C57BL/6 小鼠大腦皮層區(qū)與基底神經(jīng)節(jié)隆起區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程比較

［摘 要］ 目的：觀察小鼠皮層區(qū)和基底神經(jīng)節(jié)隆起 （GE） 區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程，闡明興奮性突觸和抑制性突觸在不同腦區(qū)的體內(nèi)外發(fā)育差異。方法：C57BL/6雌鼠于妊娠第13. 5～15. 5天斷頸處死后，經(jīng)無菌操作取胚胎小鼠，顯微鏡下逐步分離獲取胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)。體外原代培養(yǎng)胚胎小鼠神經(jīng)元，于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 分別收集細胞樣品，并將其作為培養(yǎng)3、7、14 和21 d 組。采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中突觸后表達蛋白突觸后密度蛋白95 （PSD95） 及橋尾蛋白（Gephyrin） mRNA 表達水平。免疫熒光法檢測各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1 （vGLUT1）、PSD95、囊泡γ-氨基丁酸（GABA） 轉(zhuǎn)運蛋白（vGAT） 及Gephyrin 蛋白表達水平。免疫熒光法檢測胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1及vGAT蛋白表達水平。結(jié)果：與培養(yǎng)3 d組比較，培養(yǎng)14和21 d組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）；與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中Gephyrin mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）。顯微鏡下觀察，培養(yǎng)14 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中興奮性突觸及抑制性突觸均初步發(fā)育，相關(guān)蛋白呈陽性表達；其中興奮性突觸相關(guān)蛋白陽性表達在皮層區(qū)神經(jīng)元中更為明顯，且突觸前分子vGLUT1 和突觸后分子PSD95 在皮層區(qū)神經(jīng)元的胞體及突起部位均呈現(xiàn)共定位的特征；抑制性突觸前分子vGAT 蛋白和突觸后分子Gephyrin 蛋白在GE 區(qū)神經(jīng)元胞體及突起中也呈現(xiàn)共定位的特征，且突觸前分子較相應的突觸后分子蛋白陽性表達更明顯。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。培養(yǎng)21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白陽性表達增加，興奮性突觸和抑制性突觸進一步成熟并完善。皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體及突起部位均形成了豐富的突觸前后對應的表達模式，突觸結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育良好，且突觸前分子較相應的突觸后分子蛋白陽性表達更明顯。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)比較，胚胎小鼠腦組織GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 蛋白表達水平明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：皮層區(qū)和GE區(qū)神經(jīng)元的突觸發(fā)育具有明顯的差異性，皮層區(qū)興奮性突觸發(fā)育較早，GE 區(qū)抑制性突觸發(fā)育較早。突觸的腦區(qū)特異性發(fā)育提示不同細胞類型的神經(jīng)疾病可能具有不同的發(fā)育來源。

［關(guān)鍵詞］ 神經(jīng)元發(fā)育； 興奮性突觸； 抑制性突觸； 皮層區(qū)； 基底神經(jīng)節(jié)隆起區(qū)

