，g；M2為肟菌酯原藥的質量，g；S1為標準溶液中肟菌酯的峰面積與內標物峰面積比的平均值；S2為試樣溶液中肟菌酯的峰面積與內標物峰面積比的平均值；P為肟菌酯標準物質的純度，%。

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜法波長的選擇

對肟菌酯進行紫外-可見光譜掃描，得到肟菌酯的紫外-可見吸收波長（圖3）。根據基線的噪音和肟菌酯的紫外-可見吸收響應值的大小，在250 nm下有較好的吸收，并且雜質峰也能很好的分開。肟菌酯試樣的高效液相色譜圖如圖4所示。

2.2 高效液相色譜法條件的流動相的選擇

本文通過乙腈和水、甲醇和水分別做流動相來測定肟菌酯，甲醇水體系和乙腈水體系分離效果都很好。但是乙腈的價格比甲醇的價格貴很多，且乙腈的毒性比甲醇的毒性大，因此選取毒性小、價格便宜的甲醇做為流動相。通過甲醇和水不同的比例來選取最佳的流動相比例，最終確定甲醇—水（V甲醇∶V水=78∶22）為肟菌酯原藥的最佳的流動相比例。該比例能夠很好地分離雜質，且目標峰峰型對稱，呈現正態分布。

2.3 內標物的選擇

為了使內標物與肟菌酯以及其雜質能夠很好地分離，并且內標物質的保留時間和響應值與肟菌酯的保留時間和響應值相差不大。實驗中選取了鄰苯二甲酸二環己酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二正戊酯、鄰苯二甲酸二甲酯、正十五烷等常用的內標，結果顯示在上述氣相色譜條件下，用鄰苯二甲酸二環己酯作內標物時，肟菌酯色譜峰與內標物色譜峰能很好的分離，出峰時間適中，沒有雜質重疊的干擾，峰形左右對稱。肟菌酯試樣的氣相色譜圖如圖5所示。

2.4 方法的線性相關測定

準確稱取含有肟菌酯0.051 9 g的標樣于25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL置于超聲波溶解超聲10 min，冷卻到室溫后用甲醇稀釋至刻度線，混勻。用移液管分別移取0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 mL上述肟菌酯標樣溶液至5個25mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度線，搖勻備用。配制成質量濃度為20.55～246.63 μg/mL的標準溶液，在1.2.1儀器設定的條件下測定。以肟菌酯質量濃度為橫坐標，對應的吸收峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得線性回歸方程y=42 583x+40 424，相關系數為R2=0.999 9，說明肟菌酯在20.55～246.63 μg/mL的質量濃度范圍內具有很好的線性關系。稱取5組不同質量的肟菌酯標樣于10 mL容量瓶中，按照1.3.2中的同一移液管精確移取5 mL內標溶液，然后再用丙酮定容，搖勻，分別配制0.506、1.265、2.530、5.060、12.650 mg/mL的標準溶液，按1.3.1氣相色譜條件進行測定。以肟菌酯質量濃度為橫坐標，對應的肟菌酯峰面積與內標物的峰面積比為縱坐標繪制標準曲線。得線性回歸方程y=0.347 3x-0.051 8，相關系數為R2=0.999 5，說明肟菌酯在0.506～12.650 mg/mL的質量濃度范圍內具有很好的線性關系。兩種方法都呈現很好的線性關系，可以完全滿足肟菌酯的定量分析。

2.5 方法的精密度測定

對同一樣品平行測定6次，在上述1.2.4、1.3.5的步驟下，測定肟菌酯原藥的質量分數，結果見表1。采用高效液相色譜法其標準偏差為0.21，變異系數為0.21；采用氣相色譜法其標準偏差為0.19，變異系數為0.19。說明兩種檢測方法精密度良好，可以滿足肟菌酯日常的檢測需要。

2.6 方法的準確度測定

平行稱取一定量的肟菌酯試樣，分別加入6個不同質量的肟菌酯標準樣品中，經溶解后定容，按照1.2.4、1.3.5的步驟下測定其回收率，結果如表2、表3所示。采用高效液相色譜法回收率為99.03%～100.39%，平均回收率為99.74%，準確度好；采用氣相色譜法回收率為99.00%～100.58%，平均回收率為99.67%，準確度好。

3 結 論

實驗結果表明，采用高效液相色譜和氣相色譜兩種方法對肟菌酯原藥進行定量分析，線性關系好，精密度和準確度高，均能得到很好的結果。分析人員可以根據自身的情況，選取合適的方法分析。本研究更推薦使用高效液相色譜儀，外標法操作相對簡單，處理也更容易，尤其適用于初學的分析工作者。

參 考 文 獻

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