［中圖分類號］ R394 ［文獻標志碼］ A

突觸是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元之間及神經(jīng)元與效應細胞之間形成突觸連接是傳遞電化學信號的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，突觸發(fā)育是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵步驟。突觸結(jié)構(gòu)包括興奮性突觸和抑制性突觸，分別由各自特異的突觸前后蛋白組成。興奮性突觸通常會形成樹突棘樣結(jié)構(gòu)，突觸前膜和突觸后膜均聚集大量特異性蛋白， 電鏡下觀察可見突觸后致密體。興奮性突觸可使用的標志物包括興奮性突觸前特異性分子囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1 （vesicularglutamate transporter 1， vGLUT1） 和興奮性突觸后特異性分子突觸后密度蛋白95 （postsynapticdensity 95，PSD95），可分別對突觸前成分和突觸后成分進行染色并觀察［1-4］。抑制性突觸由獨特的蛋白聚集于突觸前膜和后膜形成，其中具有特征性且常用于染色觀察的標志物包括抑制性突觸前特異性分子囊泡γ - 氨基丁酸（γ -aminobutyric acid，GABA） 轉(zhuǎn)運蛋白（vesicular GABA transporter，vGAT） 和抑制性突觸后特異性分子橋尾蛋白（Gephyrin），相關(guān)特異性分子分別組成特定的突觸結(jié)構(gòu)，共同形成復雜的神經(jīng)環(huán)路［5-9］。神經(jīng)元的體外原代培養(yǎng)是一種常用的神經(jīng)觀察體系［10］。原代培養(yǎng)神經(jīng)元被廣泛應用于神經(jīng)發(fā)育和突觸發(fā)育的觀察，還可用于藥理作用下或病理模型中神經(jīng)元生理和病理的研究及神經(jīng)元電生理功能的觀測等［11-14］。不同腦區(qū)來源的神經(jīng)元其體外發(fā)育過程不同，突觸相關(guān)發(fā)育也存在差異。對不同腦區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育和突觸發(fā)育進行觀察可為后續(xù)開展針對性的生理病理及電生理研究提供實驗基礎(chǔ)。研究［15-16］ 顯示：原代神經(jīng)元培養(yǎng)大多選擇皮層區(qū)神經(jīng)元，對基底神經(jīng)節(jié)隆起（ganglionic eminence，GE） 區(qū)神經(jīng)元培養(yǎng)并觀察其發(fā)育情況的研究較少。本研究對皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程進行比較，探討體外培養(yǎng)小鼠不同腦區(qū)來源神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育情況， 闡明不同性質(zhì)突觸結(jié)構(gòu)中最佳觀察和干預時間，為突觸發(fā)育研究和病理藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器

10只 C57BL/6小鼠來源于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （陜） 2019-001。小鼠于SPF級動物房飼養(yǎng)， 室內(nèi)溫度約為24 ℃， 相對濕度約為50%， 光照為 12 h 光/12 h 暗循環(huán)。 神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)液（neurobasal medium， NB）、 0. 25% 胰酶消化液（Typsin-EDTA）、 細胞平衡鹽緩沖液（Hanks’ balanced salt solution， HBSS）、B27 添加劑和青- 鏈霉素混合液（100 U·mL－1 青霉素和0. 1 g·L－1 鏈霉素）（美國Gibco 公司），L-谷氨酰胺（美國Amresco 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）， 多聚賴氨酸（美國Sigma 公司）， 抗PSD95 抗體和抗vGAT 抗體（美國 Abcam 公司），抗Gephyrin 抗體（美國Synaptic Systems 公司），抗vGLUT1 抗體（美國SYSY 公司）， Alexa Fluor?488 標記鼠抗小鼠多克隆二抗、Alexa Fluor? 488 標記鼠抗兔多克隆二抗、Alexa Fluor? 594 標記鼠抗兔多克隆二抗和Alexa Fluor? 594 標記抗豚鼠多克隆二抗（美國 Jackson Immunoresearch 公司），4'， 6- 二脒基-2- 苯基（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（德國Sigma 公司）， 山羊血清（北京索萊寶科技有限公司），Triton X-100 （瑞士Roche 公司）， NovoStart?SYBR High-sensitivityqPCR SuperMix （合肥吉象生物技術(shù)有限公司），PrimeScripttm RT Master Mix （北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）， TRIzol （北京TIANGEN 公司）。CO２培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），酶標儀（瑞士TECAN 公司），超凈工作臺（蘇州蘇凈集團安泰公司）， 實時熒光定量 PCR （real-timefluorecence quantitative PCR， RT-qPCR） 儀（型號：C1000 Touch，美國Bio-Rad 公司），激光共聚焦顯微鏡（型號：FV3000，日本Olympus 公司）。

1. 2 神經(jīng)元原代培養(yǎng)及分組

C57BL/6雌鼠于妊娠第13. 5～15. 5 天斷頸處死后， 經(jīng)無菌操作取胚胎小鼠，置于含提前預冷1×HBSS 的培養(yǎng)皿中。于顯微鏡下逐步分離以獲取胚胎小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)腦組織，并去掉其表面腦膜。0. 25% Typsin-EDTA消化腦組織，制備為單細胞懸液，接種至預先用多聚賴氨酸包被的6 孔和24 孔細胞培養(yǎng)板中，采用含2% B27、1% 青-鏈霉素混合液和0. 5 mmol·L－1 L-谷氨酰胺的NB 培養(yǎng)液培養(yǎng)。神經(jīng)元細胞于37 ℃ 、5% CO2 孵箱中孵育。隔日進行半量換液1 次。于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 分別收集細胞樣品， 并將其作為培養(yǎng)3、7、14 和21 d 組。

1. 3 RT-qPCR法檢測各組小鼠皮層區(qū)和GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95及Gephyrin mRNA表達水平

于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 取出小鼠皮層區(qū)及GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元后，采用TRIzol 法提取細胞總RNA。采用多功能酶標儀檢測RNA 的濃度和純度， 取吸光度（A）（260） /A （280） 比值范圍于1. 8～2. 0 的RNA 樣本，進行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，檢測小鼠皮層區(qū)及GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 和Gephyrin mRNA 表達水平。將配制好的反應體系轉(zhuǎn)移至Bio-Rad CFX96 儀器中，設(shè)置反應程序，進行RT-qPCR 反應。反應條件： 95 ℃ 起始模板變性15 min； 94 ℃ 變性20 s、60 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，循環(huán)45 次。擴增結(jié)束后，分析熔解曲線。采用2—ΔΔCt 法計算目的基因表達水平。引物序列見表1。

1. 4 免疫熒光法檢測各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代 培 養(yǎng) 神 經(jīng) 元 中 vGLUT1、PSD95、vGAT 及Gephyrin蛋白表達水平

于培養(yǎng)第 14和 21天時，由孵箱中取出小鼠皮層區(qū)或GE 區(qū)神經(jīng)元，4% 多聚甲醛固定細胞，采用3% BSA+0. 1% Triton X-100封閉液預處理15 min， 加入1% BSA 液體稀釋的vGLUT1 （1∶500） 與PSD95 （1∶150） 的抗體混合液或vGAT （1∶ 1 000） 與Gephyrin （1∶ 150）的抗體混合液，4 ℃條件下于濕盒中孵育過夜。次日， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline， PBS）洗滌細胞。加入稀釋的Alexa 488 標記（1∶500）和Alexa 594 標記（1∶500） 的熒光二抗，于暗室中孵育1 h。PBS 緩沖液漂洗細胞3 次后，于暗室孵育DAPI （1∶1 000） 染色以襯染細胞核。PBS 緩沖液漂洗細胞3 次，所有玻片倒置于加入適量抗熒光淬滅封片液的載玻片上，小心封片。－20 ℃避光保存。將樣品置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，每張玻片在60 倍目鏡下隨機采集3 個視野圖像，采用Imaris 軟件的“Filaments”功能計算樹突長度，計算單位長度樹突陽性染色點數(shù)，代表目的蛋白表達水平。陽性染色點數(shù)=陽性蛋白染色總點數(shù)/樹突長度。

1. 5 免疫熒光法檢測胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元中 vGLUT1 及 vGAT 蛋白表達水平

C57BL/6 雌鼠妊娠第13. 5～15. 5 天時行腹腔注射1% 戊巴比妥麻醉， 麻醉起效后取出胚胎小鼠。行4% 多聚甲醛灌注后，取出胚胎小鼠腦組織浸泡入4% 多聚甲醛后固定2 h，30% 蔗糖-PBS 緩沖液脫水。脫水24 h 后，進行OCT 包埋和冰凍切片。對腦切片采用10% BSA+0. 1% Triton X-100 預處理30 min，加入1% BSA 稀釋的vGLUT1 （1∶ 200）和vGAT （1∶400） 抗體孵育液，于4 ℃濕盒中孵育過夜。次日，PBS 緩沖液洗滌腦片，加入稀釋的Alexa 488 標記（1∶500） 和Alexa 594 標記（1∶500）的熒光二抗，并于暗室孵育1 h。PBS 緩沖液漂洗切片3次后，暗室孵育DAPI （1∶1 000） 染液以顯示細胞核。PBS 緩沖液漂洗后加入適量抗熒光淬滅封片液于腦片，蓋玻片封片，待觀察。將完成染色的腦片置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，重點觀察皮層區(qū)和GE 區(qū)視野。采集10 倍和40 倍顯微鏡下的圖像， 采用Image J 軟件檢測蛋白熒光強度，“Image”功能標簽計算特定顏色的像素值，代表目的蛋白表達水平。

1. 6 統(tǒng)計學分析

采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95、Gephyrin mRNA 表達水平及vGLUT1、PSD95、vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平， 胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 及vGAT 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95及Gephyrin mRNA表達水平

與培養(yǎng)3 d組比較， 培養(yǎng) 7 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）， 培養(yǎng)14 和21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)3、7 和21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）； 培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）， GephyrinmRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）。見圖1。

2. 2 各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1、PSD95、vGAT 及 Gephyrin 蛋白表達水平

顯微鏡下觀察可見，培養(yǎng)14 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中興奮性突觸及抑制性突觸均初步發(fā)育，相關(guān)蛋白呈陽性表達。其中興奮性突觸相關(guān)蛋白陽性表達在皮層區(qū)神經(jīng)元中更為明顯，且突觸前分子vGLUT1 蛋白和突觸后分子PSD95蛋白在皮層區(qū)神經(jīng)元的胞體及突起部位均呈現(xiàn)共定位的特征；抑制性突觸前分子vGAT 蛋白和突觸后分子Gephyrin 蛋白在GE 區(qū)神經(jīng)元胞體及突起中也呈現(xiàn)共定位的特征，且突觸前分子較相應的突觸后分子蛋白陽性表達更明顯。見圖2 和3。與皮層區(qū)（0. 236±0. 040 和0. 193±0. 040） 比較， 培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達水平（0. 195±0. 047 和0. 143±0. 039） 均明顯降低（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)（0. 180±0. 037 和0. 065±0. 027） 比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平（0. 251±0. 043 和0. 198±0. 031） 均明顯升高（Plt;0. 01）。

培養(yǎng)21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白陽性表達增加，興奮性突觸和抑制性突觸進一步成熟并完善。皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體及突起部位均形成豐富的突觸前后對應的表達模式，突觸結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育良好，且突觸前分子較相應的突觸后分子蛋白陽性表達更明顯。見圖4 和5。與皮層區(qū)（0. 474±0. 064 和0. 264±0. 044） 比較， 培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達水平（0. 351±0. 072 和0. 231±0. 061） 均明顯降低（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)（0. 293±0. 038 和0. 151±0. 028） 比較，培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平（0. 355±0. 063 和0. 269±0. 058） 均明顯升高（Plt;0. 01）。

2. 3 胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和 GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 和 vGAT 蛋 白 表 達 水 平

與 皮 層 區(qū)（127. 70±17. 04 和103. 6±8. 87） 比較， 胚胎小鼠腦組織GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 蛋白表達水平（104. 10±9. 08） 明顯降低（Plt;0. 01），vGAT蛋白表達水平（118. 30±8. 79）明顯升高（Plt;0. 05）。見圖6。

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的研究中，體外培養(yǎng)神經(jīng)元能夠為生理和病理研究提供良好的細胞模型，在神經(jīng)元功能、神經(jīng)發(fā)育、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)藥理學和神經(jīng)疾病研究等方面具有重要的意義［17-18］。在神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病的研究中，培養(yǎng)基底前腦的神經(jīng)元可觀察其中不同類型神經(jīng)元（如膽堿能神經(jīng)元） 在致病因素作用下的變化，揭示疾病相關(guān)的細胞病理變化及其機制［19］。因此， 對于神經(jīng)元體外培養(yǎng)發(fā)育時程和發(fā)育特征等生理過程的研究具有重要意義，也是病理研究的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時間的延長，體外培養(yǎng)皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育過程中，突觸相關(guān)分子vGLUT1、PSD95、vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平均明顯升高，且皮層區(qū)和GE 區(qū)抑制性突觸及興奮性突觸發(fā)育存在差異。在相同培養(yǎng)時間點，興奮性突觸相關(guān)分子在皮層神經(jīng)元的表達高于GE 區(qū)神經(jīng)元， 抑制性突觸相關(guān)分子在GE 區(qū)神經(jīng)元的表達高于皮層神經(jīng)元。提示GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元較皮層區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元更適合進行GABA能神經(jīng)元的發(fā)育研究。此外，突觸前分子和突觸后分子的表達也存在差異，在皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的興奮性及抑制性突觸中，突觸前相關(guān)分子的表達均較突觸后分子的表達更為明顯。

皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元突觸分子的差異表達可能是由于2 個腦區(qū)發(fā)育的細胞類型不同所致。本研究結(jié)果顯示：胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元在突觸分子表達方面及突觸發(fā)育方面存在差異，可能與2 個腦區(qū)的神經(jīng)元細胞發(fā)育有關(guān)。GE 區(qū)是大腦胚胎發(fā)育過程中短暫存在的腦結(jié)構(gòu)，位于端腦的腹側(cè)部，被認為是紋狀體、杏仁核和基底前腦等重要腦區(qū)的發(fā)育原基［20］。GE 區(qū)神經(jīng)干（祖） 細胞分化為大量的GABA 能神經(jīng)元， 分布于皮層區(qū)和紋狀體等端腦亞區(qū)［21-23］。因此， 皮層區(qū)的抑制性GABA 能中間神經(jīng)元也來源于GE 區(qū)，并在分化發(fā)育過程中逐漸遷移至皮層區(qū)［24］。皮層區(qū)原位的神經(jīng)干（祖） 細胞主要發(fā)育為皮層區(qū)的興奮性神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示：相同的原代培養(yǎng)時間，與皮層區(qū)比較，GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達水平明顯降低，vGAT 和Gephyrin 蛋白表達水平明顯升高，可能與不同腦區(qū)可作為不同類型神經(jīng)元的發(fā)育原基有關(guān)。

突觸前后相關(guān)分子的先后發(fā)育可能反映了發(fā)育過程中突觸前對突觸后的發(fā)育引導。在突觸發(fā)育過程中，突觸前成分與突觸后成分之間被證實存在相互作用， 且突觸前成分對突觸后成分具有引導作用［25］。當突觸前神經(jīng)元釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸后，可以通過 P38 和 Jun 等信號分子，誘導突觸后神經(jīng)元，上調(diào)與谷氨酸相對應的離子型受體在細胞膜上的表達， 如興奮性受體 N-甲基-D 天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA） 受體GluN1 亞基的表達。本研究結(jié)果顯示：相同原代培養(yǎng)時間，突觸前成分相關(guān)蛋白表達較突觸后成分相關(guān)蛋白表達更明顯，與突觸發(fā)育過程中突觸前對突觸后的引導作用一致。

綜上所述，皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的突觸發(fā)育具有明顯的差異性，皮層區(qū)興奮性突觸發(fā)育較早，GE 區(qū)抑制性突觸發(fā)育較早。突觸的腦區(qū)特異性發(fā)育提示不同細胞類型的神經(jīng)疾病可能具有不同的發(fā)育來源，需在實驗中加以甄別。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙艷和盧廣泉參與文獻檢索、實驗設(shè)計及論文撰寫，趙艷、杜金樂、潘雨綺和董子意參與數(shù)據(jù)收集及分析，康鑫和高弋婷參與論文結(jié)果分析及討論，高方和楊加周參與論文寫作指導及審校。

[參考文獻]

［1］ DU X C， LI J S， LI M H， et al. Research progress onthe role of type I vesicular glutamate transporter（VGLUT1） in nervous system diseases［J］. Cell Biosci，2020， 10： 26.

［2］ COLEY A A， GAO W J. PSD95： a synaptic proteinimplicated in schizophrenia or autism？［J］. ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 2018， 82：187-194.

［3］ MCEACHERN E P， COLEY A A， YANG S S， et al.PSD-95 deficiency alters GABAergic inhibition in theprefrontal cortex［J］. Neuropharmacology， 2020， 179：108277.

［4］ COLEY A A， GAO W J. PSD-95 deficiency disruptsPFC-associated function and behavior duringneurodevelopment［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）： 9486.

［5］ ALONSO-MARTíNEZ C， RUBIO-TEVES M，PORRERO C， et al. Cerebellar and basal Ganglia inputsdefine three main nuclei in the mouse ventral motorthalamus［J］. Front Neuroanat， 2023， 17： 1242839.

［6］ BOLNEO E， CHAU P Y S， NOAKES P G， et al.Investigating the role of GABA in neural developmentand disease using mice lacking GAD67 or VGATgenes［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（14）： 7965.

［7］ OLAH S S， KAREEMO D J， BUCHTA W C， et al.Acute reorganization of postsynaptic GABAA receptorsreveals the functional impact of molecularnanoarchitecture at inhibitory synapses［J］. Cell Rep，2023， 42（11）： 113331.

［8］ JUNG H， KIM S， KO J， et al. Intracellular signalingmechanisms that shape postsynaptic GABAergicsynapses［J］. Curr Opin Neurobiol， 2023， 81： 102728.

［9］ HOFFMANN C， MILOVANOVIC D. Gephyrin： ascaffold that builds a phase at the inhibitorypostsynapses［J］. Cell Res， 2021， 31（3）： 245-246.

［10］GASPERONI J， DWORKIN S. Neural stem/progenitor cell （NSPC） extraction and culture ［J］.Methods Mol Biol， 2024， 2746： 109-120.

［11］ZHOU W H， YANG X Y， WANG H X， et al.Neuronal aerobic glycolysis exacerbates synapse loss inaging mice［J］. Exp Neurol， 2024， 371： 114590.

［12］SOUZA S D， ROSARIO CLAUDIO J， SIM J， et al.Interleukin-10 signaling in somatosensory neuronscontrols CCL2 release and inflammatory response［J］.Brain Behav Immun， 2024， 116： 193-202.

［13］GAZORPAK M， HUGENTOBLER K M， PAUL D，et al. Harnessing PROTAC technology to combat stresshormone receptor activation［J］. Nat Commun， 2023，14（1）： 8177.

［14］ALEJANDRA LLANES-CUESTA M， HOI V， HAR， et al. Redox protein thioredoxin mediates neuriteoutgrowth in primary cultured mouse cerebral corticalneurons［J］. Neuroscience， 2024， 537： 165-173.

［15］沈永梅， 常曉菡， 張倩文， 等. PM2.5暴露對原代皮層神經(jīng)元 COX-2 啟動子區(qū)甲基化水平的影響［J］. 毒理學雜志， 2022， 36（2）： 152-156， 162.

［16］石子璇， 饒 維， 姬廣輝， 等. Npas4 在小鼠原代神經(jīng)元體外氧糖剝奪/復氧損傷中的保護作用及其可能機制［J］. 中國病理生理雜志， 2021， 37（8）： 1409-1414.

［17］唐凡人， 余萍萍， 王 莉， 等. 白藜蘆醇預處理對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪/再復氧損傷后神經(jīng)元突起生長的影響［J］. 解剖學報， 2017， 48（1）： 1-6.

［18］KANG X， ZHANG Z P， SONG C G， et al. γ-secretaseinhibitor disturbs the morphological development ofdifferentiating neurons through affecting Notch/miR-342-5p［J］. Neurosci Lett， 2022， 778： 136603.

［19］HAMPEL H， MESULAM M M， CUELLO A C，et al. The cholinergic system in the pathophysiology andtreatment of Alzheimer’s disease［J］. Brain， 2018，141（7）： 1917-1933.

［20］STILES J， JERNIGAN T L. The basics of braindevelopment［J］. Neuropsychol Rev， 2010， 20（4）：327-348.

［21］KEPECS A， FISHELL G. Interneuron cell types are fitto function［J］. Nature， 2014， 505（7483）： 318-326.

［22］NERY S， FISHELL G， CORBIN J G. The caudalganglionic eminence is a source of distinct cortical andsubcortical cell populations［J］. Nat Neurosci， 2002，5（12）： 1279-1287.

［23］WICHTERLE H， TURNBULL D H， NERY S， et al.In utero fate mapping reveals distinct migratory pathwaysand fates of neurons born in the mammalian basalforebrain［J］. Development， 2001， 128（19）： 3759-3771.

［24］GROUP P I N， ASCOLI G A， ALONSONANCLARESL， et al. Petilla terminology：nomenclature of features of GABAergic interneurons ofthe cerebral cortex［J］. Nat Rev Neurosci， 2008， 9（7）：557-568.

［25］HAMMOND-WEINBERGER D R， WANG Y X，GLAVIS-BLOOM A， et al. Mechanism forneurotransmitter-receptor matching［J］. Proc Natl AcadSci U S A， 2020， 117（8）： 4368-4374.

[基金項目] 國家自然科學基金面上項目（82071529）